FENOMENOS DE TRANSPORTE

Fermentación de Aspergillus niger en quimiostato para la obtención de ácido

cítrico.

Resumen

En la presente investigación, se abordan temas como la producción de ácido cítrico por

medio de la fermentación del hongo Aspergillus niger en un cultivo continuo, así como las
descripciones de los fenómenos de transporte que conlleva éste proceso y también de las
propiedades del ácido cítrico y sus características. Por su sabor agradable, baja toxicidad y
otras propiedades fisicoquímicas, el ácido cítrico es uno de los principales aditivos
alimentarios, usado como conservador, antioxidante, acidulante y saborizante de alimentos,
además es ampliamente usado en medicamentos. Las aplicaciones del ácido cítrico en la
vida cotidiana son amplias y variadas. El propósito de la investigación es encontrar y
desarrollar todas las herramientas a nuestro alcance por medio de asignaturas; tales como:
fenómenos de transporte, balance de materia y bioprocesos, que complementará a los
conocimientos adquiridos o que se adquirirán hacia un ingeniero en Biotecnología.
Introducción

Los microorganismos producen una gran diversidad de sustancias orgánicas: Antibióticos,

aminoácidos, ácidos orgánicos, edulcorantes, enzimas, proteínas, polisacáridos,
antioxidantes, vitaminas y saborizantes. Estos son algunos ejemplos de la extensa variedad
de productos que sintetizan los microorganismos y que son utilizados por la industria
alimenticia y farmacéutica Dentro del grupo de ácidos orgánicos se encuentra el ácido
cítrico, éste es el ácido orgánico más utilizado en la industria de los productos alimenticios
y farmacéuticos [1].

Los procesos que se han utilizado para la producción microbiana de ácido cítrico son amplios,
pero para ésta investigación se limitará al uso de un cultivo continuo; donde, se introduce
continuamente medio fresco en el recipiente del reactor, eliminándose concomitantemente
un líquido de cultivo que contiene microorganismos a la misma velocidad (Veldkamp, 1976).
El cultivo continuo más comúnmente usado es un sistema de flujo de una sola etapa
denominado "quimiostato" (Fig. 1).
 Las propiedades únicas del cultivo continuo hacen posible el estudio de problemas
fisiológicos y ecológicos, que no se pueden abordar con ningún tipo de sistema de cultivo
cerrado [2].

Figura 1 (Izquierda). Esquema de

un biorreactor continuo de tanque
agitado. Por lo general, se controlan
las velocidades de flujo de
nutrimentos al reactor, el pH y la
temperatura. X indica el peso de
células secas, cS es la concentración
de sustrato y F es el flujo de
nutrimentos al reactor.

Características Fisicoquímicas del ácido cítrico.

El ácido cítrico (del latín citrus, limón) es un ácido orgánico tricarboxílico, su fórmula
molecular es C₆H₈O₇ y el peso molecular es de 192,124 g/mol. Es un ácido orgánico fuerte,
tal como lo indican sus constantes de disociación (kd₁=8.2x10ˉ⁴, kd₂=1.77x10ˉ⁵ y
kd₃=3.9x10ˉ⁶), su densidad es de 1.54 g/ml y se funde entre 135 y 152 °C (Ullman, 1964).
En la actualidad, la mayor parte del ácido cítrico se obtiene por vía de la fermentación
microbiana.

Marco teórico

El medio estéril fresco se bombea desde un depósito de medio al recipiente de cultivo del
que se extrae el líquido de cultivo a la misma velocidad (F). El volumen de cultivo (V) se
mantiene constante, y la tasa de dilución (D) se define como D = F / V (h-1). La clave del
modo de acción del quimiostato es la composición del medio en el reservorio. Todos los
componentes en este medio, aparte del sustrato limitante del crecimiento, están presentes
en exceso. La tasa de crecimiento específica () de un cultivo bacteriano se define como:

 = 1/x * dx/dt = d ln x/dt = ln2/td

Donde x es la concentración del organismo (mg de peso seco / ml) en el tiempo t, y td es el

tiempo requerido para que la concentración de organismos se duplique (tiempo de
duplicación) (Veldkamp, 1976).

Si bien la producción de ácido cítrico por fermentación con Aspergillus Niger ha sido un
proceso comercial desde 1923, aún existen muchos vacíos en el conocimiento y comprensión
de la fermentación. Las revisiones recientes indican que no se sabe con certeza qué rutas
bioquímicas están involucradas y aún no existe unanimidad con respecto a las condiciones
fisiológicas óptimas requeridas para obtener un alto rendimiento (Smith, 1977).
Las cepas de Aspergillus Niger varían considerablemente en su capacidad para producir
ácido cítrico y excretarlo en el medio de crecimiento a alta concentración. La cantidad de
ácido cítrico producido se puede aumentar por mutación inducida [2].

Aspergillus Niger puede crecer en cultivo líquido ya sea como micelio filamentoso suelto o
en una bolita dependiendo de las condiciones de crecimiento. La mayoría de los estudios
sobre la fermentación con ácido cítrico indican que los gránulos con una estructura suelta y
un diámetro que no excede 1 mm proporcionan la mejor forma de micelio para producir
altos rendimientos de ácido cítrico. La formación de pellets está influenciada por muchos
factores ambientales; El pH, la aireación y la agitación, y el tamaño del inóculo parecen ser
particularmente críticos en la producción de un inóculo adecuado para la fermentación del
ácido cítrico (Smith, 1977).

Hay cinco fases sucesivas en la fermentación. El período de germinación de las esporas es

seguido por una fase de crecimiento exponencial. El valor máximo de la tasa de crecimiento
específico en esta fase depende de la temperatura:  max = 0.13 h-1 at 26oC and 0.28 h-1
at 32 oC.

Después del crecimiento exponencial, hay un período de perturbación del crecimiento que
puede explicarse por la perturbación en el metabolismo de A. niger causada por el
agotamiento del amoníaco y el fosfato del medio. A esto le sigue el período de producción
de ácido cítrico, que continúa hasta que los carbohidratos disponibles se agotan, y luego
cesa. Un factor importante en la producción eficiente de ácido cítrico es la cantidad de
biomasa formada. Buenas cepas productoras de ácido cítrico de 10-15 g de peso seco de
micelio por litro de medio. A bajas concentraciones de micelio (hasta 4 g / L) la tasa de
formación de ácido cítrico es proporcional al nivel de biomasa:

 P/  t = X

Donde  P/  t es la tasa de producción de ácido cítrico (g / l / h); X es la concentración de

micelio (g / L); y  es una actividad metabólica de las células. Los cambios en la tasa de
producción de ácido cítrico por unidad de biomasa, con las diferentes concentraciones de
micelio resultaron de la inhibición de la síntesis de ácido cítrico por la disminución del nivel
de oxígeno disuelto en densidades de micelio altas (Smith, 1977).

Los factores que afectan la producción de ácido cítrico son:

pH: El ion de hidrógeno más favorable conc. Está entre 2.0 y 3.0. El bajo pH es óptimo para
la producción de ácido cítrico y minimiza la formación de ácidos orgánicos indeseables, como
el ácido glucónico y el ácido oxálico. También reduce el riesgo de contaminación por otros
organismos.

Temperatura: Se han propuesto temperaturas de 28-30 ° C para obtener altos rendimientos

y altas tasas de acumulación de ácido cítrico. A temperaturas más altas, el proceso de
fermentación es muy rápido y se produce un crecimiento micelial abundante que provoca la
oxidación de grandes cantidades de azúcares a CO₂, lo que reduce el rendimiento del ácido
cítrico.
Materiales y métodos.

Para el proceso de metodología se usará como referencia el artículo de Barry Cayford, Karen
Sutton, Michael Bramwell-King, Samer Chami [2], donde mencionan que se usó un medio
de cultivo que se muestra en la tabla 1.

TABLA 1
Composición del medio.
Sustrato 50 g/L

NH4NO3 0.8 g/L

MgSO4.7H2O 0.1 g/L

KH2PO4 0.5 g/L

(NH4)2SO4Fe(SO4)2.24 H2O 0.0001 g/L

ZnSO4.7 H2O 0.0001 g/L

Sustrato: Sacarosa

Método

1. ESTERILIZACIÓN Y ACONDICIONAMIENTO PREVIO DEL CULTIVO

Tiempo: _______

2. FERMENTACIÓN
Tiempo: Seis días aprox.
a) Introducir inóculo
b) Estar en continua agitación, aeración y controlando pH.
c) Al llegar a la última fase de desarrollo se detendrá ya que en ese punto se obtiene
mayor producción de ácido cítrico.

3. SEPARACIÓN DEL CALDO POST-FERMENTATIVO DEL ÁCIDO CÍTRICO

a) Separar el micelio compuesto por células lisadas de Aspergillus niger por filtración

b) Proceso cal – sulfúrico: mezclar caldo post-fermentativo con lechada de cal que dará
lugar a la formación de sal de calcio del ácido cítrico, el citrato cálcico formado se
obtendrá por precipitado mediante filtración

c) Se añade ácido sulfúrico que hará que el ácido cítrico quede libre y el residuo que
será sulfato cálcico también se filtrará.

4. PURIFICACIÓN

Una vez separado el ácido cítrico mediante la lechada, se purifica ya que el ácido
presenta gran cantidad de agua
a) Se realizará evaporación de doble efecto para retirar completamente el agua.

b) Mediante una cristalización en donde la solución llegará al punto de saturación y

obtener los cristales.

Para la venta se debe realizar otra centrifugación para retirar el agua restante y además
será llevado a un secado. (Rivada Núñez, 2008)
DIAGRAMA

PRODUCCIÓN _____ ENTRADA _____

SEPARACIÓN _____ SALIDA _____

PURIFICACIÓN _____
 Objetivo general

Analizar una situación industrial mediante el cálculo teórico de datos y su interpretación con
base en los fundamentos de los fenómenos de transporte de momento, masa y calor y de
balance de materia.

Referencias
[1]. Andueza, Felix 2019/02/01 “Estudio fisiológico de la producción de acido cítrico por el mutante
Fal A. 3. 0 de Asperqillus niger 11414 cultivado en un medio no convencional / Félix Andueza Leal”.
SERBIULA (sistema Librum 2.0)

[2]. Barry Cayford, Karen Sutton, Michael Bramwell-King, Samer Chami. (2015). IMPROVEMNET OF
CITRIC ACID PRODUCTION BY ASPERGILLUS NIGER IN A CONTINUOUS CULTURE. 31 Enero, de
Department of Biotechnology, Murdoch University. Sitio web:
http://sphinx.murdoch.edu.au/units/extern/BIO301/teach/download/previous%20years/Chemostat/c
hemostat%20reports/other/chemostat%20citric%20acid%202000.doc

Rivada Núñez, F. (2008). Planta industrial de ñproducción de ácido cítrico a prtir de melazas de
remolacha. 1st ed. [ebook] Universidad de Cádiz, pp.23-32. Available at:
https://rodin.uca.es/xmlui/bitstream/handle/10498/6411/34254675.pdf?sequence=1&isAllowed=y
[Accessed 27 Jan. 2019].