1 QUMICA ANALTICA CLNICA

QUMICA ANALTICA CLNICA

TEORA

Licenciatura de Qumica 10/11/2011

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TEMA 1: Principios bsicos del laboratorio clnico 1- Unidades de medicin :

A finales del siglo XVIII aparece el sistema mtrico que se caracteriza porque introduce dos unidades que son el metro y el kilogramo. El metro se define como la millonsima parte de un cuadrante terrestre y el kilogramo se define como el peso de un decmetro cbico de agua. A finales del siglo XIX se renueva el sistema mtrico pasando a llamarse sistema CGS porque tena 3 unidades (cm, g y segundos). En 1904 se volvi a renovar llamndose sistema MKS (m, kg y segundos). Este ltimo sistema es la base de lo que conocemos como sistema internacional (SI). Las unidades del sistema internacional pasaron a ser 6 las unidades bsicas. A partir de 19970 se introduce una nueva medida para medir cantidades de sustancias que es el mol. A partir de estas siete unidades bsicas se obtienen el resto aplicando ecuaciones fsicas y qumicas. Se usan mltiplos y submltiplos para expresar cantidades mayores o menores a la unidad bsica. Hay ciertas excepciones como: En el tiempo normalmente se usa el da, hora, minutos en lugar del segundo. En el volumen normalmente se usa el litro con sus submltiplos en lugar del m 3. Para valores de concentracin usamos la molaridad (mol/l) si se conoce el peso molecular y g/l si no se conoce en lugar de mol/m3. El pH es el log[H+] y no se usa la unidad del SI que sera mol/m3.

Lo normal es que cualquier laboratorio trabaje con el sistema internacional pero muchas unidades no se emplea. Pero en libros y artculos si se emplea las unidades del sistema internacional. Una unidad muy usada es la unidad empleada para la actividad enzimtica, en el sistema internacional es el Katal que es la cantidad de enzima que cataliza la transformacin de un mol de substrato por segundo, sin embargo habitualmente se utiliza otra unidad alternativa llamada unidad internacional y se define como la cantidad de enzima que cataliza la transformacin de un mol por minuto.

2- Unidades de masa:
El primer requisito para un laboratorio es tener una balanza de calidad para preparar las disoluciones y hacer anlisis gravimtricos. Las balanzas ms habituales son las mecnicas y electrnicas/elctricas. Balanzas mecnicas: las ms usuales son de dos o 1 plato.

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o En la de dos platos: tiene dos platos unidos por una barra o fulco apoyada en su centro de gravedad, para ajustar el peso normalmente tienen un puente ajuste unido al fulco. o En la de un plato: tienen tres brazos puentes, en dos de ellos es donde se cuelgan las pesas y el tercero es para ajustar. El error de este tipo de balanzas es de 01 gramo, y el tiempo que se tarda en pesar es muy alto. Balanzas electrnicas: consisten en un plato situado sobre una bobina elctrica que al pesar se activa originando un campo magntico que empuja al plato a su posicin inicial. El requisito de estas balanzas es que deben ser aisladas del resto del instrumental para evitar cualquier tipo de vibracin, adems deben de estar completamente limpias. Hay diferentes categoras: o Granatarios: podemos pesar entre 1 y 01 mg o Analticas: podemos pesar hasta g.

3- Material de laboratorio:
La mayor parte del material de laboratorio puede ser de cristal o de plstico. El plstico es ms resistente pero el vidrio es mas inerte y transparente pero adems es mucho ms caro. La mayor parte de los laboratorios compran material de vidrio. Hay muchos tipos de vidrios pero el que se recomienda es el borosilicato que tiene muy pocos alcalinos y alcalinotrreos y sin metales de transicin adems de aguantar hasta temperaturas de 600C, por eso son idneos para introducirlos en estufas siempre que no sea material aforado o esmerilado. Las pipetas pueden ser graduadas o aforadas, tambin en laboratorios clnicos se usa micropipetas para volmenes comprendidos entre 1 y 500 l. Son muy exactos. Otro instrumental: termmetros, centrfugas y estufas; estas dos ltimas se utilizan para tratamiento de muestras como sangre y orina.

4- Agua de laboratorio:
Debe ser agua muy pura libre de metales y compuestos orgnicos. Existe un comit nacional de laboratorios clnicos que ha establecido que existen tres grados de pureza del agua: Tipo 1: Ms pura. Se debe utilizar para anlisis cuantitativos. Anlisis donde se emplea cromatografa y tcnicas espectroscpicas. Tipo 2: Para anlisis cualitativo. Pruebas de microbiologa. Tipo 3: Ms impura. Se utiliza para fabricar agua tipo 2 y 1. Se utiliza para el lavado del material.

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Tipo 1 y Tipo 2: Se debe utilizar rpidamente porque se contamina con el CO2 y microorganismos que hay en la atmsfera. Tipo 2 y Tipo 3: Se pueden conservar en envases de polietileno o cristal. Existen 5 procesos para obtener agua: G Filtracin: pasar agua por un tipo de filtros con 02 m. G Osmosis inversa: similar a la filtracin. Se somete agua a presin haciendo pasar agua por poliamidas aromticas o acetato de celulosa. De las dos formas consigo eliminar slidos disueltos y gran parte de compuestos orgnicos. El agua que se obtiene con estos dos procesos es de Tipo 3. G Destilacin: evaporar agua y condensarla eliminando muchos interferentes. G Cambio inico (desionizacin): consiste en pasar agua por una resina. Para eliminar cationes utilizamos una resina de cambio catinico, para eliminar aniones utilizamos una resina de cambio aninico. Con la destilacin y el cambio inico eliminamos toda la materia orgnica e inorgnica as como microbios. En ambos casos obtengo agua Tipo 2. G Adsorcin: al agua le quedan gases disueltos, as como sustancias de baja punto de ebullicin. Esos es posible eliminar con este proceso. Se pasa el agua por unas columnas que se encuentran rellenas de carbn activo o arcillas, As se obtienen aguas Tipo 1. El instrumento mide la conductividad del agua que est saliendo y tambin la resistividad. Para que el agua sea Tipo 1 la resistividad debe de ser superior a 10 megaohmios/cm. Si el agua no es muy pura la conductividad ser alta por lo que la resistividad ser baja. Agua con baja conductividad y alta resistividad Agua pura.

5- Seguridad en el laboratorio clnico:

Deben de existir normas de seguridad. Deben de tener duchas, campanas de gases, uso de batas y gafas, extintores. Dependiendo de la muestra se tiene que usar guantes y mascarillas. Llevar gorros para no contaminar las muestras con pelo. Debe de existir un manual de seguridad que explique los sistemas que hay que utilizar como las normas de personal. As mismo, hoy da se est imponiendo el sistema de identificacin de riesgos que son unas pegatinas o anuncios en el material para informar del riesgo que pueden tener el material. El rombo de color azul: riesgo de salud El rombo de color rojo: inflamabilidad El rombo de color amarillo: ms o menos reactivo o estable

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El rombo de color blanco: otros riesgos distintos especficos de cada sustancia.

Los rombos que tienen unos nmeros comprendidos entre 0-4: siendo 0 el de riesgo mnimo y 4 riesgo mximo. Dependiendo del tipo de compuesto debemos de cumplir algunas normas: A Inflamables voltiles: tienden a explotar con facilidad. Debende estar en fro, en el frigorfico. No podemos meter alimentos o cualquier otro tipo de sustancias. Hoy se trabaja bajo campanas de gases y para que la ebullicin sea homognea hay que utilizar bolas de vidrio. A Gases comprimidos: ejemplo: absorcin atmica (acetileno y aire); fotometra de llama (butano o propano) y ICP (argn). Debemos de tener diferentes balas de gases unidas a los instrumentos. Puede haber escapes de gases que provocan explosiones. A Corrosivos: son los cidos y las bases extremadamente fuertes. Hay que trabajar bajo campana. Cuando mezclamos cido fuerte y agua hay que aadir el cido sobre el agua. Cuando hay derrame de cidos fuertes neutralizamos con una base. Si se derrama una base fuerte nuetralizamos con cido actico. A Mercurio: es muy txico y no se puede enterrar como tal. Se hace reaccionar los residuos de mercurio con tioacetoamida formndose los sulfuros de mercurio que no son txicos y se pueden enterrar. A Virus: son difciles de controlar. Ejemplo: hepatitis. Estas muestras deben ir marcadas. A Radioactividad: se hace radioinmunoanlisis y para esos inmunoanlisis hay que utilizar sustancias radiactivas: I135 y I131. Estas sustancias hay que utilizarlas en dependencias especiales.

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TEMA 2: Tcnicas analticas ms frecuentes utilizadas en qumica clnica

Tcnicas espectromtricas Las tcnicas espectromtricas se basan en la interaccin de las radiaciones electromagnticas con la materia. Las principales tcnicas espectromtricas empleadas en la actualidad en los laboratorios de bioqumica clnica, son la espectrometra de absorcin molecular ultravioleta y en el visible, la fuorimetra, turbidimetra, nefelometra, Iuminometra y la espectrometra de absorcin y de emisin atmica.

1. Consideraciones generales
Los electrones en los tomos o las molculas pueden distribuirse en varios niveles de energa, aunque residen principalmente en los niveles ms bajos o estado fundamental. Cuando se suministra energa por medio de una radiacin electromagntica, los electrones pasan a estados excitados, lo que da lugar a un espectro de absorcin. Slo se absorbe la cantidad de energa exacta equivalente a la diferencia de nivel energtico, de acuerdo con las reglas de la mecnica cuntica. Cuando caen los electrones de un nivel superior a un nivel inferior se emite exactamente un cuanto de energa y se produce un espectro de emisin. Las radiaciones electromagnticas se consideran como un conjunto de corpsculos, los fotones, que llevan asociada una onda. Se denomina espectro electromagntico al conjunto de radiaciones electromagnticas y se ha dividido en varias regiones, de acuerdo con la longitud de onda: - Rayos X (1-100 nm) - Ultravioleta (100-390 nm) - Visible (390-800 nm) - Infrarrojo (800-100.000 nm) - Microondas (100000-1000000 nm) La relacin entre la energa de la radiacin y su frecuencia viene dada por la ecuacin:

E =hJ
donde E es la energa, J la frecuencia y h la constante de Planck. La frecuencia de la radiacin est relacionada con la longitud de onda de acuerdo con la ecuacin:

J=c/O

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Si se sustituye este valor en la ecuacin de la energa se obtiene:

E=hc/O

que demuestra que la energa de una radiacin electromagntica es inversamente proporcional a la longitud de onda. De forma que las radiaciones electromagnticas de menor longitud de onda (rayos X) son las de mayor contenido energtico. Los anlisis que emplean las radiaciones electromagnticas pueden ser de absorcin, emisin, transmisin y reflexin. Las principales radiaciones electromagnticas que se utilizan en los laboratorios clnicos son las ultravioleta y las visibles.

2. Espectrometra de absorcin molecular

La absorcin por las molculas biolgicas de radiaciones de las regiones ultravioleta y visible del espectro depende de la estructura electrnica de los tomos de carbono que las componen. Las regiones ultravioleta y visible del espectro electromagntico y sus tcnicas asociadas son las ms utilizadas en el trabajo analtico de rutina en los laboratorios de bioqumica clnica. El trmino luz se usa para la energa radiante con longitudes de onda visibles para el ojo humano y las longitudes de onda que las rodean.

2.1. Ley de Lambert-Beer

La absorcin de las radiaciones electromagnticas por las disoluciones se rige por la Ley de Lambert-Beer, que relaciona la intensidad de la luz incidente y la de la luz transmitida I, cuando un rayo de luz atraviesa la longitud l de un medio que absorbe: I = I0 e-k l donde k es un coeficiente de absorcin que depende de la naturaleza de las sustancias. Para disoluciones diluidas, la Ley de Lambert-Beer puede escribirse de la forma: I = I0 e-a c l donde a es el coeficiente de absorcin y c la concentracin de la disolucin. La relacin entre las intensidades de la luz transmitida y la de incidencia I 0 se denomina transmitancia y el logaritmo decimal de la transmitancia es la absorbancia. Puede escribirse: T = I / I0 A = -lg I / I0 = a c l

donde a es la absortividad, caracterstica de cada sustancia. Cuando la concentracin se expresa en mol/l, a se escribe con el smbolo H, sus unidades son l / mol cm y se denomina coeficiente de absorcin molar. La Ley de Lambert-Beer queda de la forma:

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A= Hcl

2.2. Componentes de un aparato de absorcin molecular

Los espectrmetros son los instrumentos que se utilizan para las medidas de absorcin de las radiaciones electromagnticas. Los principales componentes de un espectrmetro son (Fig. 2-1): 1. Fuente de luz. 2. Sistema de seleccin de longitud de onda 3. Dispositivo para la cubeta de espcimen 4. Detector de luz. 5. Dispositivo de lectura de la seal generada por el detector. Este tipo de espectrmetros se denominan de un solo haz. Las medidas espectromtricas con un solo haz presentan errores debidos a las fluctuaciones de la intensidad de la luz o a la inestabilidad de los sistemas de deteccin. Para solventar estos problemas se utilizan aparatos de doble haz. Los espectrmetros de doble haz (Fig. 2-2) dividen el rayo luminoso en dos haces, el que pasa por la cubeta de referencia (blanco) y el que asa por la cubeta del espcimen. La seal que incide sobre el detector es la diferencia (espcimen referencia). El rayo luminoso se divide por medio de un espejo giratorio, que hace incidir el mismo haz, alternativamente, por la cubeta con la referencia y por la cubeta con el espcimen. A continuacin se describen las principales caractersticas de los componentes de los espectrmetros.
Fuente de luz

La fuente de luz ms utilizada para las medidas en la regin visible del espectro (360-950 nm) es la lmpara de wolframio. Tambin, se utilizan lmparas de halgenos que proporcionan energa radiante de mayor intensidad y son ms duraderas. Para las medidas en la regin ultravioleta 220 a 360 nm, se utilizan las lmparas de descarga de hidrgeno o de deuterio.
Sistema de seleccin de longitud de onda

La longitud de onda requerida para las medidas puede aislarse por medio de un filtro o de un monocromador. Los filtros son los sistemas ms sencillos y estn formados por materiales que dejan de forma selectiva las longitudes de onda deseadas, absorbiendo el resto. En los monocromadores, la radiacin procedente de la lmpara se dispersa por un prisma o por una rejilla de difraccin en un espectro, a partir del cual se asla la longitud de onda deseada por medio de una rendija. Los sistemas de seleccin de longitud de onda se catalogan por su amplitud de banda o paso de banda, que es la anchura en nanmetros de la curva de transmitancia en el punto medio del pico (Fig.

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2-3). Los filtros de vidrio tienen amplitudes de banda del orden de 50 nm, mientras que .los filtros de interferencia poseen amplitudes de banda ms estrechas, de alrededor de 5 a 10 nm. Los prismas permiten el aislamiento de radiacin de amplitud de banda de 0.5 a 1.5 nm. Las rejillas de difraccin permiten aislar energa radiante de amplitud de banda entre 20 y 35 nm, las peores, basta 0.5 nm o menos las menores. Las buenas rejillas de difraccin son generalmente mejores sistemas de seleccin de longitud de onda que los prismas. Las rendijas de refraccin hacen la separacin porque el haz de luz se refleja sobre una superficie con un elevado nmero de surcos, producindose la separacin entre las distintas longitudes de onda.

Cubetas
Las cubetas son los recipientes donde se colocan las disoluciones para las medidas de absorbancia. Pueden ser cuadradas, redondas o rectangulares. Se construyen de vidrio, plstico o cuarzo, y suelen tener un paso de 1 cm. Las cubetas de vidrio son tiles para las medidas entre 310 Y 1000 nm. Para lecturas por debajo de 310 nm se precisan cubetas de cuarzo, debido a que el vidrio y el plstico absorben por debajo de esa longitud de onda.
Detectores de energa radiante

Los detectores de los espectrmetros convierten la luz que les llega en energa elctrica. Los detectores ms utilizados para medir la intensidad de la luz en las regiones ultravioleta son los fotodiodos y los tubos multiplicadores.
Dispositivos de lectura

La energa elctrica procedente del detector se presenta mediante diversos dispositivos de lectura. En la actualidad, la mayora de los espectrmetros estn controlados por ordenador. Poseen programas que permiten manipular las seales, realizar curvas de calibrado, almacenaras y transformar los datos.

Interferencias en las determinaciones espectromtricas

Las interferencias en las medidas espectromtricas son de dos tipos: las estticas y las cinticas. Las interferencias estticas se producen por sustancias presentes en el espcimen que no experimentan variacin durante la reaccin analtica. Los ejemplos ms tpicos de este tipo de interferencias en los laboratorios clnicos son la ictericia, la lipemia y la hemlisis. La correccin se realiza utilizando un blanco con el espcimen al que no se aade alguna de las sustancias necesarias para la reaccin. Otra forma de correccin utiliza la lectura a varias longitudes de onda.

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Las interferencias cinticas se originan a causa de sustancias presentes en el espcimen que reaccionan con algn componente de la mezcla de reaccin de forma que la importancia relativa de su contribucin depende del tiempo, as como de su concentracin. Cuando la sustancia reacciona con mayor rapidez que la que se analiza, su presencia puede corregirse con un anlisis cintico, mientras que si lo que interfiere reacciona a la misma velocidad que lo que se analiza, la correccin se hace realizando la determinacin con la sustancia que hay que analizar y sin ella, y la correccin es una simple sustraccin.

Lectura a varas longitudes de onda

Como se ha sealado en el apartado anterior, las interferencias estticas que se producen en algunas determinaciones pueden eliminarse por lectura a dos o ms longitudes de onda. En general, la determinacin de la concentracin de un compuesto en disolucin se realiza midiendo su absorbancia, si el compuesto absorbe, transformndolo en otro compuesto que absorba por medio de su reaccin con los reactivos adecuados o haciendo que forme parte de una reaccin en la que otra sustancia experimente un cambio de sus propiedades de absorcin de luz. La reaccin de produccin del compuesto que absorbe puede utilizar reactivos qumicos o sistemas enzimticos. en combinacin con reactivos qumicos. La medida de la concentracin de sustancias en disolucin por tcnicas espectromtricas de absorcin se realiza con dos tipos fundamentales de mtodos. los de punto final y los emticos o de medida de velocidad de reaccin. Alternativamente, la concentracin del espcimen puede obtenerse sin utilizar soluciones estndar de concentracin conocida, cuando se conozca el coeficiente de absorcin molar del compuesto del que se mide la absorbancia, utilizando la ley de Lambert-Beer.

c=A/Hl
En los mtodos cinticos o de medida de la velocidad de reaccin se determina la variacin de la absorbancia con el tiempo que se relaciona con la concentracin. Los mtodos emticos suelen ser mucho ms rpidos y menos sensibles a las interferencias externas, como la turbidez o el color del espcimen, que los mtodos de punto final.

3. Fluorimetra
Se denomina fluorescencia a la emisin de radiacin por los electrones excitados de compuestos que previamente han absorbido radiacin debido a que estos electrones vuelven a su estado fundamental. La energa de la radiacin emitida es menor y la Iongitud de onda, por tanto, mayor que la de la radiacin absorbida. La diferencia o aumento entre dos longitudes de onda se llama desviacin de Stokes y, de forma general, los mejores resultados de las medidas de fluorescencia se obtienen con

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compuestos que tienen grandes diferencias entre las Iongitudes de onda de excitacin y de emisin. El tiempo entre la absorcin de la radiacin electromagntica y la emisin de la fluorescencia es muy pequeo, del orden de 10-8 segundos. Un gran nmero de compuestos presentan el fenmeno de la fluorescencia, la mayora de los cuales son sustancias que tienen enlaces mltiples conjugados con electrones S deslocalizados. La fluorescencia se emite en todas las direcciones, puede cuantificarse y su medida es mucho ms sensible que la de la absorcin de la radiacin. Las medidas de fluorescencia se realizan con aparatos denominados fluorimetros (Fig. 2-4), que constan de los siguientes componentes: 1. Fuente de luz de excitacin 2. Filtro o monocromador primario 3. Cubeta con el espcimen 4. Filtro o monocromador secundario 5. Detector 6. Registro La luz procedente de la lmpara de excitacin se hace pasar por el filtro o monocromador primario que selecciona la longitud de onda adecuada que incide sobre la cubeta con el espcimen. Parte de la luz se absorbe y, como consecuencia del proceso de fluorescencia, se emite luz de mayor longitud de onda. Esta luz se hace pasar por el filtro o monocromador secundario colocado perpendicularmente al rimero a evitar interferencias de la luz de excitacin. Finalmente. la luz llega al detector, donde se transforma en energa elctrica. El retardo entre la absorcin de la radiacin electromagntica y la emisin de la fluorescencia se emplea en una clase de fluormetros denominados de resolucin de tiempo, que eliminan las interferencias y son, por tanto, ms sensibles. La fuente de energa radiante de los fluormetros (lmpara de excitacin) es, generalmente, una lmpara de descarga de mercurio o de xenn, capaz de producir energa suficiente para excitar los compuestos fluorescentes. Proporciona un espectro de energa radiante de elevada intensidad entre 250 y 800 nm. Los filtros o monocromadores utilizados para la seleccin de las Iongitudes de onda primaria y secundaria, son anlogos a los de los espectrmetros. Las cubetas pueden tener forma cilndrica o rectangular, en cuyo caso las cuatro caras deben ser traslucidas. Las principales aplicaciones de las medidas fluorimtricas en los laboratorios clnicos se realizan para la determinacin de catecolaminas, estrgenos y porfirinas en orina, y algunas enzimas en suero, orina o fluidos biolgicos.

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4. Bioluminiscencia y quimioluminiscencia
La luminiscencia es la emisin de luz como consecuencia de una reaccin qumica. La luminiscencia puede ser quimioluminiscencia cuando los electrones pasan a un estado excitado como consecuencia de una reaccin qumica y vuelven a su estado basal emitiendo luz, o bioluminiscencia cuando la emisin de luz surge como consecuencia de una reaccin catalizada por una enzima. La luminometra es la tcnica que mide la luminiscencia. Para la medida de la luminiscencia se requieren aparatos simples denominados luminmetros que constan de los siguientes componentes: 1. Cmara de mezcla/cubeta 2. Fotomultiplicador (detector) 3. Amplificador 4. Lector/registro La cmara de mezcla/cubeta debe mantenerse a temperatura constante, ya que estas reacciones son muy sensibles a la temperatura, particuIarmente las catalizadas por enzimas. Las principales aplicaciones de la luminometra son en los sistemas de deteccin de los inmunoanlisis con reactivos marcados, por ejemplo los enzimoinmunoanlisis que utilizan fosfatasa alcalina como enzima marcadora con deteccin por luminiscencia.

5. Turbidimetra y nefelometra
La turbidimetra mide la disminucin de la luz transmitida a travs de la solucin particulada, mientras que la nefelometra mide la luz dispersada a diversos ngulos por la suspensin particulada. En el primer caso, turbidimetra, tendr que medir a una longitud de onda a la cual me est asegurando que la muestra no sufre ningn tipo de absorcin, sino slo dispersin de la luz. Cuando un rayo de luz choca con una partcula en suspensin, parte de la luz se absorbe, parte se refleja y parte se dispersa. La dispersin de la luz por una partcula depende de su tamao, de su ndice de refraccin con relacin a la del lquido que la rodea y de la longitud de onda la luz. Cuando la longitud de onda de la luz es mucho mayor que el tamao de la partcula (d< 0.1 O), la luz se dispersa de forma simtrica alrededor de la partcula, con un mnimo de la intensidad de la dispersin a 90 del rayo incidente. Cuando la longitud de onda de la luz incidente es aproximadamente igual al tamao de las partculas (d=O) se dispersa ms luz hacia delante que hacia atrs. Finalmente, cuando la longitud de onda de la luz incidente es mucho menor que el tamao de la partcula (d>10 O), la mayora de la luz se dispersa hacia adelante.

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5.1. Aplicaciones de la turbidimetra y la nefelometra

La principal aplicacin actual de la turbidimetra y la nefelometra en los laboratorios de bioqumica clnica es para la determinacin de protenas especficas, utilizando mtodos inmunolgicos. El tamao de la mayora de las protenas solubles est comprendido entre 1 y 20 nm y el de los complejos antgeno-anticuerpo entre 50 y 100 nm. Los agregados que se forman tras la reaccin antgeno-anticuerpo tienen tamaos entre 300 y 1000 nm. Como se ha sealado antes, la cantidad de luz dispersada depende del tamao, de la cantidad y del ndice de refraccin de las especies dispersantes, por lo que un aumento de cualquiera de estas magnitudes produce una detectabilidad mayor. Para lograrlo se unen a los antgenos o a los anticuerpo s partculas de ltex con tamao entre 100 y 300 nm, de manera que los agregados que se forman tienen tamaos mayores. Este tipo de mtodos se denominan inmunoanlisis potenciados. Los principales problemas de la aplicacin de la nefelometra y la turbidimetra a los sistemas biolgicos es la presencia de molculas endgenas que dispersan la luz. Adems, los reactivos deben estar libres de polvo, ya que las partculas grandes producen una gran dispersin de luz. Es este fondo o dispersin blanco la que limita la sensibilidad de la nefelometra y la turbidimetra. Estos problemas se han solucionado con el diseo de instrumentos de gran sensibilidad y con la mejora de la calidad de los anticuerpos.

5.2. Instrumentacin para las medidas turbidimtricas y nefelomtricas

La turbidez puede medirse con un espectrmetro (se realizan medidas de absorbancia), de forma que la sensibilidad de la turbidimetra est principalmente limitada por la exactitud y sensibilidad del aparato, ya que este mtodo mide el descenso de una seal grande de luz transmitida. Puede utilizarse cualquier Iongitud de onda para la medida de la turbidez (siempre que no absorba el analito). Las ms empleadas son: 340 nm para la inmunoprecipitacin con bajas concentraciones de la sustancia que se mide; 500-700 nm para las pruebas que emplean partculas; y 800 nm para los anlisis con concentraciones elevadas de la sustancia que se mide. Los nefelmetros son semejantes a los fluormetros y su principal diferencia es que la longitud de onda de excitacin y de deteccin es la misma. Los nefelmetros estn compuestos por los siguientes componentes: l. Fuente de luz. 2. Filtro de seleccin de la longitud de onda de excitacin 3. Cubeta de espcimen 4. Filtro de seleccin de la longitud de onda de deteccin

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5. Detector 6. Registro. Los componentes pticos de los nefelmetros son semejantes a los de los espectrmetros. Los detectores se encuentran situados en algunos nefelmetros a 90 u otros ngulos comprendidos entre 10 y 90. Los aparatos para las medidas de dispersin de luz para la cuantificacin de las reacciones antgeno-anticuerpo deben detectar la presencia de exceso de antgeno. La eleccin entre turbidimetra y nefelometra depende de la aplicacin y de la instrumentacin de que se disponga. En general, las tcnicas turbidimtricas suelen utilizarse ara concentraciones elevadas de la sustancia que se mide, que dan lugar a grandes descensos de la luz transmitida, mientras que las tcnicas nefelomtricas suelen emplearse para concentraciones bajas de la sustancia que se mide, que dan lugar a poca turbidez. El lmite de deteccin de las pruebas nefelomtricas es de 1 mg/dl para las protenas sricas.

6. Espectrometria atmica
Los mtodos descritos anteriormente estn relacionados esencialmente con espectrometra molecular. Mientras que las molculas dan lugar a espectros de bandas, los tomos producen espectros de lnea claramente definidos. En general, y en contraste con la espectrometra molecular, las concentraciones de tomos no se miden directamente en disolucin, sino que los tomos deben volatilizarse en una llama o electrotrmicamente en un horno. En este estado los elementos emiten o absorben fcilmente radiacin monocromtica a la longitud de onda adecuada. Normalmente se usan nebulizadores (atomizadores) para dispersar las soluciones en la llama a travs de las cuales se pasa la luz. Alternativamente, el rayo de luz pasa en un horno a travs e una cavidad que contiene el material vaporizado. La emisin de luz se mide por espectrometra de emisin de llama la absorcin de luz por espectrometria de absorcin atmica. La energa emitida o absorbida es proporcional al nmero de tomos en el paso ptico.

6.1. Espectrometra de emisin atmica

La espectrometra de emisin atmica se ha denominado tambin fotometra de llama. Cuando se calienta con una llama una emulsin de un metal, los electrones absorben energa y pasan a estados excitados inestables. Los electrones regresan de forma espontnea a sus estados normales emitiendo energa en forma de luz. La Iongitud de onda de la luz emitida en la cada de los electrones es caracterstica de cada elemento. Los metales alcalinos y los alcalinotrreos son fcilmente excitables mediante una llama. La longitud de onda de la luz emitida en la cada de estos electrones a sus estados

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normales corresponde a la regin visible del espectro. As, el sodio produce luz amarilla (589 nm), el calcio rojo-amarillenta (622 nm), el litio roja (670 nm) y el potasio, violeta (166 nm) . En condiciones controladas, la intensidad de la luz emitida es directamente proporcional al nmero de tomos que la emiten y, en consecuencia, al nmero de tomos presentes en el espcimen. Los fotmetros de llama son aparatos para la medida de la intensidad de la luz emitida por tomos como el sodio y el potasio. Constan de los siguientes componentes (Fig. 2-5): 1. Atomizador

2. Suministrador de combustible 3. Quemador 4. Monocromador 5. Detector 6. Dispositivo de lectura Los atomizadores producen el paso de una corriente de aire sobre un tubo capilar que tiene el otro extremo dentro de la solucin del espcimen. Se forman gotitas de varios tamaos (por efecto Venturi) y las grandes se eliminan por un proceso de sedimentacin. Este paso se requieren pues las gotas ms grandes tienden a no permanecer en la llama. La llama debe ser muy estable su temperatura muy elevada. Se utilizan mezclas de gases como propano o butano y aire, o acetileno y aire. El quemador es la parte donde se evapora instantneamente el disolvente y el espcimen se convierte en un gas, que se distribuye de forma homognea por la llama.

6.2. Espectrometra de absorcin atmica

Los tomos en forma de vapor en su estado fundamental absorben luz de longitudes de onda muy estrechas, pasando a estados de onda excitados. El elemento que quiere medirse se vaporiza por medio de una llama o un mtodo electrotrmico (horno de grafito). La fuente de energa radiante son las lmparas de ctodo hueco, que estn construidas con el mismo elemento que quiere medirse. Cuando se excitan los tomos de la lmpara producen un vapor que emite un rayo de luz monocromtica de la misma Iongitud de onda que la que absorben los tomos de ese elemento. Los espectrmetros de absorcin atmica llevan tambin una lmpara suplementaria para corregir las interferencias de fondo. Los componentes de un espectrmetro de absorcin atmica son (Fig. 2-6): 1. Lmpara de ctodo hueco

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2. Nebulizador 3. Llama 4. Monocromador 5. Detector La luz procedente de la lmpara de ctodo hueco se hace pasar por la llama donde se encuentran los tomos del elemento que quiere medirse, nebulizados y en su estado fundamental. Parte de la radiacin se absorbe por los tomos del elemento, que pasan a un estado excitado. Durante este proceso, se pierde parte de la luz, de forma que el descenso de luz que llega al detector es directamente proporcional a la concentracin del elemento en el espcimen. Los quemadores electrotrmicos se emplean en la denominada absorcin atmica sin llama. El ms utilizado es el horno de grafito, que consiste en una cavidad de grafito con dos electrodos que proporcionan la corriente elctrica para el calentamiento. Por el interior de la cmara circula agua, para enfriarla rpidamente despus de la atomizacin. El espcimen (slido o lquido) se coloca en la cmara e inicialmente se produce un calentamiento de alrededor de 1500 C para eliminar el disolvente y destruir la matriz (calcinacin) y posteriormente, se aumenta la temperatura hasta alrededor de 3000 C para producir la atomizacin. Los lmites de deteccin son mucho ms bajos. La espectrometra de absorcin atmica se emplea para la medida de la concentracin de metales en los fluidos biolgicos. Los principales metales que se miden son: aluminio, arsnico, bario, cadmio, calcio, cobre, cromo, hierro, litio, magnesio, manganeso, mercurio, nquel, plata, platino, plomo, selenio.

7. Osmometria. Cromatografia. Electroforesis. Tcnicas electroouimicas

La osmometra es una tcnica que se utiliza para medir la concentracin de sustancias, en general, en las disoluciones. La cromatografa utiliza para la separacin la distribucin de las sustancias entre dos fases, una mvil y otra estacionaria, mientras que la electroforesis utiliza la diferente velocidad de migracin de las sustancias cargadas. Las tcnicas electroqumicas son tcnicas de medida basadas en procesos de oxidacin-reduccin.

7.1. Osmometria
Las propiedades coligativas de las disoluciones son las relacionadas con el nmero total de partculas de soluto por masa de disolvente. Las propiedades coligativas son la presin osmtica, la presin de vapor, el punto de congelacin y el punto de ebullicin.

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La osmometra es una tcnica que se utiliza para medir la concentracin de molculas e iones, en general, en una disolucin, no de determinados iones o melculas en particular. La osmolalidad de una disolucin es el nmero de moles de partculas por kilogramo de agua. La osmolalidad de una disolucin puede determinarse midiendo cualquier propiedad coligativa. Se utilizan el descenso del punto de congelacin y el descenso de la presin de vapor. El aumento de la osmolalidad de una disolucin produce un aumento de la presin osmtica y en el punto de ebullicin; un descenso del punto de congelacin, un descenso de la presin de vapor. Los osmmetros que emplean la medida del descenso del punto de congelacin constan de un bao de enfriamiento para congelar el espcimen y un dispositivo que mide la temperatura a la que se produce la congelacin. Cada mol de partculas disueltas por kilogramo, produce un descenso e 1,86 C de la temperatura de congelacin. De esta forma, la osmolalidad viene dada por la frmula:
Osmolalidad = disminucin del punto de congelacin / 1.86 C

El resultado que se obtiene en osmoles se multiplica por 1000 para dar miliosmoles, que es la unidad ms empleada.

7.2. Cromatografa
La cromatografa es una tcnica de separacin que se fundamenta en la distribucin de las sustancias en dos fases, una mvil y otra estacionaria. Puede clasificarse de acuerdo con: (1) la interaccin de las sustancias que se separan con la fase estacionaria: adsorcin, reparto, cambio de in, exclusin y afinidad. Con frecuencia, en algunos mtodos cromatogrficos de separacin coexisten dos o ms tipos de interacciones entre la fase mvil y la fase estacionaria; (2) en funcin del tipo de fase mvil se distingue entre Cromatografa de Gases y Cromatografa Lquida.

7.2.1. En funcin del tipo de interaccin entre analito y fase estacionaria 7.2.1.1. Cromatografa de adsorcin
La cromatografa de adsorcin fue el primer tipo de cromatografa utilizada. Esta tcnica retiene los solutos por adsorcin superficial en la que las principales interacciones entre las molculas y los adsorbentes son las electrostticas, los puentes de hidrgeno y las dispersivas. La forma ms general de cromatografia de adsorcin se realiza en una columna que se llena de adsorbente adecuado. Las sustancias que quieren separarse se colocan en la parte superior de la columna y al pasar por sta va siendo retenidas por el adsorbente. La elucin de las sustancias retenidas se realiza utilizando disolventes en los que sean solubles y que tambin interacten con el adsorbente. La cromatografa de adsorcin se utiliza muy poco en los laboratorios de qumica clnica. Despus de la separacin en las columnas se cuantifica por espectrometra o por fluorimetra.

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7.2.1.2. Cromatografa de reparto

La cromatografa de reparto consigue la separacin de sustancias tomando como base su diferente distribucin entre dos fases lquidas inmiscibles (solubilidad). Puede realizarse en papel, capa fina, o columna. El coeficiente de reparto (Rf) es un valor caracterstico de cada sustancia en cada sistema de separacin. La cromatografa en papel es una tcnica de reparte lquido-lquido en la que el agua retenida entre las fibras de celulosa acta como fase estacionaria (polar), mientras que la fase mvil (menos polar) es una mezcla de disolventes orgnicos y acuosos. La cromatografa en papel se ha utilizado en los laboratorios de qumica clnica para la separacin de aminocidos, azcares y otras sustancias de peso molecular bajo. Debido a sus tiempos de desarrollo largos, en la actualidad no se emplea. La cromatografa en capa fina es una tcnica de reparto lquido-lquido, en la que resultan muy importantes las interacciones por adsorcin. Utiliza como soportes gel de slice, celulosa, poliaminas, gel de xido de aluminio, etc. Los geles se extienden sobre una placa rgida de vidrio, plstico o aluminio, formando una capa fina cuyo espesor puede ajustarse a la conveniencia. La cromat. en capa fina es ms rpida y sensible que la cromat. en papel. Se utiliza para la separacin de lpidos, esteroides, aminocidos, azcares y en general, para la separacin de sustancias de peso molecular bajo.

7.2.1.3. Cromatografa de cambio inico

La cromat. de cambio inico separa las sust. tomando como base las interacciones electrostticas que se producen entre os grupos ionizables de los compuestos que quieren separarse, y los grupos cargados unidos a un soporte slido. Los cambiadores inicos son sustancias insolubles que cotienen grupos cargados con iones mviles de signo contrario, que neutralizan los grupos fijos. Estos iones mviles o contraiones pueden intercambiarse de manera reversible con otros iones de la misma carga. Los cambiadores pueden ser catinicos si intercambian iones del medio con carga positiva, o aninicos si intercambian iones negativos. Los grupos cargados de la matriz insoluble determinan el tipo y la fuerza del cambiador. Los grupos fenlicos, carboxlicos y sulfnicos se utilizan como cambiadores aninicos. Los grupos sulfnicos y amino cuaternarios son cambiadores fuertes, mientras que los otros grupos mencionados lo son dbiles. El mecanismo por el que se produce la separacin en la cromatografia de cambio de in es la unin reversible de los compuestos a los cambiadores que, de forma esquemtica, est explicado en la Figura 3-1. En primer lugar, se aade el espcimen sobre la columna que contiene el cambiador. Las sustancias quedan ms o menos retenidas, dependiendo de las interacciones de sus grupos ionizables con el cambiador. Las sustancias que han quedado unidas se separan pasando a travs de la columna

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un tampn o amortiguador en el que se modifica el pH, la fuerza inica o ambos, respecto del tampn en el que se aplic el espcimen. Finalmente, se regenera la columna pasando contraiones del cambiador, de forma que queda dispuesta para utilizarse de nuevo. La cromatografa de cambio de in se aplica en bioqumica para la separacin de aminocidos, pptidos, protenas, nucletidos y, en general, para todos los compuestos que tengan naturaleza inica. En el laboratorio clnico, adems de utilizarse en los analizadores de aminocidos, se usa para la separacin de hemoglobinas, isoenzimas, esteroides y otras sustancias cargadas de inters clnico.

7.2.1.4. Cromatografia de exclusin

La cromatografa de exclusin, antes denominada filtracin en geles, es una tcnica que separa las molculas en funcin de su tamao y de su forma. La fase estacionaria es un gel, polmero anhidro muy hidrfilo, que se hincha cuando se sumerge en agua o en soluciones electrolticas. Esta cromatografa se realiza en columna y la elucin o salida de las sustancias es independiente del eluyente, o fase mvil utilizada, de su pH y de su fuerza inica y, como se ha indicado antes, slo es funcin de la forma y del tamao de las sustancias y de los poros del gel. El mecanismo de separacin de la cromatografia de exclusin est representado en la Figura 3-2. El espcimen se aplica sobre el lecho del gel y al pasar a travs de la columna las molculas mayores que el dimetro mximo de los poros de los geles pasan por los espacios que dejan entre s los granos del gel y salen pronto, mientras que las molculas menores quedan retenidas en los granos de ste. Cuanto menores sean las molculas, ms tardan en salir de la red porosa y, por tanto, eluyen ms tarde. De esta forma en la cromatografa de exclusin la elucin se produce en orden decreciente de tamao molecular. La separacin de diferentes molculas de una mezcla en la cromatografa de exclusin viene dada por el espacio recorrido y la resolucin es, por tanto, funcin de la longitud de la columna y del tamao de las partculas del gel. El dimetro de la columna slo determina la cantidad de espcimen que puede aplicarse. La cromatografla de exclusin se aplica fundamentalmente a la separacin de sustancias de peso molecular elevado, como pptidos, proteinas, cidos nucleicos, polisacridos y otros compuestos de inters biolgico. En los laboratorios clnicos, la cromatografa de exclusin se usa para purificaciones en tcnicas hormonales.

7.2.1.5. Cromatografia de afinidad

La cromatografa de afinidad utiliza para la separacin interacciones biolgicas altamente especficas, como las interacciones enzima-sustrato antgeno-anticuerpo y hormona-receptor. La fase estacionaria se prepara inmovilizando el ligando sobre el soporte slido, bien directamente o empleando un brazo espaciador. Para realizar la cromatografla se aade la mezcla, que contiene la

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sustancia que se quiere separar, al ligando inmobilizado, generalmente contenido en una columna cromatogrfica. aunque tambin puede encontrarse en disolucin. El compuesto que se quiere separar se une al ligando y el resto de las sustancias se eliminan mediante lavado. La separacin o elucin de la sustancia que se quiere separar se consigue, alterando las condiciones experimentales por variacin del pH o de la fuerza inica, pasando un ligando distinto al anclado en la columna por el que tenga mayor afinidad la sustancia. La cromatografa de afinidad se emplea en los laboratorios de bioqumica clnica para la separacin de glicohemoglobina y catecolaminas.

7.2.2. En funcin del tipo de fase mvil 7.2.2.1. Cromatografia de gases

La cromatografia de gases es una tcnica de reparto lquido-gas, que se realiza en una columna rellena slido finamente dividido que acta como soporte. La fase estacionaria est formada por un lquido no voltil que impregna el soporte, y la fase mvil en un gas inerte que fluye por la columna a velocidad constante. La separacin por cromatografia de gases requiere que los solutos sean voltiles. Muchos compuestos de inters clnico no son voltiles, de forma que deben modificarse qumicamente por un proceso denornmaao derivatizacin. Se suele aumentar la volatilidad transformando los grupos funcionales polares (hidroxilo, amino, cetona) en grupos no polares (trimetilsilil, monoxima). El espcimen voltil se disuelve en un disolvente ,orgnico adecuado; los ms utilizados son la acetona, el hexano y el acetato de etilo. Se introduce el espcimen con una microjeringa en un bloque con una temperatura elevada. Se produce la evaporacin de los componentes de la mezcla que son arrastrados por el flujo del gas. Los productos voltiles se separan en la columna segn su reparto entre la fase lquida estacionaria y la fase gaseosa mvil. Los productos separados se detectan a la salida de la columna. Los principales detectores son los de conductividad trmica, los de ionizacin de llama (FID), los de fotoionizacin, los termoinicos selectivos, los de nitrogeno/fsforo (NPD) y los de captura electrnica. La seal generada se comunica a un registro que lleva acoplado un integrador para la medida del rea de los picos correspondientes a cada una e las sustancias separadas. Las principales aplicaciones de la cromatografia de gases en los laboratorios clnicos son la cuantificacin de cidos orgnicos en orina, la determinacin de frmacos en orina, la determinacin de monxido de carbono en sangre, etc. Los cromatgrafos de gases pueden acoplarse a espectmetros de masas, para combinar el poder de resolucin de la cromatografia de gases con la gran especificidad v sensibilidad de la espectrometra de masa. En los laboratorios clnicos, esta combinacin se usa principalmente para el anlisis de drogas en medicina del deporte (control antidoping).

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7.2.2.2. Cromatografa lquida de alta eficacia

La cromatografla en columna puede utilizar los cinco tipos de interaccin entre la fase mvil y la fase estacionaria que se han sealado previamente, aunque la ms utilizada es la cromatografa de reparto. La separacin en columna (se ha realizado hasta hace unos aos utilizando el flujo gravitatorio como fuerza impulsora de la fase mvil, lo que lleva tiempos de separacin largos. La construccin de sistemas impulsores de la fase mvil de presin elevada, as como la obtencin de rellenos de las columnas de gran eficacia de actuacin, ha permitido tiempos cortos de separacin y una gran selectividad. La cromatografla que emplea estos mtodos se denomina HPLC (high performance liquid chromatography: cromatografa lquida de alta eficacia). Un cromatgrafo de HPLC est originado por los siguientes componentes (Fig. 3-3): 1. Reservorio de fase mvil.

2. Bomba impulsara. 3. Inyector 4. Columna 5. Detector 6. Registro 7. Ordenador La bomba de los cromatgrafos lquidos puede actuar de modo isocrtico o de modo gradiente, En el modo isocrtico la composicin de la fase mvil permanece constante durante todo el proceso, mientras que en el modo gradiente, la composicin de la fase mvil va cambiando durante la cromatografia. Se utiliza un gran nmero de detectores diferentes a la salida de la columna. Los ms empleados son los espectrmetros visible y UV, y los fluormetros y detectores electroqumicos. En la cromatografia de reparto lquido-lquido, las superficies de un slido se recubren con un lquido (fase estacionaria) inmiscible con el lquido que constituye la fase mvil. La separacin se produce por la distribucin relativa o reparto de los componentes entre la fase mvil y la fase estacionaria. Las fases lquidas estacionarias son generalmente polares, mientras que las fases mviles son no polares. Los lquidos estacionarios ms usados son el agua y el etilenglicol, y las fases mviles ms tpicas, el hexano, el metanol y las mezclas hexano/isopropanol. Esta combinacin de fase estacionaria polar y fase mvil no polar se denomina cromatografa lquida en fase normal. Cuando la fase estacionaria es no polar, como un hidrocarburo, y se utilizan como fase mvil sistemas acuosos, la cromatografa se denomina en fase inversa.

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Las principales aplicaciones clnicas de esta cromatografa son la separacin de aminocidos de suero y orina, la cuantificacin de frmacos en suero y orina, la separacin de catecolaminas en fluidos biolgicos y la cuantificacin de glicohemoglobina.

7.3. Electroforesis
La electroforesis es el transporte de partculas cargadas en un campo elctrico. Es una tcnica de separacin, en la que las partculas cargadas se separan por su velocidad de migracin diferente al aplicar un campo elctrico. La electroforesis se utiliza para separar compuestos con carga meta, como aminocidos, pptidos, protenas, nucletidos y cidos nucleicos. La movilidad electrofortica de una molcula depende directamente del tamao de la molcula, del coeficiente de friccin, que a su vez depende directamente del tamao de la molcula, de su forma y de la viscosidad del medio. La migracin de las partculas es dependiente del pH del medio en que se encuentran, ya que su carga neta depende del pH. Se produce la separacin en distintas bandas. El tampn en la electroforesis ejerce dos funciones: por un lado, lleva la carga elctrica, y por otro, determina la carga neta de las molculas que se separan y, de esta forma, la direccin de la migracin electrofortica. La fuerza inica del tampn determina la anchura de la nube inica que rodea las molculas cargadas. Cuanto mayor es la fuerza inica, ms estrechas son las bandas de separacin. Sin embargo, la fuerza inica elevada produce un mayor calentamiento y la posible desnaturalizacin de las sustancias que van a separarse, de forma que hay que llegar a una solucin de compromiso. Aunque existen diversos tipos de electroforesis, en Q clnica distinguimos fundamentalmente entre tres de ellas:

7.3.1. Electroforesis de zona

Los principales soportes planos para electroforesis son el papel, las membranas de acetato de celulosa, los geles de agar, agarosa, almidn y poliacrilamida). El papel de filtro fue el primer soporte que se emple para la electroforesis de zona, pero en la actualidad ya no se emplea.
Electroforesis en acetato de celulosa

La muestra se aplica sobre el soporte electrofortico y a continuacin se adiciona un tampn y se aplica una corriente elctrica. Una vez separados los componentes, normalmente se tien las diferentes bandas con un colorante adecuado, la cuantificacin se puede realizar: (1) cortar las bandas teidas y eluir el colorante, el cual se mide espectrofotomtricamente; (2) densitomtricamente, que es ms frecuente.

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Las membranas de acetato de celulosa presentan, con relacin al papel, las ventajas de ser qumicamente ms homogneas y poder transparentarse, con lo que las sustancias que se separan pueden cuantificarse, una vez teidas o reveladas, por densitometra de transparencia. Las membranas de acetato de celulosa son muy elsticas cuando estn hmedas, y frgiles y quebradizas cuando estn secas. Las membranas de acetato de celulosa requieren una cantidad de espcimen mucho menor que el papel, del orden de 1 a 2 l. Las membranas de acetato de celulosa se utilizan mucho en los laboratorios clnicos por su fcil manipulacin y la rapidez de sus desarrollos electroforticos. Su aplicacin principal es para separar las protenas del suero, lo que se denomina un proteinograma. La electroforesis en acetato de celulosa separa las protenas del suero en cinco fracciones, que son la albmina y las globulinas. El Cuadro 3-1 muestra los porcentajes y las concentraciones de referencia de cada una de las fracciones, y en la Figura 3-4 se presenta un esquema de una separacin de las protenas del suero en tiras de acetato de celulosa, y la lectura densitomtrica correspondiente. La electroforesis en acetato de celulosa se ha aplicado tambin para la separacin de lipoprotenas e isoenzimas del suero.
Electroforesis en gel

Los geles de agarosa, almidn y poliacrilamida no son slo meros soportes que evitan la difusin, sino que, modificando las concentraciones de los componentes que forman el gel, pueden conseguirse diferentes porosidades y la separacin se produce adems de por diferencias de carga, por diferencias de tamao. El poro del gel puede variarse hasta el tamao adecuado modificando la concentracin de almidn. El principal problema de los geles de almidn proviene de su preparacin engorrosa. Los geles de poliacrilamida se forman por la polimerizacin del monmero acrilamida (CH2=CH-CONH2) y el comonmero de entrecruzamiento N,N'-metiln-bisacrilamida (CH2=CH-CO-NH-CH2NH-CO-CH=CH2). Variando las concentraciones del monmero y del comonmero de entrecruzamiento, se consiguen geles de poliacrilamida con un nivel amplio de tamao de poro, que puede ajustarse para optimizar la separacin de los componentes del espcimen. La electroforesis en gel se aplica en los laboratorios clnicos para la separacin de protenas, lipoprotenas e isoenzimas.

7.3.2. Enfoque isoelctrico

Se trata de una tcnica de separacin electrofortica que hace migrar a los compuestos anfotricos, como las protenas, en un medio con un gradiente estable de pH. Las molculas se mueven hasta la zona en la que el pH es igual a su punto isoelctrico. A este pH, la carga neta es cero y la molcula detiene su migracin. El gradiente de pH se crea por medio de unas sustancias denominadas anfolitos, que son cidos poliaminocarboxlicos con pesos moleculares comprendidos

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entre 300 y 1000 dalton. El enfoque isoelctrico puede realizarse en gel de poliacrilamida, gel de agarosa o membranas de acetato de celulosa. La tcnica de enfoque isoelctrico posee un gran poder de resolucin y se utiliza, fundamentalmente, con fines analticos.

7.3.3. Electroforesis capilar

La electroforesis capilar es una tcnica en la que la electroforesis de zona se realiza en capilares de 75 m de dimetro interno y de 25 cm de longitud. El capilar, relleno de disolucin tampn, se conecta a un detector en un extremo y a una fuente de corriente a travs de reservorios con un tampn. Las principales ventajas de los tubos de un dimetro tan pequeo son una mayor disipacin del calor, un menor volumen de espcimen y una menor anchura de las zonas de separacin. La gran disipacin de calor permite aplicar voltajes elevados, del orden de 5000 voltios, con los que se mejora la eficacia de la separacin y se reduce el tiempo de separacin. La electroforesis capilar se aplica en los laboratorios clnicos para la separacin de protenas en fluidos biolgicos, principalmente el suero.

8. Tcnicas electroqumlcas
Las tcnicas electroqumicas se basan en procesos de oxidacin-reduccin o redox, aquellos en los que se producen intercambIos de electrones. Entre las tcnicas electroqumicas utilizadas en los laboratorios clnicos se encuentran los mtodos potenciomtricos, los amperomtricos y los culombimtricos.

8.1. Mtodos potenciomtricos

Los mtodos potenciomtricos miden la actividad de los iones, que est relacionada con la concentracin por un factor, denominado coeficiente de actividad, a = fi c. Los coeficientes de actividad, cuyo valor es en todos los casos menor de 1, dependen de la fuerza inica de la solucin. Las diferencias de potencial se miden por medio de electrodos. Los ms utilizados en las actualidad son los electrodos selectivos de iones.
Electrodos metlicos

Los electrodos metlicos estn formados por un metal inmerso en una solucin que contiene sus iones. Cuando el metal es inestable en forma pura, se utiliza una amalgama del metal. Entre los electrodos metlicos se encuentra el electrodo de calomelanos, formado por mercurio, cubierto de cloruro mercurioso, en contacto con una disolucin electroltica que contiene cloruro. Este electrodo se utiliza como electrodo de referencia.

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Electrodos selectivos a los iones

Los principales tipos de electrodos selectivos a los iones son los electrodos de vidrio, de estado slido y los de cambio de in. Los electrodos de vidrio estn construidos con vidrios especiales permeables a diversos iones como H+, Na+, K+, Li+, Rb+, Cs+, Ag+, etc. Los electrodos de estado slido estn construidos con membranas formadas por cristales homogneos o membranas formadas por una sustancia activa embebida en una matriz inerte. Los cristales homogneos o la matriz inerte contienen una sal poco soluble del anin que quiere determinarse. Se han construido electrodos con cristales homogneos para la medida de F- (cristal de fluoruro de lantano), Cl- (cristal de cloruro de plata), Br- (cristal de bromuro de plata), etc. Los electrodos de cambio de in estn construidos con membranas que llevan incluido un transportador selectivo para un in disuelto en un disolvente inerte, donde tanto el transportador como el disolvente son insolubles en agua. En la actualidad, en los laboratorios clnicos se emplean electrodos selectivos a los iones para la determinacin de Na+, K+ y Cl-. Estos electrodos pueden formar parte de un analizador automtico para bioqumica clnica o estar incluidos en un sistema dedicado slo a las determinaciones inicas. Asimismo se emplea un electrodo selectivo de iones, modificado para la determinacin de la presin de C02 en sangre, denominado electrodo de Severinghaus. El electrodo de CO2 consta de un electrodo de vidrio de pH sumergido en una disolucin de bicarbonato de concentracin fija (5 mM), que encuentra separada del tefln permeable a las molculas de CO2. La membrana (nylon) permite que pasen a su travs molculas sin carga elctrica, como CO 2, e impide que lo hagan las molculas cargadas. Entre la disolucin y el vidrio sensible a los H+ del electrodo de medida se encuentra un espaciador de nylon o celofn. El electrolito contacta tambin con el electrodo de referencia de Ag/AgCl. El C02 disuelto en la sangre difunde desde el espcimen a travs de la membrana y produce un cambio de pH de la disolucin de bicarbonato, de acuerdo con los equilibrios:
H2O + CO2 l H2CO3 l H+ + HCO3-

Las variaciones de CO2 producen variaciones de H+ en la disolucin electroltica y, como consecuencia, la diferencia de potencial elctrico del electrodo es funcin de la P de CO2.

8.2. Mtodos amperomtricos

Los mtodos amperomtricos se basan en la media de la intensidad de corriente que pasa por una clula electroqumica cuando se aplica un potencial constante entre los electrodos. En los laboratorios clnicos la amperometra se utiliza para la medida de la presin de oxgeno mediante el denominado electrodo de Clark (figura 3-6). Este consta de una clula electroqumica con un ctodo de platino y un nodo de Ag/ClAg sumergido en una disolucin de cloruro potsico y tampn

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fosfato. Este conjunto se encuentra separado del espcimen por una membrana de polipropeno, permeable a las molculas de O2. El ctodo de platino tiene aplicada una corriente elctrica de polarizacin de -630 mV, que es el potencial del par O2/H2O. A este potencial especfico, slo se reducen las molculas de O2, lo que crea una corriente de electrones proporcional a la cantidad de molculas presentes, de acuerdo con la reaccin: O2 + H2O + 4e- l 4 OH O2 + 2H+ + 2e- l H2O Los electrones provienen del nodo de Ag/AgCl, de acuerdo con la reaccin: Ag l Ag+ + 1eCuando no hay oxigeno, la corriente entre los electrodos es cero, pero cuando hay oxgeno en el espcimen se produce la difusin a travs de la membrana y llega hasta el ctodo, donde se reduce y se forma OH-. Siempre que el pH de la disolucin interna permanezca constante, la corriente producida entre el ctodo de platino y el nodo de Ag/CIAg es proporcional a la presin de oxgeno del espcimen.

8.3. Mtodos culombimtricos

Los mtodos culombimtricos se basan en la medida de la carga, total necesaria para la oxidacin o reduccin de una especie. La principal aplicacin de los mtodos culombimtricos en los laboratorios clnicos ha sido la determinacin de cloruro en fluidos biolgicos. En la actualidad este mtodo se ha abandonado.

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TEMA 3: Tcnicas analticas ms frecuentes utilizadas en Qumica clnica (II) A) Tcnicas inmunoqumicas a. Conceptos generales b. Produccin de antisueros y anticuerpos monoclonales c. Tcnicas de aglutinacin d. Reacciones de inmunoprecipitacin