Con una previa verificacin de las normas de seguridad e identificacin del material a utilizar, se comprob empricamente que la medicin

de volumen en diferentes aparatos del laboratorio varan de precisin. Para comenzar, se calcul en un vaso de precipitado 50 y 100 mL de agua destilada, que posteriormente fue trasvasado a un baln aforado de 50 y 100 mL respectivamente, se observ que el nivel alcanzado por el agua no es congruente con el volumen medido inicialmente, ya que ste qued por debajo de la lnea de aforo; Tabla No. 1. datos experimentales del nivel alcanzado por el agua destilada medidos en el vaso de precipitado y baln aforado VASO DE PRECIPITADO 50mL 100mL

BALON AFORADO 35mL 90mL

por otro lado, se midi en una probeta de 100 mL un volumen de agua destilada de 50 y 100 mL, al trasegar stos a un baln aforado, se contempl que los volmenes no se conservaban como inicialmente se haban tomado; algo importante a resaltar es que la probeta es un instrumento de medicin que permite evaluar volmenes de una manera ms acertada que los vasos de precipitado pero esto no quiere decir que sea uno de los mejores implementos al momento de necesitar un volumen determinado. Tabla No. 2. altura del agua destilada obtenida en la probeta, comparada con el baln aforado PROBETA 50mL 100mL BALON AFORADO 49mL 99mL

CROMATOGRAFIA LIQUIDA (HPLC) DE CAFEINA EN COCA-COLA

a b

DETERMINACION
c

johana.feijoo@correounivalle.edu.co, bcindy.idarraga@ correounivalle.edu.co, c katherine.mina@correounivalle.edu.co Facultad de Ciencias Naturales y exactas; Dep. Qumica; Universidad del valle Cali, Colombia. 21-03-2013 RESUMEN: Para el desarrollo de la prctica, se realiz un estudio previo acerca de las normas de seguridad en el laboratorio, el manejo y reconocimiento de los instrumentos, con el propsito de evitar errores o accidentes en su ejecucin. Tambin, se determin experimentalmente el punto en el que la reaccin entre el cido (HCl) y la base (Na(OH)) alcanza la neutralizacin, utilizando como solucin indicadora la fenolftalena.

JOHANA FEIJOO , CINDY IDARRAGA , KATHERINE MINA(1324777)

1. DATOS Con una previa verificacin de las normas de seguridad e identificacin del material a utilizar, se comprob empricamente que la medicin de volumen en diferentes aparatos del laboratorio varan de precisin. Para comenzar, se calcul en un vaso de precipitado 50 y 100 mL de agua destilada, que posteriormente fue trasvasado a un baln aforado de 50 y 100 mL respectivamente, se observ que el nivel alcanzado por el agua no es congruente con el volumen medido inicialmente, ya que ste qued por debajo de la lnea de aforo; Tabla No. 1. datos experimentales del nivel alcanzado por el agua destilada medidos en el vaso de precipitado y baln aforado VASO DE PRECIPITADO 50mL 100mL

La determinacin experimental del contenido de cafena en una bebida de coca cola por HPLC se llevo a cabo utilizando el mtodo de curva de calibracin, la cual se preparo a partir de una solucin de cafena a una concentracin de 300 ppm, de esta solucin stock se tomaron cinco alcuotas (tabla No. 1) llevadas a un matraz aforado de 25 mL y enrasando con fase mvil de metanol: agua 50:50. Las anteriores soluciones estndares se pasaron por filtros de tamao de poro de 0.45 m antes de inyectar al cromatgrafo. Tabla No. 1. Datos experimentales en la preparacin de las soluciones estndares. VOLUMEN CONCENTRACION ALICUOTA (ppm) (mL) 1.0 12 2.0 24 3.0 36 4.0 48 5.0 60 Por su parte para la preparacin de la muestra problema fue necesario inicialmente desgasificar la bebida de coca cola por 10 minutos en un equipo de ultrasonido. De la solucin desgasificada se tomo 15 mL y se adiciono a un matraz volumtrico de 25 mL enrasando con metanol puro. Posteriormente de la solucin anteriormente preparada se tomo una alcuota de 15 mL y se enraso en un matraz de 25 mL, esta vez utilizando como solvente la fase mvil (metanol: agua 50:50). La solucin anterior esta se filtro empleando el mismo procedimiento mencionado para la preparacin de estndares. Con las soluciones anteriormente preparadas y filtradas se procedi a realizar

BALON AFORADO 35mL 90mL

por otro lado, se midi en una probeta de 100 mL un volumen de agua destilada de 50 y 100 mL, al trasegar stos a un baln aforado, se contempl que los volmenes no se conservaban como inicialmente se haban tomado; algo importante a resaltar es que la probeta es un instrumento de medicin que permite evaluar volmenes de una manera ms acertada que los vasos de precipitado pero esto no quiere decir que sea uno de los mejores implementos al momento de necesitar un volumen determinado. Tabla No. 2. altura del agua destilada obtenida en la probeta, comparada con el baln aforado PROBETA 50mL 100mL BALON AFORADO 49mL 99mL

la lectura por cromatografa liquida de alta resolucin (HPLC) utilizando las condiciones mencionadas en la tabla No. Tabla No. 2. Condiciones operacionales en el cromatgrafo. Metanol: agua Fase Mvil 50:50 Flujo 1 mL/min. Columna Hypersil ODS Detector UV 243 nm. Los resultados obtenidos en funcin de rea y concentracin para las soluciones estndares se encuentran tabuladas en la tabla No. 3. Las medidas instrumentales determinadas en el cromatograma fueron realizadas por triplicado tanto para las soluciones estndares como para las muestras problemas. Tabla No. 3. Respuestas instrumentales para las muestras estndares.
CONCENTRACION (ppm)

solucin estndar, se determino las respuestas instrumentales para las muestras problemas (Tabla No.4). Tabla No. 4. Respuestas instrumentales para las muestras problemas.
MUESTRA PROBLEMA coca cola coca cola coca cola AREA (mAU.s) PROMEDIO DE AREAS (mAU.s)

628.55261 643.34088 634.6270533 631.98767

2. CALCULOS Y RESULTADOS

Segn los resultados obtenidos y de acuerdo a la tabla No. 3 se realiz una curva de calibracin de promedio de reas vs. Concentracin de cafena en las soluciones estndares, determinando la pendiente y el intercepto con sus correspondientes desviaciones estndar e intervalos de confianza. (Grafica No. 1).

AREA (mAU.s)

PROMEDIO DE AREAS (mAU.s)

1200 1000

12 12 12 24 24 24 36 36 36 48 48 48 60 60 60

143.99207 144.43535 144.3991633 144.77007 433.67084 433.63998 432.3736067 429.81 683.69055 695.40332 693.37919 701.0437 1052.7361 1009.3666 1042.59497 1065.6823 1136.8943 1134.9181 1135.95223 1136.0443

AREAS (mAU.S)

800

600

400

200

10

20

30

40

50

60

CONCENTRACIN (ppm)

Grafica No. 1. Curva de calibracin de rea vs concentracin (ppm).

[ Una vez determinado las respuestas instrumentales para cada muestra de

La desviacin estndar de la regresin o desviacin estndar residual fue determinada a partir de la ecuacin [1].

estndar de la pendiente y el respectivamente.

intercepto

Donde n corresponde al nmero de datos utilizados para la realizacin de la curva de calibracin (5) y Syy y Sxx se determinaron a partir de las ecuaciones 1.1 y 1.2.

En los intervalos de confianza la letra t corresponde a una constante que se determina dependiendo del nmero de grados de libertad y el porcentaje al cual se desea el intervalo de confianza. Por lo tanto, t para 3 grados de libertad y un 95% de confianza, t correspondi a 3.18.

Tabla No. 5 Parmetros de linealidad determinados a partir de la curva de calibracin. PARAMETRO PENDIENTE INTERCEPTO COEFICIENTE DE CORRELACIO N (R) R2 VALOR 21.61 mAU.s/ppm -88.26 mAU.s 0.9714 0.9437 DESVIACION ESTANDAR 1.846 mAU.s/ppm 73.48 mAU.s

Y corresponde al eje y de la curva de calibracin (promedio de reas) x a la concentracin de cafena en las soluciones estndares. Reemplazando los valores obtenidos en la ecuacin 1 se encontr que la desviacin estndar de la regresin fue de 70.06 mAU.s.

A su vez tambin se determin la pendiente (b) e intercepto (a) con sus respectivas desviaciones estndar y sus intervalos de confianza al 95%.

Con la ecuacin de la curva de calibracin se determino la concentracin de cafena en la muestra problema de Coca-Cola (Ec. 6), utilizando para ello el factor de dilucin empleado y posteriormente se analizo estadsticamente los resultados obtenidos.

[ En las ecuaciones mostradas anteriormente y hacen referencia a la desviacin

[

]
]

m correspondi al nmero de veces a la cual se ley la seal instrumental para la muestra problema la cual fue de 3 debido a que se realizo por triplicado y n fue el nmero de datos con los que se realizo la curva de calibracin. Por tanto la desviacin estndar de la de la concentracin de cafena en la muestra problema de Coca-Cola fue de 51.54 ppm y su intervalo de confianza determinado a travs de la ecuacin 8 fue de 163.9081

El objetivo de la practica experimental fue conocer las normas de seguridad para una buena practica de laboratorio, adems observar y Manejar diferentes instrumentos de laboratorio para la manipulacin de lquidos y por medio de anlisis se determino cual era mas preciso al momento de realizar una medida. en este caso se concluyo el instrumento mas impreciso y con muy mala exactitud es el vaso de precipitado, ya que el menisco no se logra ver bien. asimismo que los instrumentos para medir volmenes con mayor precisin son el matraz aforado, ya que posee un cuello estrecho; de modo que un pequeo cambio de volumen del liquido provoque una considerable diferencia en la altura del menisco; consecuentemente, el error cometido al ajustar el menisco es muy pequeo; tambin que la probeta es un instrumento con el cual se puede medir volmenes muy pequeos con exactitud ya que contiene una medida gradual en mL muy pequea y al final se determino que la pipeta es un instrumento de mayor precisin que la probeta ya que a pesar de que pueden medir proporciones iguales; esta ultima es un instrumento que permite medir volmenes con menor precisin mientras en comparacin con la otra se puede medir proporciones de lquido con bastante precisin pues tiene una llave la cual deja salir el volumen no deseado, contando con un margen de error de una gota al final de la misma

As mismo se determinaron el lmite de deteccin como la concentracin mnima de analito que produce una seal que fue significativamente diferente del blanco. Para ello se utilizo la Ec. 9 donde k es una constante que fue definida arbitrariamente. Limite de deteccin (LD) (3 ) y cuantificacin (LC) (10

De tal manera, el limite de deteccin y cuantificacin fueron de 9.725 y 32.42 ppm respectivamente. 3. ANALISIS DE RESULTADOS

El objetivo de la practica experimental es la determinacin cuantitativa de cafena en una

muestra de coca cola utilizando el mtodo de la curva de calibracin realizada a partir de soluciones estndares de solucin patrn de cafena. Para la separacin cromatogrfica se va a utilizar un cromatgrafo de lquidos que consta de una bomba de alta presin de dos pistones, una vlvula de inyeccin con un bucle de 20 l, una columna C18 y un detector de ultravioleta visible. Los datos cromatogrficos fueron procesados a travs de una interfase por un software que contiene un programa de integracin. La tcnica de HPLC es utilizada normalmente en la industria para la separacin de componentes en una mezcla, para aislar compuestos deseados en extractos naturales, al igual que la identificacin y cuantificacin de compuestos desconocidos, tambin se utiliza en investigacin para el desarrollo de nuevos frmacos y el aislamiento de productos naturale

s con importante actividad en diversas enfermedades. Para poder llevar a cabo el anlisis mediante HPLC de cafena en COCA COLA, se debi desgasificar como primera medida la bebida, para esto, se utiliz el ultrasonido. Posterior a la desgasificacin, se prepar soluciones de cafena de concentracin conocida, las cuales se filtraron en un filtro de tamao de poro de 0.45 m para eliminar partculas solidas presente en la solucin, tambin se preparo una solucin de muestra problema de coca cola disuelta en una solucin de etanol: metanol. Con las soluciones preparadas, se determin el contenido de cafena en la muestra problema gracias a la interaccin de los componentes que tena la

muestra con la fase mvil y la fase estacionaria. La fase mvil utilizada fue una mezcla 50:50 de metanol-agua y la fase estacionaria fue de polmero de silica el cual se encontraba recubierto con cadenas laterales C18 hidrofbicas. Debido a la fuerte interaccin entre la cafena y la fase estacionaria, el primer pico observado se debe fundamentalmente a azucares que se encontraban interactuando fuertemente con la fase mvil, como se muestra en la figura xxxxxxxx. Los resultados experimentales obtenidos y la concentracin de cafena en la muestra de coca cola con un 92.92 ppm de concentracin arrojo un 4.34% de error segn el valor terico de mg reportado para una coca cola clsica 350 mL, cuyo valor es 34.0 mg[1] y su correspondiente valor en ppm fue de 97.14 ppm. Estos errores experimentales se deben principalmente a la preparacin de las muestras estndares de la curva de calibracin cuya relacin entre las variable fue pequea debido al coeficiente de correlacin obtenido. Adems debido a que la desviacin estndar obtenida para la concentracin de la muestra problema determinada por triplicado fue tan amplia se determino entonces que los datos no fueron reproducibles, esto debido a que si todos los datos fueran idnticos la desviacin estndar de la concentracin de cafena de la muestra problema hubiera sido cero. Por lo tanto, los resultados obtenidos de cafena en la muestra problema no fueron tan reproducible debido a que la concentracin de la muestra pudo cambiar desde que se recogi hasta que se efectuaron los respectivos anlisis.

Por otra parte la desviacin estndar residual determinada fue tambin significativamente grande lo que indico una menor asociacin lineal entre el rea de pico y la concentracin de cafena en cada solucin estndar. La determinacin de la desviacin estndar residual tambin es una medida para determinar la variabilidad promedio de los datos observados con relacin a la recta de regresin, adems este valor tambin es directamente proporcional a la desviacin de la pendiente y el intercepto que fueron igualmente significativamente grandes, lo que indico que la preparacin de la curva de calibracin tuvo inmerso varios errores experimentales especficamente en la preparacin de las muestras estndares como se menciono anteriormente. 4. SOLUCION AL CUESTIONARIO 1. Defina claramente cromatografa lquida en fase normal y en fase reversa? Cuales son las aplicaciones de la cromatografa en fase normal? LC en fase reversa: en este tipo de cromatografa lquida, la fase estacionaria es no polar, con frecuencia un hidrocarburo y la fase mvil es un solvente relativamente polar, por ejemplo agua, metanol, acetonitrilo o tetrahidrofurano (THF) [x]. En LC en fase reversa, la fuerza motriz de la retencin, no es la interaccin favorable del soluto con la fase estacionaria, si no el efecto del disolvente de la fase mvil que empuja al soluto hacia adentro de la capa [x] hidrocarboncea enlazada . LC en fase normal: en la cromatografa de fase normal, el componente menos polar se eluye primero; al aumentar la polaridad de la fase mvil ocasiona una disminucin del tiempo de elucin. Por el contrario, en la

cromatografa de fase inversa, los componentes ms polares aparecen primero y un aumento de la polaridad de la fase mvil, incrementa el tiempo de elucin. La cromatografa en fase normal, es ampliamente utilizada para la separacin de componentes en una mezcla, segn las caractersticas qumicas de cada uno de ellos. Es utilizada en la industria para la separacin, en muchos campos de la ciencia y para la sociedad en general, algunos ejemplos, es la separacin de aminocidos, protenas, cidos nuclicos, hidrocarburos, carbohidratos, frmacos, terpenoides, plaguicidas, antibiticos, esteroides, especies organometlicas entre otros. 2. Cules son los recubrimientos ms comunes de la fase estacionaria empleada en HPLC y cual es la metodologa ms empleada para enlazar fases a la superficie de silica? Normalmente, los recubrimientos mas utilizados para HPLC son los C8 cadena noctilo o una cadena C18 n-octildecilo, tambin se utilizan las cadenas C4. Los rellenos utilizados normalmente de la fase normal unida qumicamente, R en la cadena de slice, son grupos funcionales polares, como el caso de los grupos ciano C2H4CN, diol C3H6OCH2CHOHCH2OH, amino C3H6NH2 y los dimetilamino C3H6N(CH3)2. Algunos de estos grupos polares, se unen qumicamente al final de las cadenas C4 C8 o C18, aunque el costo de estos recubrimientos con los grupos polares es mucho mas elevado que los comnmente utilizados C18. 3. Nombre 3 analitos que pueden ser analizados tanto por HPLC como por cromatografa de gases? Cul de los dos mtodos empleara usted?

Por las dos tcnicas mencionadas, pueden ser analizados aminocidos, alcoholes de bajo peso molecular, compuestos orgnicos de bajo peso molecular, sin embargo la tcnica que se emplea con mayor frecuencia es HPLC, aunque esta eleccin depende de varios motivos, la naturaleza de la mezcla a separar y de los costos. HPLC es una tcnica mejor que la GC debido a que puede separar compuestos que sean voltiles o termolbiles, esta tcnica utiliza solventes econmicos a comparacin de gases costosos como el helio y el hidrogeno utilizados en cromatografa de gases, sin embargo algunos de los solventes utilizados en HPLC son de alto costo. 4. Explique porque en el HPLC realizar la cuantificacin con curva de calibracin es precisa mientras que en CG es aconsejable realizarla con el uso de un patrn interno. La tcnica de HPLC es precisa, debido a que el inyector de la muestra es un rizo de muestreo el cual controla el volumen de muestra que se adiciona, por ejemplo, durante la prctica experimental, se adicion cantidades de aproximadamente 50 L, y el inyector tuvo la capacidad de tomar 20 L para llevar a cabo cada determinacin. Esta cantidad es reproducible para cada medida, por lo cual no es necesaria la presencia de un patrn estndar como en GC, puesto que en esta tcnica, se necesitaban corregir los volmenes adicionados, debido a la mala inyeccin o imprecisin en la medida del volumen de muestra. Algunos equipos de HPLC contienen un automuestrador, el cual tiene la capacidad de recolectar muestras con volmenes exactos y reproducibles que no se desvan del volumen fijo, estos equipos aunque son de costo mayor por el

automuestreador, arrojan un anlisis mas preciso.