Colorimetría (método químico)

La colorimetría es la ciencia que se encarga de la cuantificación del color, midiendo la

longitud de onda en la que puede ser percibido un color en específico al ojo humano;
para determinar a qué longitud de onda exacta se observa el color deseado se
necesita como referencia la curva espectral del color.
Las técnicas colorimétricas se basan en la medida de la absorción de
radiación en la zona visible por sustancias coloreadas. En principio todos los
sistemas que cuantifican el color a partir de tres variables poseen as-
pectos colorimétricos: Luminancia, Longitud y Pureza.

Qué características tiene la reacción Colorimetrica?

Una reacción colorimétrica es una técnica química en la que en una solución

acuosa un sustrato reacciona con un reactivo para generar un cambio de color
(producto). ... En general en todas las reacciones se colocan en tubos
separados una pequeña cantidad de los extractos.
Qué se usa en colorimetría y espectrofotometría para cuantificar el componente
de interés?
Para hacer este tipo de medidas se emplea un espectrofotómetro, en el que
se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa por una solución y
medir la cantidad de luz absorbida por la misma.
Qué es el metodo colorimétrico?

En física y química analítica, la colorimetría es una técnica "utilizada para

determinar la concentración de compuestos coloreados en solución". ... La
concentración de una muestra se puede calcular a partir de la intensidad de la
luz antes y después de que pase a través de la muestra mediante la ley de
Beer-Lambert
Un colorímetro Duboscq, 1870, que permitió la comparación visual de las absorciones en dos
columnas de fluidos mientras ajustaba sus profundidades.

Colorímetro para análisis de NO2, Laboratorio de Investigación de Nitrógeno Fijo, ca.1930

En física y química analítica, la colorimetría es una técnica "utilizada para

determinar la concentración de compuestos coloreados en solución".1
Un colorímetro es un dispositivo utilizado para probar la concentración de una
solución al medir su absorbancia de una longitud de onda específica de la luz
(no debe confundirse con el colorímetro triestímulo usado para medir los
colores en general).
Para usar el colorímetro, se deben hacer diferentes soluciones, incluido un
control o referencia de concentración conocida. Con un colorímetro visual, por
ejemplo, el colorímetro Duboscq, la longitud de la trayectoria de la luz a través
de las soluciones se puede variar mientras se compara la
luz filtrada transmitida a través de ellas para una coincidencia visual. La
longitud de la trayectoria del tiempo de concentración se considera igual
cuando los colores coinciden, por lo que la concentración de lo desconocido
puede determinarse por proporciones simples.2 Los tubos de Nessler funcionan
sobre el mismo principio.
También hay colorímetros electrónicos automatizados; antes de utilizar estas
máquinas, deben calibrarse con una cubeta que contenga la solución de
 control. La concentración de una muestra se puede calcular a partir de la
intensidad de la luz antes y después de que pase a través de la muestra
mediante la ley de Beer-Lambert. Los analizadores fotoeléctricos llegaron a
dominar en los años sesenta.
El color o la longitud de onda del filtro elegido para el colorímetro es
extremadamente importante, ya que la longitud de onda de la luz que se
transmite por el colorímetro tiene que ser la misma que la absorbida por la
sustancia que se mide. Por ejemplo, el filtro en un colorímetro puede
configurarse en rojo si el líquido es azul.

Índice

 1Colorímetro de absorción
 2Ensayos colorimétricos
 3Véase también
 4Referencias

Colorímetro de absorción[editar]
Un colorímetro es un dispositivo utilizado para probar la concentración de una
solución al medir su absorbancia de una longitud de onda específica de la luz.
Para usar este dispositivo, se deben hacer diferentes soluciones, y primero se
coloca un control (generalmente una mezcla de agua destilada y otra solución)
en una cubeta y se coloca dentro de un colorímetro para calibrar la máquina.
Solo después de que se haya calibrado el dispositivo, puede utilizarlo para
encontrar las densidades y/o concentraciones de las otras soluciones. Para
ello, repita la calibración, excepto con las cubetas llenas con las otras
soluciones. El filtro en un colorímetro debe configurarse en rojo si el líquido es
azul. El tamaño del filtro elegido inicialmente para el colorímetro es
extremadamente importante, ya que la longitud de onda de la luz que se
transmite por el colorímetro tiene que ser la misma que la absorbida por la
sustancia.

Ensayos colorimétricos[editar]
Los ensayos colorimétricos utilizan reactivos que experimentan un cambio de
color medible en presencia del analito. Son ampliamente utilizados en
bioquímica para probar la presencia de enzimas, compuestos específicos,
anticuerpos, hormonas y muchos más analitos. Por ejemplo,

 El para-nitrofenilfosfato se convierte en un producto amarillo por la

enzima fosfatasa alcalina.
 Coomassie Blue una vez que se une a las proteínas provoca un cambio de
espectro, lo que permite la dosificación cuantitativa. Un ensayo
colorimétrico similar, el ensayo de ácido bicinconínico, usa una reacción
química para determinar la concentración de proteína.
 Los inmunoensayos ligados a enzimas utilizan anticuerpos complejados con
enzimas para detectar antígenos. La unión del anticuerpo a menudo se
deduce del cambio de color de reactivos como TMB.
¿Qué es un metodo enzimatico Colorimetrico?
1997. Se evaluó un método enzimático colorimétrico para la cuantificación de colesterol
sérico, basado en la reacción de Trinder. La técnica consiste en mezclar 2,0 mL de
reactivo de trabajo previamente preparado, con 20 µ L de suero.

¿Qué es el metodo Hexoquinasa?

Método de la hexoquinasa: Es el método de referencia y consiste en dos reacciones
acopladas. En la primera reacción (reacción específica), catalizada por la enzima
glucosa oxidasa (GOD), se oxida la glucosa y se genera H2O2.

¿Qué es un metodo Cinetico y Colorimetrico?

El método cromogénico cinético se basa en la medida del color de la muestra de ensayo
a diferentes intervalos de tiempo después de añadido el reactivo de LAL que contiene la
sustancia colorida. Tiene como desventaja que no puede ser aplicado cuando hay otras
moléculas con color que pueden causar interferencias.

¿Qué metodo es el que se utiliza en la determinacion de la

tecnica de glucosa?
Para la medición de la glucosa se reportan tres tipos de métodos, los métodos de
oxidación-reducción, los de condensación y los enzimáticos. Los primeros aprovechan
las propiedades de la forma enedial de la glucosa, la cual al ser muy reactiva se oxida
fácilmente.

¿Qué es la determinacion de glucosa en sangre?

La prueba de glucosa en la sangre mide los niveles de glucosa en la sangre. La glucosa
es un tipo de azúcar. Es la principal fuente de energía del cuerpo. Una hormona llamada
insulina ayuda a que la glucosa pase del torrente sanguíneo a las células.

¿Qué es el reactivo de glucosa?

Reactivo líquido para la determinación fotométrica de Glucosa en suero o plasma y
otros fluidos biológicos. Para uso en el diagnóstico in Vitro. Apto para usar en
autoanalizador.

¿Cuál es la estabilidad de la glucosa?

Estabilidad: La glucosa en suero o plasma es estable 3 días a 2-8ºC.

¿Cómo se cuantifica la glucosa?

¿Cómo mido la glucosa en la sangre? Luego de lavarse las manos, inserte la tira reactiva
en su medidor. Pinche el costado de la punta de su dedo para obtener una gota de
sangre. Toque y mantenga la punta de la tira reactiva en la gota de sangre, espere por los
resultados.

¿Cuál es el resultado normal de la glucosa?

Un nivel de glucosa sanguínea en ayunas por debajo de 100 miligramos por decilitro
(mg/dl) (5,6 milimoles por litro [mmol/l]) se considera normal. Un nivel de glucosa
sanguínea en ayunas entre 100 y 125 mg/dL (5,6 a 7,0 mmol/L ) se considera
prediabetes. Este resultado se denomina a veces glucosa en ayunas alterada.
 Evaluación de un método enzimático colorimétrico para la cuantificación de colesterol
sérico
 
Alicia Chaves-Chavarría*, Marianela Vargas-Umaña*, Karl Schosinsky-
Nevermann*, Manuel Jiménez-Díaz

Los métodos enzimáticos se utilizan para la determinación de diversos componentes

de los alimentos, como azúcar, ácido o alcohol. ... El formato de ensayo se basa en
una reacción enzimática que provoca un cambio de color. Mediante un instrumento
apropiado, el cambio de color se puede medir fácilmente 

Ensayos enzimáticos
Medición de alta precisión y especificidad de compuestos alimentarios
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Los métodos enzimáticos se utilizan para la determinación de diversos

componentes de los alimentos, como azúcar, ácido o alcohol. Estos métodos son
importantes a la hora de analizar, por ejemplo, vino, cerveza, zumos de fruta o
productos lácteos.
El formato de ensayo se basa en una reacción enzimática que provoca un cambio de
color. Mediante un instrumento apropiado, el cambio de color se puede medir
fácilmente. Un sistema completamente automático constituye una solución
especialmente práctica, como el compacto y portátil RIDA®CUBE SCAN. Para realizar
el análisis, basta con pipetear la muestra en el cartucho; el resto de los pasos se realizan
automáticamente. El resultado se puede leer en la pantalla en menos de 15 minutos.

Los ensayos enzimáticos se realizan en diversos tipos de alimentos y piensos, entre

otros, bebidas alcohólicas (cerveza, vino, licores), piensos, alimentos infantiles,
productos panificados, productos de pastelería, productos lácteos, alimentos dietéticos,
zumos de fruta, miel, productos cárnicos, farmacéuticos, alimentos preparados, aceite,
pescado y mariscos, refrescos, especias, vinagre y agua.

Resumen

Se evaluó un método enzimático colorimétrico para la cuantificación de colesterol sérico,

basado en la reacción de Trinder. La técnica consiste en mezclar 2,0 mL de reactivo de trabajo
previamente preparado, con 20 µ L de suero. La absorbancia es leída a 500 nm contra blanco
de reactivos después de 15 minutos de incubación a 37º C. El intervalo analítico es de 25 a
600mg/dL.
La comparación de los resultados con el método de colesterol total en suero por extracción dio
una regresión lineal de Y = -0,4223 + 0,8907(X), con un coeficiente de correlación (r) de 0,958 y
una desviación estándar sobre la línea de regresión (Sy/x) de 24 mg/dL. Con el método
Colesterol Fast Color se obtuvo una regresión lineal de Y = 19,5 + 1,02 (X), un coeficiente de
correlación (r) de 0,972 y una desviación estándar sobre la línea de regresión de 13 mg/dL.
Con el método Colestat la regresión lineal fue de Y = 25 + 1,000 (X) con un coeficiente de
correlación (r) de 0,983 y una desviación estándar sobre la línea de regresión lineal de 16
µg/dL.
 
Las precisiones día a día para muestras con valores de colesterol bajos, normales y altos
mostraron coeficientes de variación de 1,8; 1,9 y 1,5 por ciento y en un mismo día de 2,3; 3,3 y
2,4 por ciento respectivamente.
 
La hemoglobina y el ácido acetilsalicílico en concentraciones de 50 mg/dL no bilirrubina
produce una interferencia de 0,42 por ciento.
 
El reactivo de trabajo almacenado en botella ámbar es estable por al menos 3 semanas a 2- 8º
C. El reactivo es estable por lo menos un año si la solución concentrada de enzimas se
almacena en congelación a –70º o en forma liofilizada, y por al menos dos meses a + 4º C.
 
Las concentraciones óptimas incluyen 1,5 mmol/L de 4-aminofenazona, 0,5 g/L de Triton X-
100, 3 mmol/L de colato de sodio, 16 m mol/L de fenol, 1000 U/L de peroxidasa, 250 U/L de
colesterol oxidasa y 500 U/L de colesterol esterasa. (Rev. Cost. Cienc. Med. 1997, 18-1: 30-43)

Palabras clave

Key word index: serum cholesterol, serum lipids, coronary artery disease.
 

Introducción

El colesterol es un esterol encontrado en todos los tejidos animales. Participa en funciones

fisiológicas muy importantes como lo son la síntesis de ácidos biliares, de hormonas
esteroideas y de membranas celulares. En la sangre se transporta ligado a lipoproteíans, las
LDL (lipoproteínas de baja densidad) que lo transportan hacia los tejidos y las HDL
(lipoproteínas de alta densidad) que lo transportan de los tejidos hacia el hígado. El colesterol
sérico se asocia con aterosclerosis y riesgo aumentado de enfermedad cardiovascular. Se
consideran los valores entre 200 mg-dl y 240 mg/dl como valores de alto riesgo para población
adulta (1). Su cuantificación en suero es uno de los procedimientos analíticos más comunes en
el laboratorio clínico (2).
Allain et al. (3) describieron en 1974, un método enzimático basado en:
 

    
El cromógeno producido tiene una absorción máxima de 500 nm. Esta última reacción que
forma el complejo coloreado, conocida como la reacción de Trinder (4), es la base de la
mayoría de los juegos de reactivos encontrados en el mercado (5,6). Las técnicas enzimáticas
son métodos directos y pueden ser aplicados a sistemas automatizados fácilmente.
 
La mayoría de estos métodos vienen ya listos para usar, en juegos de reactivos suplidos por
casas comerciales y cuya técnica no es presentada en detalle.
 
Estas técnicas han desplazado, en la rutina, a la clásica reacción de Liebermann-Burchard, que
es la más usada dentro de las reacciones no enzimáticas para la cuantificación de colesterol
(7). Estos métodos son afectados por muchos factores, entre ellos la concentración de cada
uno de los reactivos, el solvente empleado al hacer la extracción de colesterol, la cantidad de
agua en la mezcla final de reacción y la temperatura. Por lo tanto las condiciones de reacción
deben ser estrictamente controladas (7).
 
El objetivo de este estudio es evaluar un método enzimático para la cuantificación de colesterol
sérico, que sea barato y sencillo de utilizar en los laboratorios nacionales. Tal método puede
adoptarse como procedimiento estándar para evaluar reactivos comerciales de fundamento
semejante que ingresan al mercado costarricense. Ello favorecerá la estandarización de
metodologías y la comparabilidad interlaboratorio de los resultados de colesterol.
 
Para esto se procedió a estudiar el efecto de diferentes reactivos reportados en la literatura y
en instructivos de casas comerciales, sobre el método de colesterol enzimático basado en la
reacción de Trinder.
 
 
Materiales y métodos

A.  Equipo

Las lecturas espectrofotométricas se realizaron en un espectrofotómetro Shimatzu modelo UV-

160 de doble haz.

B.  Reactivos

Todos los reactivos utilizados fueron obtenidos de Sigma Chemical Co, St. Louis MO.

Solución amortiguadora de fosfatos 100 mmoI/L, pH 7,0.

Solución concentrada de enzimas. Reactivo único que contiene colesterol esterasa

de Pseudomonas fluorescens (28 000 U/L, Sigma C-9281), colesterol oxidasa
de Pseudomonas fluorescens (14 000 U/L, Sigma C-7149) y peroxidasa de rábano (56 000 U/L,
Sigma P’8125) disueltas en amortiguador de fosfatos 100 mmol/L pH 7,0 conteniendo 15
mmol/L de fenol como preservante. Esta solución es estable por al menos dos meses en
refrigeración y por al menos un año en forma liofilizada.

Solución de hexacianoferrato de potasio II 6000 m mol/L.

Reactivo de 4-aminofenazona. En un frasco volumétrico de 1 litro disolver 1,378 g de colato de

sodio, 0,325 g de 4- aminofenazona, 0,5 g de Triton X-100 (isooctifenolpolietoxietanol) y 2,67
mL de hexacianoferrato de potasio II 6000 m mol/L, en amortiguador de fosfatos 100
mmol/LpH7,0. Aforar a 1000 mL con amortiguador de fosfatos 100 mmol/L pH 7,0 y mezclar.
Esta solución es estable por al menos un año a 2-8º C.

Solución concentrada de fenol 330 mmol/L.

Reactivo de trabajo. Para 1 litro de mezcla de reacción, el reactivo de trabajo se prepara

mezclando 937,5 mL de reactivo de 4-aminofenazona, 44,6mL de solución concentrada de
fenol 330 mmol/ K t 18 mL de la solución concentrada de enzimas. Estas cantidades se pueden
variar de acuerdo al número de muestras por analizar. Este reactivo es estable en refrigeración
y almacenado en botella ámbar por al menos 3 semanas.

Solución patrón de colesterol 200 mg/dL. Disolver 200 mg de coelsterol (Standard Reference
Material, U.S. Department of Commerce National Bureau of Standards, Washington, D.C.) en
50 mL de isopropanol. Aforar a 100 mL con isopropanol y mezclar. Este reactivo se mantiene
estable a 25º C por al menos 2 años, si se almacena en botella ámbar con tapa de rosca que
contenga sello de hule.
 

C.  Procedimiento

1.    Preincubar a 37º C 2,0 mL de reactivo de trabajo

2.    Añadir 20 µL de suero o patrón
3.    Incubar 15 minutos a 37º C
4.    Medir la absorbancia a 500 nm contra blanco de reactivos
 

D.  Cálculos

Colesterol total (mg/dL) = Am x P

                                             Ap

Am= absorbancia de la muestra

Ap = absorbancia del patrón
P = concentración del patrón (mg/dL)
 

E.  Optimización de la fórmula. Los estudios de optimización fueron llevados a cabo para

cada uno de los componentes del reactivo de trabajo a las concentraciones indicadas:
hexacianoferrato de potasio II (0, 4, 8, 16 y 24 umol/L), 4-aminofenazona (0,5 a 3,0 mmol/L),
colato de sodio (0, 5,10, 15, 20 y 30 mmol/L), triton X-100 (0,5 a 3,0 g/L), fenol (5 a 60 mmol/L),
colesterol esterasa (0, 25, 50, 200, 400 y 700 U/L). Para todas las pruebas se utilizó una
mezcla de sueros humanos con aproximadamente 500 mg/dL de colesterol.
 

F.  Estabilidad a 4º C del reactivo de trabajo: Durante cinco días consecutivos se

reconstituyeron 5 viales del reactivo de trabajo listo para usar, uno cada día. Se almacenaron a
4º C. El quinto día se analizaron conjuntamente los cinco viales. Seguidamente, los viales se
almacenaron nuevamente a 4º C y se analizaron de igual forna a los ocho y quince días
posteriores.
 

G.  Estabilidad de la solución concentrada de enzimas. Se almacenó a 4º C, en congelación

a –70º C y también se preparó en forma liofilizad.a Utilizando un ¨pool¨de sueros humanos, se
evaluó la estabilidad día promedio durante un mes y luego una vez almes durante un año.
 

H.  Efecto de componentes séricos: Se evaluó el posible efecto interferente de la bilirrubina,

de la hemoglobina, del ácido acetilsalicílico y del ácido ascórbico hasta concentraciones de 20,
500, 50 y 10 mg/dL respectivamente. Para ello se prepararon soluciones concentradas de cada
componente en una mezcla de sueros. Luego se mezclaron volúmenes adecuados de estas
soluciones concentradas con suero basal, para obtener las concentraciones deseadas.
 

I.  Linearidad: Se analizó el colesterol a patrones de una curva de calibración de 100, 200,
300, 400, 500 y 600 mg/dL.
 
J. Precisión: Se analizaron muestras de suero con 146, 249 y 403 mg/dL en un mismo día
veinte veces consecutivas y durante veinte días diferentes para obtener la desviación estándar
(DS) y el coeficiente de variación (CV) en un mismo día, y día a día.
 

K.  Estudios comparativos: Se efectuó el estudio comparativo entre un método de referencia

para colesterol total en suero por extracción (9) y el método en estudio. Se analizaron durante 5
días 40 muestras de suero humano con valores de colesterol de 136 a 482 mg/dL
aproximadamente. Para el estudio comparativo entre el método Colesterol Fast Color (8) y el
método en estudio, se analizaron 40 muestras de suero humano con valores de colesterol entre
50 y 521 mg/dL aproximadamente. Para el estudio comparativo entre el método Colestat (10) y
el método en estudio se analizaron 40muestras de suero humano con valores de colesterol
entre 76 y 323 mg/dL aproximadamente. En cada caso se calculó el coeficiente de correlación
(r), el error estándar del estimado (Sy/x) y la línea de mejor ajuste (y=a+bx).
 

Resultados

Optimización de la fórmula

Los siguientes componentes a las concentraciones indicadas produjeron estabilidad en la

absorbancia: 4-aminofenazona (0,5-3, 0mmol/L), tritón X-100 (0.5-3,0 g/L), colato de sodio (1-
20 mmol/L), mientras la hexacianoferrato de potasio II produce un aumento en la absorbancia
conforme aumenta la concentración. El fenol produjo una absorbancia máxima a 30 mmol/l
(fig.1) y la colesterol esterasa mostró una absorbancia estable a partir de 400 U/L (fig. 2).

La estabilidad de la solución concentrada de enzimas y del reactivo de trabajo es mayor con

amortiguador de fosfatos. Con Tris-HCI la reacción es aproximadamente 1,6 veces más
sensible. El tiempo para lograr la estabilidad del producto coloreado es dos veces mayor con
Tris-HCI que con amortiguador de fosfatos.

La fórmula final optimizada contiene colesterol esterasa (500 U/L), colesterol oxidasa (250 U/L),
peroxidasa (1000 U/L), colato de sodio (3,0 mmol/L), hexacianoferrato de potasio II (16
umol/LL), 4-aminofenazona (1,5 mmol/L), tritón X-100 (0,5 g/L), y fenol (15 mmol/L).
 

Espectro de absorción: El espectro de absorción de la solución patrón y las muestras de

suero, presenta un pico único de absorción a 500 nm.
 

Linealidad: El método presenta linealidad hasta 600 mg de colesterol por 100 mL de suero.
 

Efecto de los componentes séricos: Los valores de colesterol sérico observados al agregar

cantidades crecientes de ácido acetilsalicílico, bilirrubina, hemoglobina y ácido ascórbico a una
mezcla de sueros, se muestran en el cuadro 1.
 

Imprecisión: En el cuadro 2 se presentan los resultados del análisis de imprecisión en un

mismo día y día a día, para sueros conteniendo aproximadamente 146, 245 y 403 mg/dL de
colesterol.
 

Estudios comparativos: Los resultados del estudio comparativo entre el método en estudio y

el método de colesterol total en suero por extracción se muestran en la Figura 3. Las
Figuras 4 y 5 muestran los resultados de los estudios comparativos entre el método en estudio
y los métodos Colesterol Fast Color y Colestar respectivamente.
  
Discusión y conclusiones

La sensibilidad, la precisión y la simplicidad de las determinaciones enzimáticas de colesterol

hacen de estas una excelente alternativa para los análisis de rutina en los laboratorios clínicos
(11, 12). Además se adaptan fáxilmente a sistemas automatizados.
 
Según Deacon y Dawson (13), la máxima respuesta se produce cuando la concentración de 4-
AF es igual a la de peróxido de hidrógeno generado a partir del colesteorl, en presencia de un
exceso de fenol. Ellos utilizan 7,5 mmol/L de fenol y 0,5 mmol/L de 4-AF no produjo cambios en
la reacción en un intervalo de 0,5 a 3,0 mmol/L y se eligió arbitrariamente una concentración de
1,5 mmol/L.
 
En cuanto al fenol, se determinó que la absorbancia final de la reacción aumenta conforme se
eleva la concentración de éste hasta un máximo de 30 mmol/L. De 3 a 5 mmol/L el aumento en
la sensibilidad es leve. Posteriormente, más bien tiene el efecto contrario (figura 1). Se escogió
15 mmol/L como la concentración adecuada, ya que favorece la velocidad de la reacción pero
no es tan concentrado como para oxidar el reactivo de trabajo causando que disminuya su
estabilidad.
 
El colato de sodio es requerido por la colesterol esterasa para hidrolizar los ésteres de
colesterol (3), En el método en estudio, se encontró que entre 1 y 20 mmol/L disminuyen la
absorbancia. Se eligió utilizar 3 mmol/L de este en la mezcla de reacción. Contrariamente,
Allain et al (3) reportan que después de 5 mmol/L ya se da disminución en la sensibilidad y
Deacon y Dawson (14) describen que la concentración óptima de colato depende de la
concentración de Tritón X-100. Ellos establecen que la concentración óptima de colato es de 6
mmol/L y la de tritón X-100 es de 15 g/L. Sin embargo, esta concentración de tritón X-100 es
sumamente alta si se compara con 0,5 g/L que fue la concentración elegida en el método en
estudio. Se demostró que éste tiene el mismo efecto en la reacción, en un intervalo de 0,5 a 3,0
g/L. Cooper et al (14) y la casa Boehringer Mannheim GmbH Diagnóstica (15) reportan 3,0 g/L
y Allain et al (3) no utilizan este reactivo.
 
Al evaluar el efecto de diferentes concentraciones de colesterol esterasa, se obtuvo la máxima
absorbancia con concentraciones ³ 400 U/L (figura 2). Se eligió 500 U/L como la concentración
óptima para asegurar que se produce una reacción de orden cero. Por otra parte, Deacon y
Dawson (10) obtienen que los valores óptimos son de 160 U/L y la mayoría de las casas
comerciales establecen concentraciones ³ 400 U/L.
 
Cooper et al (16) y Wiebe et al (17) proponen que las esterasas pueden ser una de las causas
de las variaciones entre los resultados obtenidos por métodos enzimáticos y los obtenidos por
métodos de referencia. Se reportan variaciones entre 4 y 6% del contenido total de colesterol
(17).
 
Porntip et al (18), hacen un estudio comparativo de reactivos enzimáticos para cuantificación de
colesterol total, en los que se usa colesterol oxidasa aislada de Nocardia, Streptomyces y
Pseudomonas. Ellos reportan que la linealidad es más baja y el tiempo de reacciónes mayor,
usando reactivo preparado con colesterol oxidasa de Pseudomonas con respecto a aquellos
que provienen de Nocardia o Streptomyces. Además, el costo de la enzima obtenida de
Nocardia es mayor, seguida de la de Pseudomonas y de último la de Streptomyces. La
precisión y la correlación nos e ven afectadas por el tipo de enzima. Ellos concluyen que la
colesterol oxidasa de Streptomyces es la más recomendada.
 
El tiempo de estabilización de la reacción aumenta conforme se incrementa la concentración de
colesterol de la muestra. Para abarcar el intervalo de linealidad del método, se recomienda
incubar la mezcla de reacción 30 minutos a 25º C ó 15 minutos a 37º C. Estos tiempos son los
mismos que utiliza el método Colestat; sin embargo el método Colesterol Fast Color utiliza sólo
15 minutos a 25º C y 5 minutos a 37º C.
 
Pesce y Bodourian (19) reportan una interferencia negativa de la bilirrubina si las lecturas se
llevan a cabo contra blanco de muestra. Esto se debe a que la bilirrubina en suero absorbe a
 500 nm y contribuye a la absorbancia del suero antes de que la reacción haya empezado. Al
final de esta, la bilirrubina ha sido consumida y la absorbancia a 500 nm es debida solamente al
suero y al cromógeno. En el método en estudio se obtuvo el mismo efecto. Cada mg/dL de
bilirrubina produce una interferencia de 0,42% leído contra blanco de reactivos, y de –1,15% si
se lee contra blanco de muestra (Cuadro 1). Es decir, si una muestra contiene 200 mg/dL de
colesterol y 5 mg/dL de bilirrubina, el colesterol de la muestra aumentará 4,2 mg/dL. El ácido
acetilsalicílico no produce interferencia hasta 50 mg/dL. Nägele et al (20) utilizan el
hexacianoferrato de potasio II para minimizar la interferencia por bilirrubina. El ácido ascórbico
interfiere equimolecularmente disminuyendo los valores de colesterol total. Cada mg/dL de
hemoglobina produce una interferencia de 0,05 por ciento (Cuadro 1).
 
El método en estudio no se comparó con el método de Abell y Kendall, sino con el método de
colesterol total en suero por extracción (7), que correlaciona muy bien con el método de
referencia.
 
Además, se comparó con dos métodos enzimáticos comerciales muy utilizados en rutina en los
laboratorios clínicos.
 
Se obtuvo que la ecuación de regresión lineal para el estudio comparativo con el método de
colesterol total en suero por extracción es Y= 0,8907 (X) – 0,4223, r= 0,958 y Syx = 24 mg/dL
(Figura 3). De acuerdo con esta ecuación, se observa un error constante de 0,4223 mg/dL y un
error proporcional de 11%, lo cual indica que los valores obtenidos por el método en estudio
son menores a los obtenidos por el método de referencia. La desviación estándar sobre la línea
de regresión lineal Syx = 24 mg/dL, indica que el 95% de los datos se encontraron a ± 48mg/dL
alrededor de ésta línea. Por otra parte, para el estudio comparativo con el método Colesterol
Fast Color, se obtuvo que Y = 19,5 + 1,02 (X), r = 0,972 y Syx= 13 mg/dL (Figura 4) y con el
método Colestat se obtuvo Y = 25 + 1,000 (X), r= 0,983 y S = 16 mg/dL (Figura 5). Estos datos
indican que los valores obtenidos por el método en estudio son mayores a los obtenidos por
ambos métodos comerciales; sin embargo, son menores a los obtenidos por el método de
colesterol total en suero por extracción. Por lo tanto, aún cuando los métodos enzimáticos
tienden a presentar resultados menores que los métodos por extracción, en el presente estudio
el método evaluado presentó valores mayores a métodos comerciales con el mismo
fundamento. Si se usara como parámetro para evaluar métodos comerciales se disminuirían los
falsos negativos en las poblaciones de pacientes.
 
El Programa nacional de Educación en Colesterol de los Estados Unidos (21) estableció en
1987 que la imprecisión es aceptable si el coeficiente de variación es menor o igual a 5%. Este
valor debía ser reducido en un 0,5% anual hasta un 3% en 1992. El método propuesto presenta
una precisión adecuada, con coeficientes de variación no mayores de 3,3 por ciento para
concentraciones de colesterol total de 150 a 403 mg/dL (Cuadro 2).
 
En conclusión, el método evaluado presenta un desempeño analítico adecuado y bajo costo.
Por lo tanto se recomienda para ser usado en un Programa de Aseguramiento de la Calidad.
Además su utilización evitará el conflicto de elegir un método comercial para evaluar los
reactivos disponibles en el mercado.

Ensayos continuos
 Espectrofotométricos.
 Fluorimétricos.
 Calorimétricos.
 Quimioluminiscencia.
 Radiométricos.
 Cromatográficos
 Cómo se puede medir la actividad de una enzima?
  La actividad catalítica de un enzima se determina midiendo la
velocidad inicial de reacción, que es la pendiente de la curva de
progreso (curva de producto formado ó sustrato transformado frente al
tiempo) en el tiempo cero (Fig. 1).

 Cuáles son los métodos enzimáticos?

 Los métodos enzimáticos se utilizan para la determinación de diversos
componentes de los alimentos, como azúcar, ácido o alcohol. ... El
formato de ensayo se basa en una reacción enzimática que provoca un
cambio de color. Mediante un instrumento apropiado, el cambio de color
se puede medir fácilmente.

Qué elementos son necesarios para la medición de la actividad enzimática?

La velocidad de una reacción catalizada por un enzima puede medirse con
relativa facilidad, ya que en muchos casos no es necesario purificar o aislar
el enzima. La medida se realiza siempre en las condiciones óptimas de pH,
temperatura, presencia de cofactores, etc, y se utilizan concentraciones
saturantes de sustrato.

Qué son las pruebas enzimáticas?

Son exámenes para determinar la actividad específica de enzimas en el
cuerpo. Las enfermedades o defectos hereditarios pueden afectar el
funcionamiento de las enzimas. Algunas son afectadas por varios genes. Los
resultados de los exámenes se informan como un porcentaje de la
actividad enzimática normal

Cuáles son los factores que modifican la actividad de las enzimas?

Los factores fisicoquímicos que modifican la actividad de la enzima son
los siguientes:
 Concentración del sustrato.
 Concentración de la enzima.
 pH.
 Temperatura.
 Fuerza iónica.
 Inhibidores
 Qué es el metodo enzimático?



  1997. Se evaluó un método enzimático colorimétrico para la
cuantificación de colesterol sérico, basado en la reacción de Trinder. La
técnica consiste en mezclar 2,0 mL de reactivo de trabajo previamente
preparado, con 20 µ L de suero
 Cuál es el efecto de la temperatura en las enzimas?



 EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

En general, los aumentos de temperatura aceleran las reacciones

químicas: por cada 10ºC de incremento, la velocidad de reacción se
duplica. Las reacciones catalizadas por enzimas siguen esta ley general

Qué quiere decir que una enzima se ha saturado?

Una enzima está saturada cuando los sitios activos de todas las moléculas
están ocupados la mayoría del tiempo. A partir del punto de saturación la
reacción no puede acelerarse mediante adición de sustrato, sea cual sea la
cantidad añadida

Cuál es la función de las enzimas?

Las enzimas son proteínas complejas que producen un cambio químico
específico en todas las partes del cuerpo. Por ejemplo, pueden ayudar a
descomponer los alimentos que consumimos para que el cuerpo los pueda
usar. ... Las enzimas son necesarias para todas las funciones corporales

Qué factores influyen en la actividad de la catalasa?

Esta actividad depende en gran medida de las condiciones de la reacción, que
incluyen temperatura, pH, concentración de la enzima y concentración del
sustrato. temperaturas, la mayor parte de las enzimas muestra
poca actividad porque no hay suficiente cantidad de energía para que tenga
lugar la reacción catalizada.

Cuál es la función de las enzimas?

¿Cómo afecta la concentración de la enzima y el sustrato La actividad
enzimática?
Concentrtación de la enzima: aumentar la concentración de la
enzima acelerará la reacción, siempre que se disponga de sustrato al cual
unirse. ... Concentración del substrato: aumentar
la concentración de sustrato también aumenta la velocidad de reacción hasta
un cierto punto

Qué es el metodo de punto final?

MÉTODOS DE PUNTO FINAL En los métodos de punto final, se incuba la

disolución reaccionante con el espécimen y con el patrón de concentración
conocida, el tiempo necesario para que se complete la reacción o se alcance el
equilibrio

Qué utilidad médica nos proporciona la determinación de la concentración de

glucosa por un método enzimático colorimétrico?
El método colorimétrico resultó ser útil para cuantificar glucosa y consumo
de glucosa en adipocitos 3T3-L1. Este método, con apropiados ajustes,
podría ser la base de nuevos bioensayos destinados a evaluar la actividad
biológica y/o farmacológica de potenciales fármacos

Qué ventajas tiene un catalizador biológico como las enzimas?

Las enzimas son los catalizadores biológicos que facilitan las reacciones
químicas que tienen lugar en los seres vivos. Además, las enzimas se
diferencian de cualquier otro catalizador gracias a su alta especificidad tanto
en las reacciones que catalizan como en el sustrato involucrado en ellas

Qué pasa con las enzimas a bajas temperaturas?

Las enzimas pueden acelerar la velocidad de una reacción. ... A bajas
temperaturas, el aporte de calor usualmente aumenta la velocidad de una
reacción enzimática, porque los reactivos tienen mayor energía y pueden
alcanzar el nivel de la energía de activación con mayor facilidad

Qué efecto podría tener una fiebre alta y prolongada sobre el funcionamiento
de las enzimas?
¿qué efecto podría tener una fiebre prolongada sobre el funcionamiento
de las enzimas? ... Si bien produce indirectamente una respuesta enzimatica
más rápida, esto no es por la temperatura sino por la activación de células y
sustancias del sistema inmunológico para defenderse de la infección

Cuál es el efecto de la temperatura?

El aumento de la temperatura refleja un aumento de la energía cinética de las

moléculas lo cual favorece la colisión entre las moléculas de enzima y sustrato.
Mientras mayor sea la temperatura mayor es el número de choques y mayor la
velocidad de la reacción

Qué es un limpiador enzimático?

Los limpiadores enzimáticos son productos que combinan las enzimas con

detergentes de pH neutro, acelerando su efecto y alcanzando zonas de difícil
acceso. Existen detergentes enzimáticos con enzimas que actúan sobre
moléculas orgánicas en concreto, pudiendo diseñar soluciones para problemas
específicos.

Qué son los inhibidores enzimáticos tipos y ejemplos?

Un inhibidor enzimático es una molécula que se une a una enzima
ydisminuye su actividad. Esta unión puede ser reversible, la más común en el
caso de fármacos, o irreversible, que suele ser por xenobióticos de alta
capacidad tóxica como lo son muchos pesticidas y sustancias químicas de alta
reactividad

Qué son las enzimas ejemplo?

Las enzimas son moléculas orgánicas que actúan como catalizadores, es

decir, que aceleran las reacciones químicas sin consumirse ni pasar a formar
parte de los productos de esa reacción. Por lo general, son proteínas, aunque
también existe el ARN (ácido ribonucleico), que tiene actividad catalítica

Cómo influye los cationes en la actividad enzimática?

Activación enzimática.

Algunos cationes, como Mg2+ o Ca2+ desempeñan un papel

importante como activadores enzimáticos. También pueden
actuar como activadores diversas moléculas orgánicas, incluso el propio
sustrato. Este último es un caso muy interesante y frecuente

Qué es un metodo Cinetico en Bioquimica?

La cinética enzimática es el campo de la bioquímica que se encarga de la
medición cuantitativa de los índices de reacciones catalizadas por enzimas, y
del estudio sistemático de factores que afectan estos índices.

Qué es un metodo Cinetico y Colorimetrico?

El método cromogénico cinético se basa en la medida del color de la muestra
de ensayo a diferentes intervalos de tiempo después de añadido el reactivo de
LAL que contiene la sustancia colorida. ... Tiene como desventaja que no
puede ser aplicado cuando hay otras moléculas con color que pueden causar
interferencias.

Cuáles son las pruebas Cineticas?

 Se realizan observaciones, midiendo los cambios en la concentración del
sustrato, productos o subproductos con respecto al tiempo. El cambio en la
concentración con el tiempo se utiliza para determinar la velocidad de reacción

Cómo se puede medir la actividad de una enzima?

La actividad catalítica de un enzima se determina midiendo la velocidad inicial
de reacción, que es la pendiente de la curva de progreso (curva de producto
formado ó sustrato transformado frente al tiempo) en el tiempo cero (Fig. ... A
tiempos más largos, el progreso de la reacción se aparta de la linealidad.

Cuáles son los tipos de enzimas que existen?

En función de su acción catalítica específica, las enzimas se clasifican en
6 grandes grupos o clases:
1. Clase 1: OXIDORREDUCTASAS.
2. Clase 2: TRANSFERASAS.
3. Clase 3: HIDROLASAS.
4. Clase 4: LIASAS.
5. Clase 5: ISOMERASAS.
6. Clase 6: LIGASAS.

Cuáles son las tecnicas enzimáticas?

Las técnicas enzimáticas son métodos directos y pueden ser aplicados a
sistemas automatizados fácilmente. ... El objetivo de este estudio es evaluar un
método enzimático para la cuantificación de colesterol sérico, que sea barato
y sencillo de utilizar en los laboratorios nacionales.

Cuáles son los factores que afectan la actividad de las enzimas?

La actividad enzimática puede verse afectada por diversos factores, como
temperatura, pH y concentración. Las enzimas funcionan mejor dentro de
rangos de temperatura y de pH específicos, y bajo condiciones que no son las
óptimas una enzima puede perder su capacidad de unirse a un sustrato.

Qué son las enzimas y cómo se clasifican?

Las enzimas se clasifican en base a la reacción específica que catalizan.
Las enzimas se clasifican en base a la reacción específica que catalizan, de
la siguiente manera: Oxidorreductasas. Catalizan reacciones de óxido-
reducción, o sea, transferencia de electrones o de átomos de hidrógeno de un
sustrato a otro

Cuál es la accion de las enzimas?

La acción de las enzimas se caracteriza por la formación de un complejo que
representa el estado de transición. El sustrato se une a la enzima a través de
numerosas interacciones débiles como ser: puentes de hidrógeno,
electrostáticas, hidrófobas, etc, en un lugar específico llamado el centro activo

Qué es la biotecnologia enzimática?

La tecnología enzimática se presenta como alternativa biotecnológica para que
las industrias desarrollen productos de calidad homogénea, aprovechen
óptimamente sus materias primas, aceleren sus procesos de producción,
minimicen desperdicios y disminuyan el deterioro del medio ambiente.

Qué es la actividad enzimática?

La actividad enzimática es una medida de la cantidad de enzima activa
presente y del nivel de actividad de la misma, por lo que la medida de
la actividad es dependiente de las condiciones, que deben ser especificadas
cuando se dan valores de actividad.

Qué factores influyen en la velocidad de las reacciones enzimáticas?

La velocidad a la que las reacciones enzimáticas proceden depende de
varios factores, dentro de los que destacan el pH del medio de reacción, la
temperatura, la concentración de sustrato y de enzima, y el agua disponible en
el medio, entre los más importantes
Qué efecto tiene el pH sobre la actividad de las enzimas?

La mayoría de los enzimas son muy sensibles a los cambios de pH.

Desviaciones de pocas décimas por encima o por debajo del pH óptimo
pueden afectar drásticamente su actividad. Así, la pepsina gástrica tiene
un pH óptimo de 2, la ureasa lo tiene a pH 7 y la arginasa lo tiene a pH 10
(Figura de la izquierda).

Cómo se producen las enzimas?

Las enzimas se obtienen de microorganismos (bacterias, hongos o levaduras)
seleccionados por screening y, posteriormente, cultivados por fermentación (en
matraz o reactor). A partir de los caldos de cultivo se procede a la purificación
de la enzima que cataliza la reacción de interés

Cuáles son las enzimas más utilizadas en la biotecnología?

Aplicaciones de la biotecnología

INDUSTRIA ENZIMAS

Panificación Amilasa Proteasa Lipoxidasa Lactasa

Cervecería Amilasas Papaína Pepsina

Vinificación Pectinasas Glucosa-oxidasa

Bebidas no alcohólicas Pectinasas Glucosa-isomerasa Tannasa Glucosa-oxidasa

Qué tan rápido es la catálisis enzimática?

Para una reacción catalizada por una enzima, la velocidad es usualmente
expresada como la cantidad de producto producido por minuto. ... Las
enzimas son catalizadores biológicos. Los catalizadores aceleran la velocidad
de las reacciones rebajando la barrera de la energía de activación entre los
reactivos y los productos

Qué sucede con una enzima cuando la reacción que está catalizando se
termina?

Características de las reacciones catalizadas por enzimas

Los catalizadores rebajan la energía de activación de las reacciones. La rebaja

de la energía de activación de una reacción, hace que la velocidad de
la reacción aumente. Asi, las enzimas aceleran las reacciones, rebajando la
energía de activación