CARBOHIDRATOS: Determinacin de glucosa en sangre 1. Objetivos: 1. Conocer la tcnica mediante la cual se determina la glucosa en sangre 2.

Diferenciar pacientes con hipo e hiperglicemia 2. Fundamento terico: La glucosa es la principal fuente de energa de las clulas en el organismo. La glucosa es un monosacrido con una concentracin postpandrial de 90 mg/dl en la sangre y sirve como una fuente de energa indispensable para la funcin celular. El diagnstico de los trastornos del metabolismo de los hidratos de carbono se apoya en parte en la medicin de la glucosa plasmtica, ya sea en ayuna o tras estimulacin o pruebas de supresin. Los resultados de la glucosa plasmtica pueden clasificarse como hiperglucmicos (como la diabetes mellitus) o hipoglucmicos. Principio de la reaccin: La prueba utilizada se determina mediante el mtodo enzimtico colorimtrico, basado en la reaccin de Trinder. Glucosa + O2 + H2O GOD (glucosa oxidasa) cido glucnico + H2O2 2H2O2 + 4-aminoantipirina + fenol POD (peroxidasa) quinoneimina (rojo) + 4H2O La glucosa se determina despus de la oxidacin enzimtica en presencia de glucosa oxidasa. El perxido de hidrgeno formado reacciona bajo la catlisis de peroxidasa con fenol y 4aminoantipirina formando un complejo rojo violeta llamado quinoneimina. Punto final de una reaccin: Las reacciones catalizadas por enzimas son nicas en el sentido de que presentan aumentos muy grandes de la velocidad en relacin a las reacciones no catalizadas y muestran una cintica de saturacin, es decir la velocidad de la reaccin alcanza un valor mximo a una concentracin determinada de sustrato, no dan por resultado aumento de la velocidad de la reaccin. La medida se realiza siempre en las condiciones ptimas de pH, temperatura, presencia de cofactores, etc. En estas condiciones, la velocidad de reaccin observada es la velocidad mxima (Vmax). La velocidad puede determinarse bien midiendo la aparicin de los productos o la desaparicin de los reactivos. En el caso de la reaccin de la glucosa catalizada por la enzima glucosa oxidasa y la peroxidasa llega a su punto final cuando todo el sustrato (glucosa) se ha oxidado, y despus se mide el cambio de color. Espectofotmetro: La absorbancia y la transmitancia de una sustancia en disolucin se miden con un aparato denominado espectrofotmetro, el cual consta bsicamente de los siguientes componentes: Fuente de luz: Lmpara que emite una mezcla de longitudes de onda. Colimador: Conjunto de lentes que enfocan la luz convirtindola en un haz de rayos paralelos. Monocromador: Dispositivo que selecciona luz de una nica longitud de onda. Detector fotoelctrico: Transductor de luz en electricidad. La luz provoca el desplazamiento de electrones en el metal del detector, produciendo una corriente elctrica que es proporcional a la intensidad de la luz recibida. Registrador: Mide la seal del detector, la compara y genera una medida en una escala determinada.

A) Esquema de un espectrofotmetro de un solo haz B) Esquema de un espectrofotmetro de doble haz, en el cual se corrigen las variaciones espectrales de los diferentes elementos pticos que lo componen El funcionamiento del espectrofotmetro es el que sigue: la luz de una fuente continua pasa a travs de un monocromador, que selecciona una banda estrecha de longitudes de onda del haz incidente. Esta luz monocromtica atraviesa una muestra de espesor b, y se mide la potencia radiante de la luz que sale. Es necesario calibrar el espectrofotmetro con un blanco antes de medir las absorbancias de la disolucin problema. Esta celda o cubeta de referencia sirve para compensar los efectos de reflexin, dispersin o absorcin de luz de la celda con el disolvente. Cuando emerge poca luz de la muestra (absorbancia alta), la intensidad es difcil de medir. Cuando emerge mucha luz de la muestra (absorbancia baja), es difcil detectar la diferencia de absorbancia entre las celdas de muestra y de referencia. 3. Parte experimental: 3.1. Procedimiento: Ensayo: Longitud de onda: Hg 546 nm. Paso de luz: 1 cm Temperatura: 20-25C Medicin: frente a un blanco de reactivo. Se requiere un blanco de reactivo por serie Esquema de pipeteo: Microdeterminacin Pipetear en las cubetas Blanco de reactivo STD muestra STD muestra 5 ul Reactivo para glucosa 500 ul 500 ul Mezclar, incubar por 10 minutos de 20-25C 5 minutos a 37C. Medir la absorbancia del STD y las muestras frente a un blanco de reactivo antes de 60 minutos.

Materiales y reactivos: Materiales Espectrofotmetro

Reactivos Reactivo para glucosa

Tubos de ensayo Estndar de glucosa (100 mg/dl) Gradilla Muestras de suero sanguneo ( plasma) Pipetas automtica Puntas de plstico para pipetas automt.. Reloj Cubetas de plstico para espectrofot. Nota: El espectrofotmetro debe estar encendido 20 minutos antes de leer las absorbancias. 2. Clculo de la concentracin de la glucosa C (mg/dl)= 100 x A muestra A Estndar

Valores de referencia: 70 100 mg/dl TRABAJO EN CLASE: Realizar el anlisis de glucosa en un suero sanguneo y luego reportar los clculos en la carpeta con la respectiva interpretacin del resultado