Manual Practicas Micalimentos

Prcticas de Microbiologa de Alimentos (1 ITA)
MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS (Guin de Prcticas)
1 INGENIERO TCNICO AGRCOLA INDUSTRIAS AGRARIAS Y ALIMENTARIAS

CURSO 2005-2006
MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS (PRCTICAS) Profesor: Cristina Solano Goi (Profesora Asociada) e-mail: cristina.solano@unavarra.es Tfno. Contacto: 948-168024 Direccin: Instituto de Agrobiotecnologa y Recursos Naturales. UPNA/CSIC
Objetivo
Se pretende conseguir que los alumnos conozcan: .- las buenas prcticas de trabajo en el laboratorio de Microbiologa .- aprender las tcnicas de preparacin de diferentes medios de cultivo - familiarizarse con las tcnicas empleadas en Microbiologa para el cultivo y la manipulacin de microorganismos en condiciones de esterilidad .- familiarizarse con el manejo del microscopio ptico para la visualizacin de microorganismos as como las tinciones ms habituales en el laboratorio de Microbiologa .- aprender otras tcnicas como las de transformacin bacteriana, infeccin de bacterias con bacterifagos, as como aprender a realizar un antibiograma .- determinar el grado de contaminacin microbiolgica de los alimentos. Ejemplo: contenido de grmenes por gramo de alimento a 30 C .- verificacin de las buenas prcticas de fabricacin (BFP). Ejemplo: recuento de indicadores en alimentos procesados (coliformes, enterobacterias, grmenes totales, etc.) .- determinacin de microorganismos testigos de falta de higiene. .- comprobacin de la salubridad de un alimento mediante la determinacin de la ausencia o presencia de grmenes patgenos o toxinas que provocaran riesgos al consumidor (Salmonella spp., Listeria monocytogenes, toxina estafiloccica, etc). .- descripcin de tcnicas sencillas para estudiar el papel de los microorganismos en la produccin de alimentos.
Metodologa
Lecciones prcticas en el laboratorio de Microbiologa (en grupos reducidos). Cada grupo realizar las prcticas a lo largo de cuatro semanas (3 das /semana; 2horas/da). La realizacin de las prcticas es obligatoria para aprobar la asignatura.
Prcticas de Microbiologa General

Prctica 1: Preparacin de medios de cultivo y siembra de bacterias en medios de cultivo. Esterilizacin. Con esta prctica se pretende aprender las tcnicas de preparacin de diferentes medios de cultivo, su esterilizacin y su almacenaje, as como la importancia de los diferentes medios de cultivo y su uso. Adems tambin se pretende que el alumno se familiarice con las tcnicas empleadas en Microbiologa para el cultivo y la manipulacin de microorganismos en condiciones de esterilidad. Prctica 2: Obtencin de cultivos puros. Con esta prctica se pretende estudiar las diferentes tcnicas de aislamiento de un microorganismo a partir de una poblacin mixta para obtener un cultivo puro. Prctica 3: Cultivo de bacterias anaerobias. El objetivo de esta prctica es conocer el fundamento y la tcnica ms comnmente empleada en el aislamiento de bacterias anaerobias. Prctica 4: Observacin de bacterias teidas. Tincin Simple y Tincin de Gram. Con esta prctica se pretende familiarizar al alumno con el manejo del microscopio ptico para la visualizacin de microorganismos. Se observarn preparaciones bacterianas bajo diferentes tcnicas de tincin que permitan establecer diferencias morfolgicas y estructurales entre y dentro de los microorganismos.
Prctica 5: Recuento del nmero de bacterias por mililitro de un cultivo lquido. El objetivo de esta prctica es dar a conocer al alumno otra de las tcnicas de obtencin de cultivo puros as como el aprendizaje para hacer diluciones y recuentos bacterianos.
Prctica 6: Antibiograma. El objetivo de esta prctica es estudiar qu son los antibiticos y cmo se realiza la valoracin de la actividad antimicrobiana de un compuesto qumico (antibitico) mediante la tcnica de Kirby-Bauer. Prctica 7: Efecto de las altas temperaturas sobre el crecimiento microbiano El objetivo de esta prctica consiste en estudiar el efecto y la resistencia de un cultivo bacteriano a altas temperaturas. Prctica 8: Transformacin bacteriana por resistencia a ampicilina. En esta prctica se hablar de los fenmenos de transformacin, conjugacin y transduccin y se realizar un ensayo de transformacin bacteriana por adquisicin de plsmidos resistentes al antibitico ampicilina.
Prctica 9: Aislamiento y caractersticas de un bacterifago (virus de bacterias) El objetivo de esta prctica consiste en visualizar la presencia de bacterifagos a travs de las consecuencias de su ciclo infeccioso sobre bacterias de Staphylococcus aureus. Prctica 10: Observacin de levaduras. El objetivo de esta prctica es el cultivo de diferentes levaduras y la posterior identificacin de las mismas de acuerdo a sus caractersticas morfolgicas a travs de su observacin al microscopio.
Prctica 11: Tincin de esporas. En esta prctica se estudiar el gnero Bacillus por su capacidad para la formacin de endosporas y se proceder a la realizacin de la correspondiente tincin diferencial para poder visualizar al microscopio dichas estructuras. Prctica 12: Tincin de cpsula. En esta prctica se estudiarn las cpsulas bacterianas y se proceder a una tincin diferencial para la visualizacin de la misma al microscopio.
Prcticas de Microbiologa de Alimentos

La gran versatilidad metablica de los microorganismos hace que los podamos encontrar prcticamente en cualquier entorno. Los alimentos son fcilmente colonizados (contaminados), ya sea de forma natural, en origen o durante el procesamiento y la manipulacin. La multiplicacin de los microorganismos en el alimento puede implicar desde una alteracin inapreciable hasta su deterioro completo y puede ser, en cualquier caso, una va de transmisin de enfermedades. Por el contrario, en otras ocasiones, la alteracin resulta beneficiosa debido a la adquisicin de nuevas propiedades fisicoqumicas de inters organolptico o de conservacin (que impidan la colonizacin por otros microorganismos). Las siguientes prcticas se centran en la deteccin de microorganismos en el propio alimento y adems se describen tcnicas sencillas para estudiar el papel de los microorganismos en la produccin de alimentos.
Prctica 13: Anlisis microbiolgico de alimentos frescos-cocinados. Investigar tanto la presencia de microorganismos patgenos que representan un riesgo para la salud del consumidor como la de aquellos que producen alteraciones en el alimento durante el periodo de conservacin. Para ello, se realizarn los siguientes ensayos tras haber preparado convenientemente la muestra:
Preparacin de la muestra: Tomar la muestra en condiciones aspticas. Para ello se pueden emplear cubiertos y botes previamente esterilizados. Si transcurre un tiempo entre la toma de muestra y el anlisis, se mantendr la muestra en refrigeracin. Homogeneizacin del alimento. Emplearemos un homogeneizador comercial de paletas para que la distribucin de los microorganismos en el medio sea homognea. Se pesan 10g del alimento en una bolsa de plstico estril (especial para el homogeneizador) y se aaden 90 ml de caldo de peptona estril. El triturado de la muestra se realiza al menos durante 2 minutos, aunque el tiempo depende de la consistencia del alimento.
Realizar una serie de diluciones decimales seriadas: en tubos con 9 ml de caldo de peptona. En funcin de la carga microbiana esperada en el alimento se realizan las diluciones que se crean convenientes. NOTA: Al aadir 90 ml de caldo de peptona a los 10 g de muestra, se est realizando la primera dilucin decimal (los 10g de la muestra van a implicar aproximadamente 10 ml de volumen).
13-A
INVESTIGACIN DE MICROORGANISMOS INDICADORES Recuento de microorganismos mesfilos totales Recuento de enterobacterias en placa Recuento de mohos y levaduras
13-B
DETERMINACIN HIGIENE
DE
INDICADORES
DE
FALTA
DE
Recuento de coliformes totales en placa Investigacin de Escherichia coli Presencia/Ausencia Recuento de Staphylococcus coagulasa positivos 13-C INVESTIGACIN DE PATGENOS Presencia de Salmonella Presencia de Listeria monocytogenes
Prctica 14: Recuento de formas vegetativas y esporuladas El objetivo de esta prctica consiste en determinar la presencia de esporas en un alimento y confirmar su resistencia a las altas temperaturas.
14-A 14-B
RECUENTO DE FORMAS VEGETATIVAS RECUENTO DE FORMAS ESPORULADAS AEROBIAS Y ANAEROBIAS
Prctica 15: Anlisis microbiolgico de la contaminacin ambiental y de manipuladores de alimentos Determinar el grado de contaminacin ambiental y del propio manipulador para estudiar la influencia en el nmero y tipo de microorganismos que luego pueden desarrollarse en un alimento.
15-A 15-B 15-C
ANLISIS DEL AIRE ANLISIS DE SUPERFICIES ANLISIS DE MANIPULADORES
Prctica 16: Utilizacin de los microorganismos en la industria alimentaria Descripcin de dos tcnicas sencillas para estudiar el papel de los microorganismos en la produccin de alimentos. 16-A 16-B PREPARACIN DE YOGUR PREPARACIN DE CERVEZA
NORMAS GENERALES DE TRABAJO EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA Un laboratorio de Microbiologa es un lugar convenientemente habilitado donde se pueden manejar y examinar microorganismos. Este tipo de trabajo debe ser llevado a cabo con una buena tcnica asptica, y por tanto se requiere un ambiente limpio y ordenado y trabajar siempre en condiciones de esterilidad (en campanas de esterilidad biolgica o en la proximidad de la llama de un mechero de alcohol o de gas). Aunque los microorganismos que se manipulen no sean considerados patgenos, todos los cultivos de todos los microorganismos deben ser manejados con precaucin por su potencial patogenicidad. Es necesario cumplir dos REQUISITOS BSICOS: 1. Restringir la presencia de los microorganismos en estudio a sus recipientes y medios de cultivo para evitar el riesgo de contaminarse uno mismo o a un compaero. 2. Evitar que los microorganismos ambientales (presentes en piel, pelo, aire, ropa, etc.) contaminen nuestras muestras. Para mantener estas condiciones, es necesario respetar una serie de NORMAS DE SEGURIDAD: 1. Es imprescindible el uso de bata de laboratorio. 2. Al iniciar y finalizar las prcticas, el estudiante se lavar las manos con agua y jabn. 3. El lugar de trabajo debe estar siempre limpio y ordenado. Antes de comenzar cada prctica es conveniente desinfectar la superficie de trabajo. Los desinfectantes ms habituales para esto son la leja y el alcohol (etanol 96). 3. Los microorganismos deben manejarse siempre alrededor de la llama. Se deben evitar los desplazamientos innecesarios por el laboratorio, ya que pueden crear corrientes que originen contaminaciones o producir accidentes. 5. Durante las prcticas est prohibido comer, beber y fumar. Cuando se manipulan microorganismos hay que evitar llevarse las manos a la boca, nariz, ojos, etc.
6. Libros, carpetas, abrigos y cualquier otro material que no se utilice en la realizacin de la prctica deben estar apartados del lugar de trabajo. 7. Para deshacerse del material contaminado se utilizarn los recipientes adecuados, que sern esterilizados posteriormente. Nunca se debe tirar nada contaminado por la fregadera o a la basura comn. 8. Bajo ningn concepto debe sacarse ninguna muestra contaminada del laboratorio. 9. No se debe pipetear nunca con la boca. Utilizar siempre pipeteadores manuales. 10. En caso de accidente (ruptura de material, derramamiento de microorganismos, etc.) se comunicar inmediatamente al instructor.
CALENDARIO DE PRCTICAS 1a SEMANA 1er DIA- prctica 1 Qu es un medio de cultivo en microbiologa?. Preparacin de medios de cultivo generales, de enriquecimiento, selectivos y diferenciales slido en placa slido en tubo (slant) lquido (caldo) Esterilizacin: Diferentes tcnicas, aparatos y formas de trabajo para lograr la esterilizacin del material y para desechar el material una vez contaminado. 2 DIA- prcticas 1, 2 y 3 -Siembra de los medios preparados el da anterior: siembra de un cultivo en una placa de LB mediante agotamiento por estras. siembra de tres cultivos mediante agotamiento por estras en una placa de LB y otra de agar McConkey. siembra de un caldo de LB. siembra de dos cultivos en slant de TSI. siembra de microorganismos ambientales a partir de objetos y superficies para demostrar la ubicuidad de los microorganismos siembra de levaduras en agar sabouraud: incubacin a temperatura ambiente. Cultivo de bacterias en anaerobiosis: Utilizacin de la jarra de anaerobiosis 3er DIA- prctica 4. Resultados prcticas 1, 2 y 3. Tincin de Gram: Cmo se realiza y cul es el objetivo de la misma Ver los resultados del agotamiento por estras y del crecimiento en medio lquido y slant. Diferencias entre medio de cultivo general, selectivo y diferencial. Comprobar la ubicuidad de los microorganismos Ver el resultado del crecimiento en anaerobiosis.
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2a SEMANA
1er DIA- prcticas 5, 6 y 7. Dilucin de un caldo con E. coli para calcular el n de U.F.C./ ml. Estudio del efecto de antibiticos sobre el crecimiento bacteriano mediante la tcnica del Antibiograma (Cuantitativo y Cualitativo) Efecto de las altas temperaturas sobre el crecimiento bacteriano 2o DIA- prcticas 8 y 9. Resultados prcticas 5, 6 y 7. 9 Transformacin bacteriana: Realizacin de la tcnica de transformacin de un cultivo de E. coli (por resistencia a un antibitico) como ejemplo de transferencia horizontal de DNA. Estudio de un virus (bacterifagos): Cmo se pueden visualizar los virus. Ensayo de infeccin de bacterias con virus en medio slido Ver los resultados de las diluciones seriadas del caldo de E.coli y clculo del n de U.F.C./ml. Ver los resultados de los antibiogramas Ver los resultados del efecto de las temperaturas sobre el crecimiento bacteriano 3er DIA- prcticas 10, 11 y 12. Resultados prcticas 8 y 9. Tincin de Esporas: Cmo se realiza y cul es el objetivo de la misma Tincin de cpsula: Cmo se realiza y cul es el objetivo de la misma Observacin de levaduras al microscopio: Diferencias entre organismos procariotas y eucariotas al microscopio. Cmo es la clula levaduriforme. Observacin de varias especies de levaduras al microscopio. Ver el resultado de la transformacin bacteriana Ver placas de lisis de los virus infectando a las bacterias en medio slido
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3a SEMANA 1er DIA- prctica 13-A-1, 13-A-2, 13-B-1, 13-B-2, 13-B-3, 16-B Aprender a preparar, homogeneizar y diluir convenientemente la muestra a analizar para el anlisis de alimentos frescos-cocinados. Comenzaremos por la investigacin de microorganismos indicadores (mesfilos, enterobacterias) y la determinacin de indicadores de falta de higiene (coliformes totales, Escherichia coli y Staphylococcus coagulasa positivos). Comprobar la transformacin de una suspensin de harina de malta que la levadura Saccharomyces cerevisiae lleva a cabo mediante una fermentacin alcohlica para dar lugar a cerveza.
Recuento de microorganismos mesfilos totales: Preparacin de la muestra. Siembra de diluciones en PCA. Recuento de Enterobacteriaceae: Preparacin de la muestra. Siembra de diluciones en VRBG. Recuento de coliformes totales en placa: Preparacin de la muestra. Siembra de diluciones en VRBL. Investigacin de Escherichia coli Presencia/Ausencia: Preparacin de la muestra. Siembra de dilucin en caldo EC de doble concentracin. Recuento de Staphylococcus coagulasa positivos: Preparacin de la muestra. Siembra de diluciones en Agar Baird Parker. Preparacin de cerveza: Preparacin de la suspensin de harina de malta, activacin de las amilasas e inoculacin con Saccharomyces cerevisiae. 2 DIA- prctica 13-A-1, 13-A-2, 13-B-1, 13-B-2, 13-B-3 Recuento y tincin de Gram de colonias caractersticas. Pase de colonias caractersticas a medios para su posterior identificacin mediante pruebas bioqumicas. Recuento de microorganismos mesfilos totales: Recuento de placas. Tincin de Gram de colonias con diferentes morfologas. Recuento de Enterobacteriaceae: Recuento de placas y reconocimiento de colonias caractersticas. Pase a agar nutritivo. Recuento de coliformes totales en placa: Recuento de placas. Tincin de Gram de colonias caractersticas. Investigacin de Escherichia coli Presencia/Ausencia: Pase de tubos positivos de EC a tubos con caldo de triptona.
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Recuento de Staphylococcus coagulasa positivos: Recuento de placas y reconocimiento de colonias caractersticas. Pase de colonias tpicas y no tpicas a BHI. 3er DIA- prctica 13-A-2, 13-A-3, 13-B-2, 13-B-3 Tincin de Gram de colonias caractersticas. Pruebas bioqumicas confirmatorias. Investigacin de la presencia de mohos y levaduras. Recuento de Enterobacteriaceae: Prueba de la oxidasa. Siembra en agar KIA. Tincin de Gram. Investigacin de Escherichia coli Presencia/Ausencia: Adicin de reactivo de Kovacs y confirmacin. Recuento de Staphylococcus coagulasa positivos: Adicin de plasma de conejo con EDTA. Resultado de la prueba de la coagulasa. Recuento de mohos y levaduras: Preparacin de la muestra. Siembra de diluciones en OGA. 4a SEMANA 1er DIA- prctica 13-C-1, 13-C-2, 15-A, 15-B, 15-C Anlisis de alimentos frescos-cocinados: investigacin de patgenos en alimentos como posible causa de toxiinfecciones. Comenzaremos utilizando una muestra ya preenriquecida y procederemos a enriquecer en medios lquidos selectivos. Anlisis microbiolgico de la contaminacin ambiental y de manipuladores de alimentos. Presencia de Salmonella: Muestra preenriquecida en agua de peptona tamponada. Enriquecimiento en caldo Mueller Kauffmann tetrationato y Rappaport-Vassiliadis Soja. Presencia de Listeria monocytogenes: Muestra preenriquecida en caldo Fraser-demi. Enriquecimiento en caldo Fraser. Anlisis del aire: Contaminacin en placas de PCA para determinacin de mesfilos totales. Anlisis de superficies no planas: Siembra mediante mtodo del hisopo en placas de PCA y VRBG. Anlisis de superficies planas por placas de contacto Rodac: Anlisis de la superficie elegida con placas Rodac.
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Anlisis de manipuladores: Contaminacin en las manos y en el interior de la nariz. Siembra en placas VRBG y Agar Manitol Sal. 13-A-2: Ver el resultado de la siembra de KIA a partir de colonias caractersticas en el recuento de enterobacterias. 13-A-3: Recuento de colonias en placas OGA. 16-B: Comprobar el resultado de la fermentacin alcohlica. 2 DIA- prctica 13-C-1, 13-C-2, 15-A, 15-B, 15-C, 14-A, 14-B, 16-A Anlisis de alimentos frescos-cocinados: investigacin de patgenos en alimentos como posible causa de toxiinfecciones. Continuaremos la prctica procediendo a aislar los patgenos en medios selectivos. Estudio de la resistencia de esporas a los procesos de conservacin utilizados en la industria alimentaria mediante comparacin del recuento de formas vegetativas y recuento formas esporuladas tras tratamiento de la muestra a 80 C. Comprobar la transformacin de la leche que los microorganismos presentes en un yogur llevan a cabo mediante una fermentacin lctica para dar lugar a otro yogur. Presencia de Salmonella: Agotamiento en XLD y BGA. Presencia de Listeria monocytogenes: Agotamiento en Oxford y Palcam. Recuento de formas vegetativas: Preparacin de la muestra. Siembra de diluciones en PCA. Recuento de formas esporuladas aerobias y anaerobias: Calentar el mismo tubo de muestra utilizado para el recuento de formas vegetativas. Siembra de diluciones en PCA (recuento de esporos aerobios) y en Schaedler (recuento de esporos anaerobios). Preparacin de yogur: Siembra de un tubo de leche con un cultivo iniciador.
15-A, 15-B, 15-C: Ver el resultado del anlisis microbiolgico de la contaminacin ambiental y de manipuladores de alimentos. 3er DIA- prctica 13-C-1, 13-C-2, 14-A, 14-B, 16-A Anlisis de alimentos frescos-cocinados: investigacin de patgenos en alimentos como posible causa de toxiinfecciones. Finalizaremos la prctica procediendo a realizar pruebas bioqumicas especficas para la identificacin del patgeno y tincin de Gram. Identificacin de bacterias formadoras de esporas segn tincin de Gram y prueba de la catalasa.
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Comprobar el resultado de la fermentacin lctica. Presencia de Salmonella: Ensear galera API. Explicar pruebas serolgicas. Tincin de Gram. Presencia de Listeria monocytogenes: Explicar prueba de CAMP, iluminacin de Henry. Realizar prueba catalasa y tincin de Gram. Recuento de formas vegetativas, esporuladas aerobias y anaerobias: Discernir entre los gneros Bacillus y Clostridium segn la prueba de la catalasa. Preparacin de yogur: Tincin de Gram del cultivo iniciador y del yogur preparado.
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Prctica 1: PREPARACION DE MEDIOS Y SIEMBRA DE BACTERIAS EN MEDIOS DE CULTIVO Fundamento: Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos. Puesto que la diversidad metablica de los microorganismos es enorme, la variedad de medios de cultivo es tambin muy grande. La mayora de los medios de cultivo se comercializan en forma de liofilizados que es preciso rehidratar. La preparacin de un medio de cultivo se reduce en general a pesar la cantidad de medio y redisolverla en agua destilada (libre de inhibidores del crecimiento) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las sustancias termolbiles se esterilizan por filtracin y se aaden al resto de los componentes previamente esterilizados en el autoclave. Los constituyentes habituales de los medios de cultivo son: 1. Agar. Se utiliza como agente solidificante. Es un polisacrido que se obtiene de ciertas algas marinas. Las bacterias no son capaces de degradarlo. 2. Azcares. Son una fuente de carbono para los microorganismos. Los ms empleados son la glucosa, la lactosa y la sacarosa. 3. Extractos. Son preparados de ciertos rganos o tejidos animales o vegetales obtenidos con agua y calor. Ej.: extracto de carne, de levadura, de malta, etc. 4. Peptonas. Son protenas hidrolizadas, se obtienen por digestin qumica o enzimtica de protenas animales o vegetales. 5. Fluidos corporales. Sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero sanguneo son aadidos a los medios empleados para el cultivo de algunos microorganismos patgenos. 6. Sistemas amortiguadores. Son sales que se aaden al medio para mantener el pH dentro del rango ptimo del crecimiento bacteriano. Ej.: fosfatos bisdicos o bipotsicos. 7. Indicadores de pH. Son indicadores cido-base que se aaden para detectar cambios de pH en el medio. 8. Agentes reductores. Sustancias que se aaden al medio para crear las condiciones que permitan el desarrollo de los grmenes microaerfilos o anaerobios. Ej.: cistena y tioglicolato.
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9. Agentes selectivos. Sustancias como el cristal violeta, las sales biliares etc. que a determinadas concentraciones en el medio actan como agentes selectivos frente a determinados microorganismos. Tipos de medios de cultivo. Por su CONSISTENCIA: a) Slidos. Son aquellos que contienen un agente solidificante entre sus componentes, normalmente agar. Se preparan en placas de Petri o en tubos en slant (tubos con la superficie del medio inclinada). b) Lquidos. Se denominan caldos y se preparan en tubos o erlenmeyers. Por su COMPOSICIN: a) Medios generales. Permiten el desarrollo de una gran variedad de microorganismos. b) Medios de enriquecimiento. Favorecen el crecimiento de un determinado grupo de microorganismos, sin llegar a inhibir totalmente el crecimiento del resto. c) Medios selectivos. Permiten el crecimiento de un tipo de microorganismos determinado, inhibiendo el desarrollo de los dems. d) Medios diferenciales. Son aquellos en los que se pone de relieve alguna propiedad que un determinado tipo de microorganismos posee. Siembra de microorganismos En trminos microbiolgicos se entiende por SIEMBRA el proceso mediante el cual se lleva una porcin de una poblacin de microorganismos (inculo) de un cultivo bacteriano a un medio nutritivo para su crecimiento. PARA UNA CORRECTA REALIZACIN DE LA SIEMBRA SON NECESARIAS CIERTAS CONDICIONES: 1) Que se lleve a cabo con instrumentos estriles sobre medios de cultivo estriles. Para estudiar una bacteria determinada, es necesario destruir todos aquellos microorganismos que pudieran encontrarse en el medio y en los instrumentos de trabajo. Esto se consigue con la ESTERILIZACION, proceso que consiste en conseguir que todos los microorganismos presentes mueran desde el punto de vista microbiolgico.
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La esterilizacin Se utilizan dos tipos principales de esterilizacin: Por MTODOS FSICOS (calor, filtracin, radiaciones). Por MTODOS QUMICOS (empleo de soluciones qumicas). Los medios de cultivo se esterilizan en el AUTOCLAVE, el cual hace uso del calor hmedo. El autoclave es un aparato que permite elevar la presin y la temperatura con lo que se consigue un aumento en la temperatura de ebullicin del agua. Normalmente, se lleva la presin a 1 atmsfera (por encima de la ambiental) lo que corresponde a una temperatura interior de 126C, mantenindolo en estas condiciones durante 20 minutos. Todo el material de vidrio (pipetas, tubos, varillas.etc..) se esteriliza con calor seco, siendo el "horno Pasteur" el aparato ms empleado (se somete a temperaturas de 140-180 C durante 2h-3h). En el caso de objetos metlicos, como el asa de siembra, que se esterilizan en el momento de su utilizacin, se mantienen en la llama hasta que se pongan al rojo, teniendo la precaucin de enfriarlos antes de su uso. 2) Que el inculo no se contamine, modifique o destruya: Normalmente se emplea el calor directo, flameando las bocas de los tubos de ensayo, matraces, pipeta, etc. antes y despus de su utilizacin, a pesar de estar esterilizados previamente. 3) Que las condiciones ambientales durante el proceso sean lo ms prximas a la esterilidad para evitar contaminaciones durante el manejo del instrumental y de los medios de cultivo. Esto se resuelve con el uso de cabinas estriles (con flujo de aire y luz ultravioleta). Cuando no se dispone de ellas, se utiliza un mechero Bunsen que, debido a que fuerza la circulacin del aire en sentido vertical y hacia arriba, es capaz de crear un ambiente semiestril en la zona inmediata alrededor y debajo de la llama, de forma que los riesgos de contaminacin disminuyen considerablemente.
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Material de la Prctica: Mechero bunsen o similar Asa de siembra Tubos con cultivos bacterianos crecidos: Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Staphylococcus aureus. Material a preparar por el alumno: 1 Tubo con medio lquido estril (caldo comn): Luria Bertani (LB) 2 Tubos con medio slido estril (agar inclinado): TSI Placas: 4 placas LB agar; 1 placa agar McConkey; 1 placa agar Sabouraud. Mtodos: 1) PREPARACIN DE MEDIOS Preparacin de un medio slido en placa. 1. Pesar la cantidad de medio (si el preparado contiene agar debemos aadirlo a una concentracin de 15 g/l.) y rehidratarlo con agua destilada en una botella. 2. Autoclavar la botella sin cerrar totalmente el tapn de rosca. 3. Sacar del autoclave, enroscar del todo el tapn e introducir la botella en un bao a 40C al menos durante 30 minutos. 4. Distribuir el medio en las placas de Petri que estn estriles dentro de una campana de flujo laminar o en las proximidades del mechero, flameando bien la boca de la botella para evitar las contaminaciones. 5. Dejar que el medio solidifique. Preparacin de medio slido en tubo (slant). 1. Pesar el medio que contenga agar y rehidratar con agua destilada en un matraz. 2. Fundir el medio en un horno microondas o en una placa caliente. El medio debe hervir hasta que se vuelva transparente. 3. Distribuir rpidamente el medio en los tubos antes de que comience a solidificar. Para ello se emplear una pipeta y los tubos no se llenarn ms de un tercio de su volumen. 4. Autoclavar. 5. Sacar del autoclave e inclinar los tubos sobre la poyata para obtener tubos con medio en slant. Preparacin de medio lquido en tubo (caldo). 1. Pesar y rehidratar el medio.
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2. Distribuirlo con una pipeta en los tubos ( sin llenarlos ms de 1/3 de su volumen). 3. Autoclavar. 4. Sacar del autoclave y dejar enfriar. Todos los medios se guardan en nevera a 4C. 2) REALIZACIN DE LA SIEMBRA 1.- Marcar el material con el nombre de la pareja y grupo. 2.- Realizar la siembra, como sigue: a) Siembra en medio lquido: Se introduce el asa de siembra en el tubo con cultivo crecido y se toma un inculo que se lleva al tubo estril con medio lquido (agitndola en el seno del medio), tomando las precauciones mencionadas anteriormente. b) Siembra en placa: Dividida la placa en tres partes, sembrar en cada tercio el inculo tomado de los cultivos crecidos. Se introduce el asa de siembra en el tubo con cultivo crecido y se toma una gota de inculo que se extiende sobre el agar de la placa deslizando el asa suavemente por su superficie en zig-zag. c) Siembra en agar inclinado: Se introduce el asa de siembra en el tubo con cultivo crecido y se toma un inculo que se extiende sobre el agar inclinado deslizando el asa suavemente por su superficie en zig-zag. En el caso del medio TSI, la siembra se deber realizar tanto en superficie (aerobiosis) como en la profundidad del agar (anaerobiosis). 3) INCUBACIN de los medios sembrados a 37 C hasta que haya habido crecimiento bacteriano. 4) OBSERVACIN DE LOS RESULTADOS: En primer lugar, observar a simple vista diversas caractersticas como el color y el borde de las colonias crecidas en el agar as como el olor y la turbidez del medio ya que en algunos casos suelen ser tpicos de un determinado tipo de microorganismo y pueden servir de ayuda a la hora de su identificacin. El siguiente paso sera la observacin al microscopio, que ser objeto de otra prctica.
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Prctica 2: OBTENCION DE CULTIVOS PUROS Introduccin Un CULTIVO PURO es aquel que contiene una sola clase de microorganismos. Para obtenerlo es necesario recurrir a las llamadas tcnicas de aislamiento. Aunque existen otras, las tcnicas ms utilizadas emplean un medio de cultivo slido, en el que los microorganismos generan colonias separadas. Se puede demostrar que cada colonia procede de una sola clula o de un grupo de clulas del mismo tipo si el microorganismo forma agregados. Por ello lo ms correcto es hablar de unidades formadoras de colonias (UFC) al referirnos al origen de una colonia. Por tanto, todas las bacterias de una colonia son genticamente iguales y constituyen un clon. En esta prctica emplearemos dos mtodos para obtener un cultivo puro: Aislamiento por agotamiento por estras Aislamiento por siembra de diluciones seriadas (que ser el objeto de otra prctica ms adelante). Agotamiento por estras. Se trata de un mtodo rpido y simple de agotamiento progresivo y continuo del inculo sobre un medio slido contenido en una placa de Petri. El objetivo es obtener, a partir de un elevado nmero de bacterias, un nmero reducido de ellas distribuidas individualmente sobre la superficie de la placa. Cada una de estas bacterias originar una colonia. Procedimiento: 1. Esterilizar el asa y enfriarla en las proximidades del mechero. 2. Tomar el inculo como se ha descrito anteriormente. 3. Transferir el inculo a un rea pequea de la superficie de la placa, prxima al borde. Extenderlo formando estras muy juntas sobre la superficie de una porcin pequea de la placa. 4. Flamear el asa y enfriarla. Rozar una vez con el asa las estras sembradas la primera vez y realizar sobre una porcin virgen de la placa una segunda tanda de estras que no toque la primera. 5. Flamear y enfriar el asa. Repetir la operacin descrita en el apartado anterior, pero rozando al empezar la segunda tanda de estras. 6. Flamear el asa y cerrar la placa e incubar a 37C. 21
Prctica 3: CULTIVO DE BACTERIAS ANAEROBIAS Las bacterias anaerobias se pueden cultivar eliminando el oxgeno del medio ambiente o estableciendo un potencial rdox bajo, mediante la adicin de los suficientes materiales reductores al medio de cultivo. La proteccin de los cultivos anaerobios del oxgeno libre se puede conseguir por varios mtodos diferentes, el ms empleado en clnica es sembrar la bacteria en placas o tubos de cultivo e introducirlos en las llamadas jarras de anaerobiosis donde se genera una atmsfera libre de oxgeno. Estas jarras constan de un soporte para placas incluido en una cubeta transparente con tapa hermtica. Las placas y los tubos sembrados se colocan dentro del soporte en el interior de la jarra junto al sobre comercial abierto. Para crear la atmsfera anaerobia se utiliza el sobre comercial que contiene una tableta de borohidrato sdico, otra de bicarbonato sdico y cido ctrico y un catalizador de paladio. Cuando se aade agua al sobre, el borohidrato sdico, bicarbonato sdico y cido ctrico reaccionan para formar hidrgeno y dixido de carbono. El catalizador de paladio cataliza la reaccin entre el hidrgeno y el oxgeno presente dentro de la jarra. Esta reaccin produce agua, que se condensa en las paredes de la jarra. Para confirmar que la atmsfera es anaerobia se coloca dentro de la jarra un papel indicador que contiene azul de metileno. ste es azul en presencia de oxgeno y vira a blanco en un ambiente anaerobio. Esquema tomado de :http://www.azc.uam.mx/cbi/quimica/microbiologia/p14.pdf
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Prctica 4: OBSERVACIN DE BACTERIAS TEIDAS Para observar las bacterias teidas es necesario, en primer lugar, hacer un frotis de las bacterias y fijarlo. Para hacer un frotis, cuando se parte de un cultivo de bacterias en medio lquido, se toma una o varias cargas directamente con el asa y se extienden sobre el portaobjetos. Si se parte de un cultivo en medio slido, debe depositarse previamente una gota de agua sobre el portaobjetos. A continuacin, se toma con el asa una pequea parte de la colonia y se dispersa en la gota de agua, realizndose la extensin como en el caso anterior. La fijacin tiene por objeto provocar modificaciones en la composicin fsico-qumica de la bacteria (coagulacin de las protenas, etc.) de forma que sta conserve definitivamente una estructura similar a la que tena en vivo, sin deformarse como consecuencia de los tratamientos a que se ver sometida durante la tincin. Por otra parte la fijacin impide el arrastre de los microorganismos al quedar estos adheridos al portaobjetos y hace que la pared celular sea ms permeable a los colorantes. Para la fijacin pueden utilizarse agentes qumicos (formol, metanol) o el calor. Nosotros emplearemos el calor, y para ello el frotis, una vez seco, se pasa dos o tres veces sobre la llama, con la preparacin hacia arriba, para no quemarla. Hay que procurar que el calor nunca sea excesivo, pues se alteraran las estructuras de la bacteria: en ningn momento el portaobjetos, colocado sobre el dorso de la mano, debe quemar. Material: Portaobjetos. Mechero Bunsen. Asa de siembra. Tubos con cultivos de bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. Cubetas de tincin o similar. Colorantes para las tinciones: Cristal violeta, Lugol, Alcohol-Acetona (1:1) y Safranina. Mtodo: 1) Realizacin del frotis y la fijacin de los diferentes cultivos de bacterias Se proceder tal y como se ha descrito anteriormente.
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2) Tinciones: A) La TINCIN SIMPLE es la tincin en que se utiliza un solo colorante. Como colorantes utilizaremos el azul de metileno o la safranina, ambos de naturaleza bsica. La tcnica es la siguiente: 1. Hacer el frotis, secarlo y fijarlo. 2. Cubrir con colorante la preparacin y dejarlo actuar durante un minuto. 3. Lavar suavemente con agua destilada para eliminar el exceso de colorante. 4. Secar al aire y observar al microscopio con el objetivo de inmersin (100x) empleando el aceite apropiado. Esta tcnica permite observar la morfologa y tamao de las bacterias, as como los tipos de agrupaciones que forman. B) La TINCIN DE GRAM es la tincin diferencial ms utilizada en Bacteriologa pues permite separar las bacterias en dos grandes grupos, las Grampositivas y las Gram-negativas. La tincin de Gram requiere cuatro soluciones: 1. Primer colorante. Es un colorante bsico que en contacto con las clulas cargadas negativamente, reacciona con ellas colorendolas. El ms utilizado es el cristal violeta. 2. Solucin mordiente. Fija las tinciones y aumenta la afinidad entre el colorante y las clulas. Los mordientes empleados suelen ser sales metlicas, cidos o bases, como, por ejemplo, una solucin diluida de yodo. 3. Agente decolorante. Es un disolvente orgnico, por ejemplo, alcoholacetona (1:1). 4. Colorante de contraste. Es un colorante bsico de distinto color que el primer colorante, como, por ejemplo, la safranina. Los dos grupos bacterianos a los que anteriormente nos referamos difieren en el color con el que finalmente aparecen. Las bacterias Gram positivas se teirn de azul por el cristal violeta y no perdern esta coloracin durante los pasos sucesivos. Las bacterias Gram negativas perdern la coloracin inicial del cristal violeta en los siguientes pasos y se teirn de rosa debido a la safranina. La diferencia est determinada por la composicin de su envoltura celular. Las bacterias gram positivas poseen una malla de peptidoglicano en su parte ms externa, mientras que las bacterias gram negativas, recubriendo una fina capa de peptidoglicano, presentan una membrana externa que envuelve toda la clula.
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El mtodo de tincin es el siguiente: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Se prepara el frotis, se seca y se fija. Se cubre con cristal violeta durante un minuto. Lavar suavemente con agua destilada para eliminar el exceso de colorante. Se traza con lugol un minuto. El lugol acta como mordiente aumentando la afinidad del colorante por la bacteria. Lavar con agua el exceso de lugol. Se gotea alcohol-acetona de forma continua hasta que la preparacin deje de perder color y se lava enseguida con agua abundante. Se cubre la preparacin con un colorante de contraste, como la safranina, durante un minuto. Se lava con agua y se seca al aire, observndose a continuacin con el objetivo de inmersin.
3) Observacin de las tinciones de bacterias al microscopio. Las bacterias Gram-positivas presentarn una coloracin violeta mientras que las Gram-negativas la presentarn roja o rosa. La identificacin de las bacterias Gram-positivas puede ser problemtica, solamente cuando las bacterias Grampositivas se encuentran en crecimiento exponencial (cultivos jvenes) la reaccin es clara; en fase estacionaria (cultivos viejos) las bacterias Gram-positivas pueden parecer Gram-negativas.
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Prctica 5: RECUENTO DEL NMERO DE BACTERIAS POR MILILITRO Introduccin El mtodo que vamos a utilizar consiste en realizar diluciones sucesivas de la muestra en condiciones de esterilidad con objeto de sembrar despus cantidades conocidas de las mismas en una serie de placas de petri. Considerando que alguna de las diluciones ser tal que al distribuir una parte de ella en la placa, originar colonias separadas. Contando el nmero de colonias, el volumen sembrado en la placa y la dilucin correspondiente, podremos calcular el nmero de unidades formadoras de colonias presentes en la muestra inicial. Material - Muestra - Pipetas automticas. - Tubos eppendorf. - Placas de agar LB. Mtodo A partir de la muestra hacer una serie de 4 diluciones decimales en condiciones de esterilidad. -2 -4 -6 -8 Extender 25 l de las diluciones 10 , 10 , 10 y 10 en una placa e incubar toda la noche. A partir del nmero de colonias presentes en cada dilucin, calcular el nmero de bacterias por ml en el cultivo original.
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Prctica 6: ANTIBIOGRAMA Introduccin En nuestros das han sido puestos a nuestra disposicin para la lucha contra las enfermedades bacterianas gran cantidad de agentes antibacterianos. Los antibiticos son sustancias qumicas producidas por microorganismos o derivados semisintticos de stas, mientras que los quimioterpicos son productos de sntesis qumica, pero ambos tienen la propiedad de estar dotados de actividad antibacteriana. Todas las bacterias no tienen la misma sensibilidad a los distintos antibacterianos. La evaluacin de esta sensibilidad nos va a ayudar en la seleccin del compuesto ms adecuado para el tratamiento de una infeccin bacteriana. Las pruebas ms utilizadas para evaluar la sensibilidad de una bacteria a un agente antibacteriano estn basadas en el enfrentamiento in vitro de la bacteria con distintas concentraciones del agente. Concentracin mnima inhibitoria (CMI) se define como la menor concentracin de antimicrobiano capaz de inhibir el desarrollo de una cepa bacteriana dada. Concentracin mnima bactericida (CMB) se define como la menor concentracin de antimicrobiano capaz de destruir una cepa bacteriana dada. Fundamento El antibiograma por el mtodo de difusin en agar es una prueba en la que se enfrenta la bacteria inoculada sobre la superficie de un medio de agar con una solucin antibitica absorbida en discos de papel de filtro. Este mtodo est estandarizado y los halos de inhibicin han sido obtenidos correlacionndolos con las CMI y aparecen en unas tablas. Hay varios factores que afectan al halo de inhibicin: la carga del antibitico en los discos, la difusin del antibitico en el medio de cultivo, el tamao del inculo bacteriano, la composicin y grosor del medio de cultivo, la velocidad del crecimiento bacteriano y el tiempo de incubacin. Los discos de antibiticos son adquiridos comercialmente. Deben contener la cantidad establecida de antibitico y ser conservados a 4C protegidos de la humedad. El inculo bacteriano debe tener una turbidez similar al 0,5 de la escala 8 de McFarland, aproximadamente 10 UFC/ml y ser preparado en solucin salina estril o caldo de cultivo.
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Objetivos Determinar la sensibilidad bacteriana a distintos antibiticos utilizando metodologa sencilla y asequible a cualquier laboratorio de Microbiologa. Material necesario - Cultivo puro de Staphylococcus aureus y Escherichia coli. - Placas de LB agar. - Discos comerciales de antibiticos. - Hisopos estriles - Pinzas de laboratorio.
una
Realizacin 1. Preparacin del inculo. Partiendo de un cultivo puro tomar con el asa de siembra X colonias de la bacteria e introducirlas en el caldo de cultivo. La turbidez del inculo debe equivaler al estndar 0,5 de McFarland. 2. Inocular la superficie de una placa de agar con el hisopo pasndolo uniformemente por toda la superficie en tres direcciones. Por ltimo, pasar el hisopo por el reborde de la placa de agar. Dejar secar 5 minutos. Colocar los discos de antibiticos sobre la superficie del agar utilizando unas pinzas estriles y apretndolos suavemente sobre la superficie del agar. Los discos no deben estar a menos de 15 mm de los bordes de la placa y lo bastante separados entre ellos para que no se superpongan sus zonas de inhibicin. Dejar las placas 15 minutos a temperatura ambiente para que comiencen a difundir los antibiticos. 3. Incubar la placa en posicin invertida a 37C durante 18-24 horas. 4. Medir los dimetros de los halos de inhibicin con una regla. Ensayo cualitativo: un mismo cultivo se enfrenta a distintas soluciones antibiticas. Ensayo cuantitativo: un mismo cultivo se enfrenta a un slo antibitico, preparado a distintas concentraciones.
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Esquema: preparacin de los discos impregnados de antibitico para realizar un antibiograma. Tomado de http://personales.ya.com/erfac/practi/microbi3.htm
Interpretacin de los resultados Los dimetros de los halos de inhibicin se traducen a las categoras de resistente (R), intermedio (I), moderadamente sensible (MS) o sensible (S).
Tomado de http://personales.ya.com/erfac/practi/antibio4.jpg
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Prctica 7: EFECTO DE LAS ALTAS TEMPERATURAS SOBRE EL CRECIMIENTO MICROBIANO Fundamento Las altas temperaturas provocan efectos letales o subletales sobre los microorganismos. Una bacteria sometida a una temperatura superior a la que normalmente crece, sufre, en primer lugar, daos en sus protenas y cidos nucleicos. Estos primeros daos impiden que la bacteria se reproduzca y, por consiguiente, forme una colonia sobre un medio de cultivo adecuado. Sin embargo, si el tratamiento es corto en duracin y se efecta a una temperatura no excesivamente alta, los daos que la bacteria sufre son reparables y, por eso, se habla de efectos subletales. Cuando el tratamiento es ms fuerte, en temperatura o en duracin, los daos se hacen irreparables y la bacteria pierde de forma irreversible su capacidad de formar colonias. Se habla entonces de efecto letal. Material necesario 3 matraces con un cultivo de la bacteria problema. 1 placa de Petri de agar LB. Micropipeta y puntas estriles. Mechero Bunsen. Bao termosttico a 60C. Realizacin Se dispondr de tres matraces con un cultivo de la bacteria problema y de una placa de Petri con agar LB. 1.- Separar la placa en tres partes iguales con el marcador de vidrio y nombrar cada parte con el tiempo de incubacin a estudiar. Es decir 0, 15 y 30 minutos. 2.- Tomar, con una punta estril, 25 l de uno de los cultivos y extenderlos sobre la parte de la superficie de la placa correspondiente al tiempo t=0. 3.- Colocar los otros dos matraces en el bao de agua e incubar a 60C. 4.- A t= 15 y 30 minutos tomar 25 l de muestra del matraz que corresponda y extenderlos sobre la parte de la placa correspondiente. 5.- Incubar la placa a 37C durante una noche. 6.- Al da siguiente, hacer un recuento de las colonias a los diferentes tiempos (a t=0 ser imposible porque se tratar de un csped).
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Prctica 8: TRANSFORMACION BACTERIANA POR RESISTENCIA A AMPICILINA Las bacterias pueden transmitir la informacin gentica verticalmente (de "madres" a "hijas") o de una manera horizontal (entre bacterias que coexisten al mismo tiempo). La transferencia vertical se realiza mediante el proceso de divisin celular y el reparto equitativo del cromosoma bacteriano replicado. La transferencia horizontal se realiza entre clulas vecinas y es el mecanismo a travs del cual las bacterias diseminan los genes de resistencia a antibiticos. Los vehculos mediante los cuales se transfiere el DNA horizontalmente son los plsmidos o los fagos. Un plsmido es un elemento extracromosmico con capacidad de autoreplicacin y los fagos son virus de bacterias. Los mecanismos de la transferencia horizontal son: 1.-La TRANSFORMACION: por este mecanismo una clula es capaz de tomar un fragmento de ADN del medio extracelular y expresar los genes en l contenidos. 2.-La CONJUGACION: las bacterias capaces de formar el "pelo F" pueden transferir una copia de parte de su cromosoma a otra bacteria receptora. Es un procedimiento de transmisin sexual de informacin gentica.
3.-La TRANSDUCCION: cuando un virus que infecta una bacteria de forma que el ADN viral est integrado en el de la bacteria (ciclo lisognico) se escinde del cromosoma bacteriano (pasa a ciclo ltico) puede llevarse consigo parte del genoma bacteriano e integrarlo en el cromosoma de una nueva bacteria a la que infecte.
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Esquemas tomados de: http://personales.ya.com/erfac/practi/antibio4.jpg Para que se produzca la transformacin de un bacteria sta debe encontrarse en un estado fisiolgico especial denominado "competencia". Las clulas competentes son aquellas susceptibles de ser transformadas y, por lo tanto, tomar un ADN externo e introducirlo en su citoplasma. El ADN asimilado de esta forma puede expresar sus genes en la bacteria transformada. Si este ADN externo tiene un origen de replicacin funcional en la bacteria competente puede perpetuarse al pasar a las clulas hijas (plsmidos). Objetivo Demostrar como podemos conferir a una bacteria la resistencia a un antibitico mediante transformacin con DNA exgeno. Material: 1 placa de Petri con medio de agar LB con ampicilina. 1 tubo eppendorf conteniendo 100 l de clulas de E. coli competentes. 1 tubo eppendorf conteniendo 1g de plsmido pGEMt portador de un gen de resistencia a ampicilina. 1 pipeta de 01 ml limpia. Metodologa A.-Preparacin de clulas competentes: Las clulas de E. coli se cultivan en medio LB y cuando estn en fase exponencial se centrifugan y se resuspenden en una disolucin de CaCl2 50 mM. La concentracin de las clulas es 10 veces la inicial.
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B.-Transformacin 1. Dividir la placa de Petri en dos mitades con el marcador de vidrio. 2. Extender con la punta de la pipeta 50 l de las clulas competentes en una mitad de la placa. 3. Aadir el resto de las clulas sobre el ADN del segundo tubo. 4. Mantener 20 minutos en hielo. 5. Colocar el ADN con las clulas a 42 durante 1 minuto. 6. Poner la mezcla en hielo durante 5 minutos. 7. Incubar las clulas a 37C durante 15 minutos. 8. Extender las clulas transformadas en la segunda mitad de la placa. 9. Incubar 20 horas a 37C Observacin y discusin de resultados. Se observar que algunas de las clulas tratadas han adquirido resistencia a ampicilina como se puede comprobar por la aparicin de colonias en la placa en que se sembraron.
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Prctica
9:
AISLAMIENTO
CARACTERISTICAS
DE
UN
BACTERIOFAGO (VIRUS DE BACTERIAS) Los virus son demasiado pequeos para poder ser vistos con el microscopio ptico y nicamente son visibles gracias al mayor poder de resolucin que ofrece el microscopio electrnico. Los virus estn compuestos de un genoma, bien en forma de DNA o RNA, y de protenas. Son parsitos obligados y necesitan de la maquinaria metablica de la clula husped para la replicacin de su material gentico. En esencia un virus consta de cido nucleico rodeado por una cubierta de protena, llamada cpsida.
Los bacterifagos son virus de bacterias que presentan todas las caractersticas de estructura y ciclo vital que presentan los virus animales o vegetales. Se han descubierto especies de bacterifagos que atacan selectivamente a prcticamente todas las bacterias importantes conocidas. El bacteriofago Lamba () es uno de los bacterifagos ms estudiados de los especficos de E. coli. Infecta la clula unindose al receptor de la maltosa (protena que permite que la maltosa entre
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en la clula) y una vez unido inyecta su ADN de cadena doble en la clula bacteriana. En el interior de la bacteria este ADN puede o bien integrarse en el cromosoma bacteriano y sus genes quedan reprimidos, o bien se expresar sus genes y sintetizar nuevos fagos. En el primer caso se habla de ciclo lisognico y en el segundo de ciclo ltico. Objetivo La presencia de virus pasara desapercibida a no ser por el hecho de que son agentes infecciosos y que se hacen evidentes a travs de los sntomas de las enfermedades que producen. El objetivo de la prctica consiste en visualizar la presencia de bacterifagos a travs de las consecuencias de su ciclo infeccioso. Material Dos placas de medio phage base precalentadas a 37C. Dos tubos de vidrio con 300 l de bacterias Staphylococcus aureus 8325-4 competentes diluidas en phage broth. 10 ml de phage top agar a 55 C. Eppendorf con 200 l del fago 85 diluido en phage broth. Pipeta automtica Pipeta de 5 ml estril Pipeteador automtico Metodologa Tomar un tubo con 300 l de clulas competentes y aadirles 200 l de una dilucin del fago. Mezclar por agitacin. A partir de aqu, hacer lo mismo con el tubo con 300 l de clulas competentes al que no le hemos aadido el fago. Incubar 30 min a temperatura ambiente. Aadir 5 ml de phage top agar a 55 C. IMMEDIATAMENTE mezclar y aadir sobre la placa de phage base precalentada a 37C. Dejar solidificar y meter en la estufa a 37C.
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Prctica 10: IDENTIFICACION DE LEVADURAS Introduccin Las levaduras son hongos de talo unicelular, capaces de reproducirse asexualmente por gemacin o fisin. La mayora se reproducen asexualmente por gemacin polar o multilateral, proceso durante el cual se forma en la periferia de la clula, una protuberancia (yema) que aumenta de tamao hasta que finalmente se desprende de la pared celular, constituyendo una nueva levadura. Unas pocas especies se multiplican por escisin. Algunas especies pueden formar micelio, y la mayora de ellas fermentan uno o varios azcares. Intervienen en fermentaciones beneficiosas como la fabricacin del pan, vino, cerveza y quesos. Tambin pueden intervenir en alteraciones de zumos y frutas, miel, almbares, jaleas, carnes, vino, cerveza y otros alimentos. Su identificacin se basa en criterios morfolgicos y fisiolgicos. En esta prctica nos centraremos en la identificacin de levaduras siguiendo pruebas morfolgicas lo que nos permitir aproximarnos al gnero al que pertenecen teniendo en cuenta que la identificacin definitiva se hace en base a pruebas bioqumicas. Definimos algunos trminos habituales en micologa. 1. Blastospora: Clula fngica que se forma como consecuencia de un proceso de gemacin. 2. Clamidospora: Espora esfrica formada en las hifas, ya sea en posicin intercalar o terminal, de pared gruesa y cuyo dimetro es mayor que el de los filamentos en los que se forma. 3. Micelio: Conjunto de hifas o filamentos de un hongo. Las pruebas morfolgicas utilizadas para la identificacin de levaduras son: Aspecto de las colonias. Observacin microscpica de los cultivos. Microscpicamente, es difcil distinguir en cultivos sobre agar las colonias de levaduras de las bacterianas. La mayor parte son blanquecinas y algunas cremosas o rosadas. Objetivos 1. Observar colonias de diferentes especies de levaduras. 2. Poner de manifiesto las principales caractersticas microscpicas de las levaduras, tales como presencia de micelio, blastosporas y clamidosporas.
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Material necesario. 1. Cultivos puros en agar Sabouraud de: Candida pseudotropicalis Saccharomyces cerevisiae Realizacin 1. Observar el aspecto de las colonias de las dos especies de levaduras. 2. Inocular las placas de agar Sabouraud. A partir de los cultivos puros se inoculan las dos levaduras en una misma placa de Sabouraud. Para ello se toma una pequea parte de una colonia aislada y se realizan estras en una porcin de la placa. Se incuban las placas durante tres das a temperatura ambiente. 3. Colocar una gota de agua en un portaobjetos limpio y con el asa de siembra previamente flameada transferir una pequea cantidad del cultivo en medio slido a la gota. Remover hasta formar una suspensin homognea. Colocar un cubreobjetos 4. Observacin microscpica de los cultivos. Se emplear el objetivo X10.
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Prctica 11: TINCIN DE ESPORAS Fundamento: Las especies de los gneros Bacillus y Clostridium tienen la propiedad de formar endosporas que son formas de resistencia capaces de sobrevivir a altas temperaturas y medios adversos. Se producen cuando las condiciones ambientales son desfavorables (agotamiento de los nutrientes, temperaturas extremas, radiaciones, compuestos txicos, etc.), formndose una espora por cada forma vegetativa. Al finalizar el proceso de esporognesis, la clula vegetativa se lisa y libera la espora al exterior. Cuando el ambiente es favorable, la espora germina generando una nueva forma vegetativa. La capacidad de germinar perdura durante aos. La formacin de endosporas es un carcter de gran importancia en la biologa de un microorganismo. La pared celular de la endospora presenta distinto comportamiento que la membrana bacteriana frente a la tincin, por lo que se utilizan tcnicas especiales de coloracin con verde malaquita o fucsina bsica (en caliente) como colorantes. Material: -Cultivo de Bacillus en medio slido. -Portaobjetos. -Asa de siembra. -Mechero Bunsen. -Papel de filtro. -Verde malaquita (solucin acuosa al 2%). -Safranina. -Microscopio. Mtodo: 1. Hacer un frotis de cultivo en medio slido (preferentemente de al menos 48 horas) de Bacillus sphaericus y Bacillus thuringiensis. Secar al aire y fijar con calor. 2. Colocar el porta sobre un trpode y cubrir la preparacin con papel de filtro de aproximadamente el mismo tamao que la extensin (tienen por objeto mantener hmeda la preparacin y evitar que los bordes del porta se manchen de colorante). 3. Aadir la solucin de verde malaquita (solucin acuosa al 2%), calentar con el mechero nuevamente, sin que llegue a hervir, hasta la emisin de vapores blancos.
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Continuar calentando durante 5 minutos. Aadir ms colorante si ste se evapora. Es importante que la muestra no se seque. 4. Lavar con agua intensamente y quitar el papel de filtro. 5. Teir con safranina (como colorante de contraste) durante 1 minuto. 6. Lavar con agua, secar y observar al microscopio con objetivo de inmersin. Se ver la endospora teida de color verde y las clulas vegetativas de color rojo. Interpretacin de los resultados: La posicin y la morfologa de la endospora en el interior de la bacteria constituyen un carcter taxonmico til para diferenciar especies dentro de un mismo gnero. Por ejemplo, Bacillus sphaericus posee una endospora esfrica con localizacin terminal y deformante de la clula vegetativa, por lo que suele ser denominada en palillo de tambor. Bacillus thuringiensis tiene localizada la endospora elipsoidal en el centro de la clula vegetativa, lo que provoca un abombamiento caracterstico denominado en huso.
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Prctica 12: TINCIN DE CPSULA Fundamento
La cpsula se puede definir como una estructura superficial que presentan muchas bacterias en sus ambientes naturales, consistente en una acumulacin de material mucoso o viscoso, situado externamente respecto de la pared celular. Las cpsulas se pueden clasificar en funcin del grado de asociacin con la superficie celular, o por su consistencia:
Cpsula rgida: con suficiente consistencia estructural como para evitar la entrada de partculas como las de tinta china o nigrosina. Suele tener un lmite exterior definido. Cpsula flexible: poca consistencia, de modo que no excluye partculas. Adems, es deformable y carente de lmites precisos. Cpsula integral: ntimamente asociada con la superficie celular, con la pared celular Cpsula perifrica: asociada a la superficie celular slo en determinadas condiciones, pero finalmente se dispersa al medio exterior. Hay una cierta confusin en la nomenclatura de las cpsulas. Por eso cabe destacar que CPSULAS en sentido estricto son aquellas de tipo rgido e integral. Capas mucilaginosas son las de tipo flexible y perifrico.
Las cpsulas son estructuras inertes no vivas, carentes de papel activo (metablico) pero que confieren a las bacterias importantes propiedades:
Adhesin a otras clulas: microcolonias y consorcios Adhesin a sustratos inertes o vivos: colonizacin de sus nichos ecolgicos (p. ej. Tejidos de organismos superiores) Proteccin contra agentes antibacterianos
La estructura es a base de una matriz muy hidratada, con una ordenacin regular radial, o a veces en lminas concntricas. El material capsular se compone de
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macromolculas asimtricas que, en muchos casos constan de una serie de unidades repetitivas: polisacridos o polipptidos.
Material Cepas bacterianas: Klebsiella en medio lquido Tinta china Portaobjetos y cubreobjetos Microscopio ptico
Mtodo La observacin a microscopa ptica en fresco es difcil, ya que su ndice de refraccin es similar al del medio. Se recurre a tincin negativa por medio de nigrosina o tinta china.
1. Colocar una gota del medio con la bacteria en un portaobjetos, aadir una gota de tinta china y mezclar bien. 2. Colocar suavemente un cubreobjetos sobre la suspensin de clulas con tinta china. Evitar que se formen burbujas. 3. Colocar los portaobjetos con los cubreobjetos entre dos papeles absorbentes. Presionar con los dedos sobre el portaobjetos. El exceso de suspensin ser absorbido por los papeles. 4. Tirar el papel en un contenedor para material contaminado y lavarse las manos con jabn. 5. Observar al microscopio, se debe de ver la clula teida de negro y la cpsula en blanco. Trabajar con el diafragma del condensador cerrado para aumentar el contraste de las clulas.
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Prctica 13: ANLISIS MICROBIOLGICO DE ALIMENTOS FRESCOSCOCINADOS Los alimentos son fcilmente colonizados (contaminados), ya sea de forma natural, en origen o durante el procesamiento y la manipulacin. La multiplicacin de los microorganismos en el alimento puede implicar desde una alteracin inapreciable hasta su deterioro completo y puede ser, en cualquier caso, una va de transmisin de enfermedades. Por lo tanto, el alimento puede ser vehculo de microorganismos patgenos o de sus toxinas, con riesgo para el consumidor. En esta prctica nos centraremos en algunas bacterias y hongos que pueden ser causa tanto de toxiinfecciones, al ser ingeridas por el hombre, como de alteraciones durante la conservacin del alimento.
13-A:
INVESTIGACIN DE MICROORGANISMOS INDICADORES
13-A-1. Recuento de microorganismos mesfilos totales (NF EN ISO 4833) La determinacin de este grupo nos da idea de la calidad de la materia prima y del proceso de elaboracin del producto. Cifras altas en este recuento pueden indicar un proceso de alteracin del alimento, aunque no necesariamente hay que relacionarlo con la presencia de grmenes patgenos. Material Muestra Balanza de precisin Pipetas automticas de 1 y 0,1 ml Placas de Petri estriles vacas PCA fundido estril para recuento en placa Mtodo 1. Aadir con pipetas estriles, a partir de tres de las diluciones decimales (10 -2, 10 -3, 10 -4), 1 ml/placa a una serie de tres placas de Petri vacas estriles. 2. Verter en cada placa unos 20 ml de medio PCA fundido y atemperado a 4550 C. 3. Incubar durante 24 h-72 h a 30 C. Recuento de placas en las que el nmero de colonias est comprendido entre 30 y 300. Clculo de ufc/gramo. 4. Tincin de Gram de colonias con diferentes morfologas.
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13-A-2. Recuento de Enterobacteriaceae (NF EN ISO 7402) Las bacterias pertenecientes a la familia Enerobacteriaceae son bacilos Gram negativos que se caracterizan por ser: . Bacilos Gram negativos . Citocromo c oxidasa negativos . Fermentadores de la glucosa . Reductores de nitratos a nitritos Se aslan del intestino del hombre y de los animales, y su presencia en los alimentos en niveles altos hace pensar en una elaboracin inadecuada y/o contaminacin posterior. En esta prctica se hace un recuento de Enterobacteriaceae totales sin llegar a identificar los gneros. Material Muestra Balanza de precisin Pipetas automticas de 1 y 0,1 ml Placas de Petri estriles vacas VRBG fundido para recuento en placa Placas de agar nutritivo Tubos KIA Reactivo tetrametil-p-fenilendiamonio Mtodo 1. Aadir con pipetas estriles, a partir de dos de las diluciones decimales y por duplicado (10 -2, 10 -3), 1 ml/placa a placas de Petri vacas estriles. 2. Verter en cada placa unos 20 ml de medio VRBG fundido y atemperado a 4550 C (este medio de cultivo no se autoclava). 3. Incubar durante 24 h a 37 C. Recuento de placas en las que el nmero de colonias est comprendido entre 30 y 300. Las colonias caractersticas son de color violeta con un halo de precipitacin alrededor. 4. Confirmar las colonias tpicas aisladas mediante pase a agar nutritivo (incubacin 24h a 37 C) y a partir de ah, realizar la prueba de la oxidasa y siembra en agar KIA y tincin de Gram. Clculo de ufc/gramo.
13-A-3. Recuento de Mohos y levaduras (NF ISO 7954:1988) Se investiga la presencia de mohos y levaduras por ser potencialmente productores de micotoxinas y porque pueden llevar a cabo procesos de alteracin del alimento. 43
En esta prctica se asla en medio selectivo OGA que lleva incorporado el antibitico oxitetraciclina, el cual inhibe de forma eficaz el crecimiento bacteriano. Material Muestra Balanza de precisin Pipetas automticas de 1 y 0,1 ml Placas de Petri con medio OGA Mtodo 1. Aadir con pipetas estriles, a partir de tres de las diluciones decimales (10 -2, 10 -3, 10 -4), 0,1 ml/placa a placas con medio OGA. 2. Incubar durante 5 das a 25 C. Recuento de placas en las que el nmero de colonias est comprendido entre 30 y 300. Clculo de ufc/gramo.
13-B: DETERMINACIN DE INDICADORES DE FALTA DE HIGIENE
13-B-1. Recuento de coliformes totales en placa (NF ISO 4832,1991) Los coliformes es un grupo perteneciente a las enterobacterias que adems de fermentar la glucosa tambin fermenta la lactosa. A este grupo pertenece E. coli que es un indicador de contaminacin fecal. Caractersticas estructurales y fisiolgicas de los coliformes: . Bacilos Gram Negativos . Citocromo C oxidasa negativos . Fermentadores de la glucosa . Fermentadores de la lactosa . Reductores de nitratos a nitritos Material Muestra Balanza de precisin Pipetas automticas de 1 y 0,1 ml Placas de Petri con medio VRBL Mtodo 1. Aadir con pipetas estriles, a partir de tres de las diluciones decimales (10 -2, 10 -3, 10 -4), 1 ml/placa a placas de Petri vacas estriles. 2. Verter en cada placa unos 20 ml de medio VRBL fundido y atemperado a 4550 C (este medio de cultivo no se autoclava).
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3. Incubar durante 24 horas a 37 C. Recuento de placas en las que el nmero de colonias est comprendido entre 30 y 300. Tincin de Gram. Clculo de ufc/gramo.
13-B-2. Investigacin de Escherichia coli Presencia/Ausencia Escherichia coli pertenece a la familia Enterobacteriaceae y dentro de ella al grupo coliformes, que se caracteriza por fermentar la lactosa con produccin de cido y gas a 37C. Adems, esta bacteria es capaz de llevar a cabo dicha fermentacin a 44C. Es de inters su investigacin en alimentos por ser indicador de contaminacin fecal, que implica una mala manipulacin del producto. Caractersticas estructurales y fisiolgicas: . Bacilos Gram Negativos . Citocromo C oxidasa negativos . Fermentadores de la glucosa . Fermentadores de la lactosa . Productores de indol a 44C . Reductores de nitratos a nitritos
Material Muestra Balanza de precisin Pipetas automticas de 1 y 0,1 ml Tubos con caldo EC con campana Tubos con caldo de triptona Reactivo de Kovacs Mtodo 1. Siembra de 10 ml de muestra (dilucin 10-1) en 10 ml de caldo EC de doble concentracin con campana, precalentados a 44C. 2. Incubar los tubos 24-48 horas a 44C. 3. Considerar positivos los tubos que presenten al menos un 10% de gas en la campana. 4. Confirmar los tubos positivos de EC mediante pase de 0,1 ml a tubos con caldo de triptona, para realizar la prueba del indol. Incubar los tubos a 44C durante 24-48 horas. 5. Aadir reactivo de Kovacs para revelar la presencia de indol. 45
13-B-3. Recuento de Staphylococcus coagulasa positivos (ISO 6888,1999) Staphylococcus aureus pertenece a la familia Micrococaceae y es coco Gram positivo, catalasa positivo y anaerobio facultativo, que se caracteriza por la presencia de coagulasa (coagula soluciones de plasma). Es un germen ubicuo que se encuentra en la piel y cavidad nasofarngea del hombre y de numerosas especies animales, especialmente en las mamas de vacas y ovejas de donde contamina leche y otros alimentos. Esta bacteria es el agente etiolgico de la intoxicacin estafiloccica, aunque no todas las cepas de esta especie son enterotoxignicas (capacidad de formar enterotoxinas). Caractersticas estructurales y fisiolgicas: . Coco Gram positivo . Aerobio-anaerobio facultativo . Catalasa positivo . Coagulasa positivo . Fermenta el manitol . Posee enzima lecitinasa Material Muestra Balanza de precisin Pipetas automticas de 1 y 0,1 ml Placas de Petri con medio agar Baird Parker Tubos con caldo BHI y tubos con plasma de conejo/EDTA Mtodo 1. Aadir con pipetas estriles, a partir de tres de las diluciones decimales (10 -2, 10 -3, 10 -4), 0,1 ml/placa a placas con medio Agar Baird Parker. 2. Incubar durante 24-48 horas a 37 C. Recuento de placas en las que el nmero de colonias est comprendido entre 15-150 (tpicas y no tpicas). 3. Confirmar tres colonias tpicas y 3 no tpicas mediante siembra en caldo BHI. Incubar los tubos a 37C durante 24 horas. 4. Aadir 0,1 ml a tubos estriles que contienen 0,3 ml de plasma de conejo con EDTA. Incubar durante 4-6 horas para observar la aparicin del medio solidificado por la accin del enzima coagulasa 5. Los resultados Staphylococcus coagulasa + se expresan como ufc/g o ml multiplicando el nmero de colonias confirmadas positivas, por 10 (porque hemos sembrado 0,1 ml por placa) y por el factor de dilucin. 46
13-C:
INVESTIGACIN DE PATGENOS
Su presencia en los alimentos indica que estos pueden ser causa de toxiinfecciones al ser ingeridos por el hombre.
13-C-1. Presencia de Salmonella (NF EN ISO 6579,2002) Salmonella es una enterobacteria patgena causante de importantes trastornos gastrointestinales, por lo que resulta de inters su investigacin en Microbiologa de los alimentos. La legislacin espaola actual no admite la presencia de esta bacteria en los alimentos, por lo que se lleva a cabo un anlisis de presencia o ausencia. Los animales son el reservorio principal de la enfermedad humana, excepto para las bacterias responsables de las fiebres tifoidea y paratifoidea en las que el nico reservorio es el hombre. La manifestacin de la enfermedad puede ser subclnica (portadores asintomticos) o bien producir cuadros de enteritis, septicemia o fiebre intestinal. La transmisin se lleva a cabo por ingestin de alimentos contaminados (especialmente pollos, huevos y productos lcteos). Control: Preparacin y refrigeracin adecuadas de los alimentos. Mejora de la higiene. Caractersticas estructurales y fisiolgicas: . Bacilos Gram Negativos . No forman esporas . Citocromo C oxidasa negativos . Anaerobios facultativos . Catalasa positivos . Fermentadores de la glucosa . No fermentadores de la lactosa . Reductores de nitratos a nitritos . Mviles por flagelos peritricos, excepto S. typhi y S. paratyphi. . Requerimientos nutricionales simples . No tienen actividad ureasa . Son lisina y ornitina positivos
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Material Muestra Balanza de precisin Pipetas automticas de 1 y 0,1 ml Agua de peptona tamponada (BPW) Placas de Petri con medio XLD Placas de Petri con medio BGA Tubos con caldo Mueller Kauffmann tetrationato Tubos con caldo Rappaport-Vassiliadis Soja Mtodo 1. Preenriquecimiento: Pesar 25 g del alimento en una bolsa de plstico estril y aadir 225 ml de agua de peptona tamponada (BPW). Homogeneizar con el stomacher. Incubar la bolsa 16-18 horas a 37 C. 2. Enriquecimiento en medios lquidos selectivos: Aadir con pipeta estril, 1ml de la muestra preenriquecida a 10 ml de caldo Mueller Kauffmann tetrationato e incubar a 37 C durante 24 horas. Por separado, aadir 0,1 ml de la muestra preenriquecida a un tubo con 10 ml de Rappaport-Vassiliadis Soja en incubarlo a 42 C durante 24 horas. 3. Aislamiento en medios slidos selectivos: agitar los caldos de
enriquecimiento y a partir de cada uno de ellos, realizar un agotamiento por estras en medio selectivos para Salmonella (XLD y BGA). Incubar las placas a 37C durante 24-48 horas. Nota: Salmonella crece en XLD formando colonias rosas con centro negro salmn. En BGA las colonias de Salmonella son rosas transparentes, virando el medio a un rosa intenso. 4. Confirmacin bioqumica y serolgica: Si se considera conveniente, se pueden realizar a partir de las colonias presuntivas de Salmonella pruebas confirmativas bioqumicas y/o serolgicas
13-C-2. Presencia de Listeria monocytogenes (NF EN ISO 11290-1, 1997) Listeria es una bacteria ubicua que se encuentra principalmente en los pastos, desde donde contamina vegetales y animales y posteriormente alimentos. Por ser una bacteria psicotrofa y osmotolerante es capaz de multiplicarse en condiciones en las que otros microorganismos quedan inhibidos. El gnero Listeria incluye 7 especies, de las cuales la nica patgena para el hombre el L. monocytogenes. Caractersticas estructurales y fisiolgicas: 48
. Bacilos Gram positivos . Oxidasa negativos . Esculina positivos . Catalasa positivos . Fermentadores de la glucosa . Mviles . Sulfhdrico negativos Las distintas especies se pueden diferenciar por: . Hemlisis . Prueba de CAMP . Produccin de cido a partir de xilosa . Produccin de cido a partir de ramnosa Material Muestra Balanza de precisin Pipetas automticas de 1 y 0,1 ml caldo Fraser demi caldo Fraser Placas de Petri con medio Oxford Placas de Petri con medio Palcam Mtodo 1. Preenriquecimiento: Pesar 25 g del alimento en una bolsa de plstico estril y aadir 225 ml de caldo Fraser demi. Homogeneizar con el stomacher. Incubar la bolsa 24 horas a 30 C. 2. Enriquecimiento en medios lquidos selectivos: Aadir con pipeta estril, 0,1 ml de la muestra preenriquecida a un tubo con 10 ml de caldo Fraser e incubarlo a 37 C durante 24 horas. Los tubos que contienen Listeria se ponen de color negro. 3. Aislamiento en medios slidos selectivos: agitar el tubo de Fraser y realizar un agotamiento por estras en medio selectivos para Listeria (Oxford y Palcam). Incubar las placas a 37C durante 24-48 horas. Nota: Listeria crece en Palcam formando colonias pequeas, negras-grisceas, rodeadas de un halo negro y deprimidas en el centro. En Oxford las colonias de Listeria son verde grisceas, a veces con centro negro y rodeadas de halo negro y deprimidas en el centro.
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4. Confirmacin bioqumica: Para confirmar las colonias sospechosas como pertenecientes al gnero Listeria, se realizarn las siguientes pruebas: iluminacin de Henry (positiva), tincin de Gram (bacilo Gram positivo) y catalasa (positivo). Si las pruebas son positivas continuar la identificacin de la especie. L. monocytogenes es hemoltica, CAMP positiva, y fermenta la ramnosa, pero no la xilosa.
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Prctica 14: RECUENTO DE FORMAS VEGETATIVAS Y ESPORULADAS Algunas bacterias productoras de esporas (Bacillus, Clostridium) resisten algunos procesos de conservacin utilizados en la industria alimentaria en los que las formas vegetativas se destruyen y son causa de alteraciones. Tambin especies de estos gneros provocan enfermedades alimentarias.
14-A RECUENTO DE FORMAS VEGETATIVAS Material Muestra Balanza de precisin Pipetas automticas de 1 Placas de Petri estriles vacas PCA fundido para recuento en placa Mtodo 1. Aadir con pipetas estriles, a partir de las diluciones 10 -1 y 10 -2 1 ml/placa a placas de Petri vacas estriles. 2. Verter en cada placa unos 20 ml de medio PCA fundido y atemperado a 4550 C. 3. Incubar durante 24 h a 37 C. Recuento de placas en las que el nmero de colonias est comprendido entre 30 y 300. Tincin de Gram y de esporas de los distintos tipos de colonias.
14-B RECUENTO ANAEROBIAS
DE
FORMAS
ESPORULADAS
AEROBIAS
Material Muestra Balanza de precisin Pipetas automticas de 1 Placas de Petri estriles vacas PCA fundido para recuento en placa Medio Schaedler fundido para recuento en placa Jarra de anaerobiosis
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Mtodo 1. Calentar el tubo de muestra (dilucin 10 -1) a 80 C en el bao durante 10 minutos. Este tratamiento trmico destruye las formas vegetativas pero lo resisten las esporas. 2. Hacer una dilucin decimal en caldo de peptona del tubo previamente sometido a calor. 3. Aadir con pipetas estriles, a partir de las diluciones 10 -1 y 10 -2 1 ml/placa a placas de Petri vacas estriles. 4. Verter en cada placa unos 20 ml de medio PCA fundido y atemperado a 4550 C (para recuento de esporos aerobios) o de medio Schaedler fundido y atemperado a 45-50 C (para recuento de esporos anaerobios. En este caso aadir doble capa). 5. Incubar durante 24 h a 37 C. Las placas de anaerobios se incuban en una jarra de anaerobiosis. Recuento de placas en las que el nmero de colonias est comprendido entre 30 y 300. Comparacin con el recuento de aerobios mesfilos. Tincin de Gram y esporas.
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Prctica 15: ANLISIS MICROBIOLGICO DE LA CONTAMINACIN AMBIENTAL Y DE MANIPULADORES DE ALIMENTOS Los microorganismos se encuentran presentes en todos los ambientes: en el aire, en el agua, en la superficie de los objetos e incluso sobre nuestra piel. Cuando el tema a tratar es la microbiologa de alimentos, es importante determinar el grado de contaminacin ambiental, ya que las condiciones higinicas del lugar de trabajo (utensilios, superficies, etc.) y del propio manipulador van a influir en el nmero y tipo de microorganismos del alimento.
15-A ANLISIS DEL AIRE El aire, adems de partculas en suspensin, es portador de bacterias o sus esporas. Por ello, puede ser causa tanto de contaminacin de alimentos y superficies como de infecciones en el hombre (patologas respiratorias, etc.). Existen distintos mtodos para el anlisis del aire: sedimentacin, filtracin, choque en lquidos y precipitacin electrosttica, entre otros. En esta prctica vamos a explicar el primero, por ser uno de los mtodos ms empleados. El mtodo de sedimentacin en placa es uno de los ms sencillos para la determinacin de microorganismos del aire. A pesar de ello, los resultados obtenidos son orientativos de las cifras de microorganismos presentes en el aire, ya que estos niveles varan en funcin de las corrientes de aire y del tamao de las partculas en suspensin. Material Placas de PCA Mtodo 1. Destapar la placa de PCA en el lugar cuyo nivel de contaminacin se desee examinar durante diferentes intervalos de tiempo: 0,5; 1; 1,5 horas. 2. Tapar las placas e incubar durante 24-48 horas a 37 C. 3. Determinar el nmero de aerobios mesfilos totales ambientales.
15-B ANLISIS DE SUPERFICIES Para llevar a cabo una correcta manipulacin de los alimentos es necesario mantener una limpieza adecuada tanto en las superficies de trabajo como en los utensilios que
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hay que emplear. A no ser que los alimentos hayan sido esterilizados, todos los productos llevarn microorganismos. En la manipulacin, el envasado y el almacenaje de los alimentos, estos microorganismos deben mantenerse en todo momento en niveles que aseguren la calidad microbiolgica del alimento. El objetivo de los anlisis microbiolgicos de superficies es comprobar el estado higinico del lugar de trabajo, de modo que evitemos contaminaciones cruzadas durante el procesado de los alimentos. Existen distintos mtodos para el examen microbiolgico de las superficies: mtodo del hisopo, de la placa de contacto, de la jeringa de agar, de la lengeta (o pelcula pegajosa), etc. En esta prctica se describen el mtodo del hisopo (para el estudio de superficies no planas) y el de placa de contacto Rodac (para el estudio de superficies planas).
15-B-1. Anlisis de superficies no planas (mtodo del hisopo) Este sistema es el ms antiguo y el ms utilizado en el examen microbiolgico de superficies, ya que sirve para el anlisis tanto de superficies planas como no planas. Es especialmente recomendado para analizar superficies de aparatos y utensilios (mquinas picadoras de carne, cubiertos, etc.). Adems, se pueden estudiar superficies muy contaminadas, ya que a partir de la solucin salina estril es posible realizar las diluciones decimales precisas. Material Plantilla de papel de aluminio estril Hisopo estril 10 ml de solucin salina estril Placa de PCA y VRBG Mtodo 1. Delimitar la superficie que se va a analizar mediante una plantilla de papel de aluminio estril con una abertura de dimensiones conocidas (ej. 9 cm2). 2. Humedecer el hisopo estril en una solucin de 10 ml de solucin salina estril y restregar varias veces sobre la superficie delimitada por la plantilla. 3. Introducir de nuevo el hisopo en el tubo con solucin salina estril y dejar durante 15-30 min de manera que los microorganismos se liberen del algodn al caldo. 4. Sembrar 0,1 ml de dicho caldo en una placa PCA y VRBG. 5. Incubar durante 24-48 horas a 37 C. El resultado se expresa en ufc/9 cm2
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15-B-2. Anlisis de superficies planas por placas de contacto (RODAC: replicate organisms direct agar contact) Material Placas Rodac Medio PCA fundido y atemperado a 55C Mtodo 1. El medio PCA, una vez fundido y atemperado a 55C, se vierte en las placas de manera que sobresalga del borde de la placa para facilitar el contacto con la superficie a examinar. 2. Presionar suavemente la placa sobre la superficie elegida. 3. Incubar durante 24-48 horas a 37 C. La superficie delimitada por las placas es de 25 cm2, por lo que el resultado se expresa en ufc/25 cm2 Nota: el principal inconveniente de este mtodo es su ineficacia en superficies muy contaminadas y la posibilidad de no recuperar todos los microorganismos presentes en la superficie. Sin embargo, se obtienen buenos resultados en los casos en los que la carga microbiana es baja.
15-C ANLISIS DE MANIPULADORES Un alimento puede estar contaminado en su origen o bien puede ser el manipulador quien lo contamine durante el procesado. Consideramos normal que el manipulador tenga una abundante carga microbiana en su piel, pero nunca debern aislarse de ella bacterias patgenas o que indiquen poca higiene. Por lo tanto, resulta evidente la necesidad de que el manipulador mantenga unas perfectas condiciones de higiene durante el procesado de los alimentos. El objeto de un anlisis de manipuladores es comprobar que la persona que procesa el alimento no es una fuente de contaminacin de ste. Se pueden estudiar: manos, uas y fosas nasales. Material Hisopo estril Placa de VRBG y Agar Manitol Sal. Mtodo 1. Para realizar esta prctica el alumno no se lavar las manos. Pasar los dedos por la mitad de la superficie de una placa de VRBG.
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2. Lavarse las manos con un desinfectante y volver a pasar los dedos por la mitad restante de la placa. 3. Tomar con un hisopo estril muestra del interior de la nariz y sembrar el hisopo sobre la placa de Agar Manitol Sal. 4. Incubar durante 24 horas a 37 C. 5. Observar el crecimento de las colonias caractersticas en cada medio de cultivo: colonias violetas con halo del mismo color en el caso de Enterobacteriaceae en placas de VRBG y amarillas en el de Staphylococcus aureus en placas de agar manitol sal (Staphylococcus epidermidis y Staphylococcus saprophyticus dan lugar a colonias blancas).
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Prctica 16: UTILIZACIN DE LOS MICROORGANISMOS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA No todos los microorganismos son patgenos o alterantes, sino que algunos de ellos pueden ser aprovechados por el hombre en la fabricacin de diferentes productos. ste es el caso de las levaduras que se emplean por ejemplo, en la elaboracin del pan y bebidas alcohlicas como vino y cerveza. Tambin se utilizan bacterias en la fabricacin de productos lcteos, embutidos, etc. El objetivo de esta prctica consiste en comprobar la transformacin que algunos microorganismos llevan a cabo sobre diferentes materias primas para dar lugar a productos aprovechables para la alimentacin humana. Se propone la realizacin de dos tipos de fermentacin que se caracterizan por subproductos finales, de ah los nombres de fermentacin lctica y fermentacin alcohlica.
16-A PREPARACIN DE YOGUR La fermentacin lctica es producida por bacterias capaces de transformar azcares en cido lctico, disminuyendo de tal manera el pH del medio, que impiden el crecimiento de otros microorganismos. De este modo, la fabricacin de yogur y de otros productos lcteos fermentados tuvo su origen como un mtodo de conservacin de la leche. La leche fresca tiene un pH de aproximadamente 6,6. A este pH, la casena (protena de la leche) est formando una suspensin coloidal de caseinato clcico. Conforme las bacterias lcticas van fermentando los azcares, con produccin de cido lctico, el pH disminuye y, al llegar a 4,6 la casena se desnaturaliza y la leche se coagula formando un producto semislido, que es el yogur. Material 2 tubos estriles con 5 ml de leche pasteurizada yogur comercial Mtodo 1. Inocular uno de los tubos mediante el asa de siembra con el cultivo iniciador de la fermentacin procedente de un yogur comercial. El otro tubo no se inocula y queda como control.
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2. Incubar los dos tubos durante 16 horas a 46-48 C para favorecer el crecimiento de estas bacterias, ya que son termfilas. Nota: tambin se pueden incubar a 37 C durante 24 horas. 3. Comprobar que se ha producido una fermentacin lctica si la leche ha coagulado en el tubo inoculado. En el tubo control no inoculado se mantienen las caractersticas iniciales: la leche es lquida. 4. Mediante tincin de Gram se confirma la presencia de bacilos y cocos responsables de la fermentacin. En el tubo control no se observa ninguna bacteria.
Fermentacin lctica
16-A PREPARACIN DE CERVEZA La cerveza es el producto que se obtiene de una fermentacin alcohlica llevada a cabo por levaduras sobre distintos cereales: cebada, maz, arroz. Estos cereales contienen almidn que no es fermentable por levaduras, por lo que previamente debe ser hidrolizado a azcares ms sencillos: glucosa y maltosa. La harina de malta es la cebada germinada y contiene gran cantidad de amilasas, enzimas responsables de la hidrlisis del almidn. La activacin de estas enzimas se produce a 75 C, actuando
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sobre el almidn para romperlo en sus azcares fermentables. De esta forma, la levadura puede llevar a cabo la fermentacin alcohlica para dar Co2 y etanol. Material 2 tubos con harina de malta al 5% Saccharomyces cerevisiae Mtodo 1. Preparar en un vaso de precipitados una suspensin en agua de harina de malta al 5%. Es necesario mantener la suspensin en agitacin, ya que la harina no es perfectamente soluble en agua. 2. Llenar dos tubos de tapn de rosca prcticamente hasta el borde, de manera que se genere una atmsfera microaerfila. 3. Incubar los dos tubos durante 1 hora a 75 C para que se activen las amilasas y rompan el almidn. 4. Esterilizar en autoclave a 121 C durante 10 min para eliminar los posibles microorganismos presentes y asegurar que la fermentacin se debe nicamente a la levadura. 5. Una vez enfriados los tubos a temperatura ambiente, inocular uno de ellos con Saccharomyces cerevisiae mientras que el otro tubo no se modifica en absoluto (tubo control). Nota: el inculo se prepara resuspendiendo 29 mg de levadura en 1 ml de solucin salina estril. 6. Incubar los dos tubos a temperatura ambiente durante varios das. En funcin del inculo aadido vara el tiempo necesario para la produccin de la cerveza. 7. Solamente en el tubo que contiene la levadura se producir la fermentacin alcohlica, que se visualiza mediante la aparicin de burbujas de CO2. Nota: la cerveza as obtenida se puede filtrar y beber, aunque su sabor no es el de una cerveza comercial, ya que no se le ha aadido lpulo.
Fermentacin alcohlica
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PRUEBAS BIOQUMICAS
Prueba de la citocromo c oxidasa: Los citocromos son protenas que forman parte de algunas cadenas transportadoras de electrones, propias del metabolismo respirador. Esta prueba permite diferenciar bacterias como por ejemplo Enterobacterias (carecen del citocromo c) del gnero Pseudomonas (poseen citocromo c). Procedimiento: Aadir en un papel unas gotas del colorante tetrametil-pfenilendiamonio (incoloro). Coger con un palillo unas cuantas colonias aisladas en placa y mezclar con el colorante. El colorante se oxida rpidamente en presencia del citocromo c produciendo formas coloreadas (azul). Si la prueba es negativa no habr viraje (conviene utilizar controles positivo y negativo).
Prueba del indol: esta prueba se emplea para detectar la presencia de la enzima triptofanasa en las bacterias y nos permite distinguir E. coli (indol+) de los otros coliformes (indol-). Esta enzima degrada el aminocido triptfano a indol, que es el compuesto que se detecta en este ensayo. Procedimiento: inocular un caldo de triptona + NaCl al 0,5 % (este digerido de protenas animales es especialmente rico en triptfano) con una colonia. Incubar a 37 C durante 24 horas. Aadir el reactivo de Kovacs: si se produce un anillo de color rojo en la superficie del caldo, la prueba ser considerada positiva. El reactivo de Kovacs contiene p-dimetilaminobenzaldehido, que puede reaccionar tanto con el indol como con el triptfano, produciendo compuestos de coloracin rojiza. Para evitar la interferencia del triptfano, el p-
dimetilaminobenzaldehido est disuelto en alcohol isoamlico inmiscible en agua. A diferencia del triptfano, el indol es soluble en alcohol isoamlico, y por tanto, slo l reaccionar con el aldehdo produciendo el anillo coloreado. Galera API 10S: es una galera de varias pruebas bioqumicas simultneas que identificarn/confirmarn la enterobacteria que hemos aislado del producto alimenticio. Procedimiento: Aadir agua a la cmara de incubacin (5 ml aproximadamente). Coger 5 colonias y resuspender en 5 ml de agua destilada estril (esto da una turbidez aproximada de 0,5 en la escala de Mc Farland). Rellenar los pocillos del
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API (no la cpula) con una pipeta Pasteur. El smbolo significa que el pocillo ha de llenarse hasta arriba. El signo _ significa que hay que poner vaselina en la cpula del pocillo. Incubar a 37 C durante 24 horas. Lectura del API: hay que apuntar en una plantilla en qu pocillos la prueba correspondiente ha sido positiva o negativa (esto se sabe porque ha habido un cambio de color, la aparicin de un precipitado, etc.). La prueba de indol y la de fenilalanina necesitan reactivos apropiados (Kovacs y cloruro frrico
respectivamente). Una vez reveladas las pruebas hay que sumar los nmeros que hay debajo de los pocillos positivos en la plantilla. Como stos se encuentran agrupados de tres en tres, finalmente obtenemos una serie de nmeros o cdigo que nos permitir identificar la bacteria.
Prueba de CAMP: Permite distinguir la especie de Listeria que hemos aislado, ya que L. monocytogenes potencia la -hemlisis producida por S. aureus, mientras que L. innocua no. Procedimiento: sembrar en una placa de agar sangre una estra vertical de una cepa beta-hemoltica de S. aureus. En una de las dos mitades, sembrar las cepas control de dentro hacia fuera (sin llegar a tocar la estra central) en dos estras perpendiculares a la estra de S. aureus. En la otra mitad, sembrar una estra de la muestra. Incubar a 37 C durante 24 horas. Si la cepa aislada es CAMP positiva, se observar una potenciacin de la hemlisis en la zona de interseccin, con forma en punta de flecha.
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Prcticas de Microbiologa de Alimentos (1 ITA)

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS (Guin de Prcticas)

1 INGENIERO TCNICO AGRCOLA INDUSTRIAS AGRARIAS Y ALIMENTARIAS

Prcticas de Microbiologa de Alimentos (1 ITA)

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Prcticas de Microbiologa General

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Prcticas de Microbiologa de Alimentos

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RECUENTO DE FORMAS VEGETATIVAS RECUENTO DE FORMAS ESPORULADAS AEROBIAS Y ANAEROBIAS

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15-A 15-B 15-C

ANLISIS DEL AIRE ANLISIS DE SUPERFICIES ANLISIS DE MANIPULADORES

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