PASOS PARA LA PURIFICACIN DE ENZIMAS

1. HOMOGENIZACIN
Consiste en la obtencin de un homogenato, que implica la destruccin de la clula y el pasaje de las enzimas a solucin o suspensin. Esto puede llevarse a cabo por:

Homogenizacin mecnica: puede utilizarse un homogeneizador de vidrio, mortero, licuadora, a veces con la ayuda de abrasivos como almina, arena o bolitas de vidrio y con un solvente adecuado, isotnico (sacarosa 0,25 M, NaCl 0,9%, KCl 0,15 M) o ligeramente hipertnico, en un buffer adecuado para controlar el pH.
Homogeneizacin snica: el choque de ondas snicas o ultrasnicas provoca cambios de presin de miles de atmsferas, que rompen la pared celular. Se usa generalmente para bacterias y levaduras y, a veces, para determinados tejidos animales (bazo, rin, eritrocitos).

Desintegracin trmica: El congelamiento y descongelamiento rpidos y repetidos suelen usarse para desintegrar bacterias y eritrocitos. Por congelacin se forman cristales de hielo intracelulares, destruyendo la estructura. Al descongelarse, las clulas se destruyen osmticamente debido a la presencia de agua pura y se libera su contenido. Desintegracin qumica: se utilizan agentes que atacan la pared celular, como el etanol, ter de petrleo, isopentanol, etc. Homogeneizacin por deshidratacin: se basa en la precipitacin de protenas por solventes orgnicos. En la preparacin del "polvo acetnico" se utiliza acetona en fro.

2. PURIFICACIN
A. Precipitacin con (NH4)2SO4 Se utiliza como floculante y, adems, como un reactivo en biologa molecular para precipitar protenas solubles. En bioqumica, se usa para precipitar fraccionadamente las globulinas que no son solubles en agua y para diferenciarlas de las albminas. Las globulinas se pueden redisolver para hacer subsecuentes anlisis, como puede ser la extraccin de una protena en particular por cromatografa de afinidad con NaCl. El sulfato de amonio es excelente componente para la llamada precipitacin fraccionada, porque, entre otras cosas, hace que el agua compita entre la disolucin de esta sal o de la protena (formada por muchos grupos carboxilo y amonio), causando que precipite la protena.

B. Cromatografa de columna DEAE Sephacel Las protenas tienen numerosos grupos funcionales que tienen cargas positivas y negativas. La cromatografa de intercambio inico separa las protenas de acuerdo a su carga neta, la cual depende la composicin de la fase mvil. Ajustando el pH o la concentracin de iones de la fase mvil, varias molculas de protena pueden ser separadas. Por ejemplo, si la protena tiene una carga positiva con un pH de 7, entonces puede unirse a una columna cargada negativamente, mientras que una protena con carga negativa no lo podra hacer. Tambin podra eliminarse cambiando el pH para que la carga neta de la protena sea negativa. El DEAE-sephacel es un intercambiador aninico, constituido por una matriz a la que est unido como grupo funcional un radical dietil-amino-etilo.

CH2 CH3 (CH2) NH CH2 CH3

C. Cromatografa de afinidad Concanavalin A

En sta tcnica una molcula denominada ligando (en analoga con los ligandos de los compuestos de coordinacin), que se une de manera especfica a los compuestos de inters, se liga de manera covalente a una matriz inerte y porosa. La gran ventaja de la cromatografa de afinidad es su capacidad de explotar las propiedades bioqumicas nicas de las protenas ms que las pequeas diferencias en sus propiedades fisicoqumicas, como ocurre con otros mtodos cromatogrficos.

D. Cromatografa con Hidroxiapatita

Aqu las protenas se adsorben por los geles de hidroxiapatita cristalina, una forma insoluble de fosfato de calcio con la frmula emprica Ca5(PO4)3OH. La separacin de las protenas se produce al eluir la columna con un gradiente del buffer de fosfatos(la presencia de otros aniones no tiene importancia). No se conoce con precisin la base fisicoqumica de ste procedimiento de fraccionamiento, pero parece involucrar la adsorcin de aniones a los sitios de Ca2+ y de los cationes a los sitios de PO43- de la hidroxiapatita cristalina.

D. Cromatografa Mono Q CH2 N+ (CH3)3