UNIVERSIDAD AUTONOMA DE GUADALAJARA FACULTAD DE CIENCIAS QUMICO-BIOLGICAS BIOTECNOLOGA

PRACTICA 1. COMPARACION DE LA RESPIRACIN Y LA FERMENTACIN OBJETIVO. El alumno analizar y distinguir el comportamiento de una levadura cuando su metabolismo se desarrolla bajo condiciones aerobias y bajo condiciones anaerobias, relacionando los resultados de la produccin de biomasa con la eficiencia en cada proceso. INTRODUCCION. Las levaduras son microorganismos eucariotes ubicuos encontrados en diversos ambientes naturales. Esta capacidad de colonizacin est relacionada con su alta adaptabilidad fisiolgica. Las rutas metablicas entre diferentes especies de levaduras son bsicamente idnticas, sugiriendo la conformacin de un grupo metablicamente homogneo. Sin embargo, los mecanismos para la toma de nutrientes, el nmero de diferentes isoenzimas, y sobretodo la regulacin de fermentacin y respiracin difieren sustancialmente. En las levaduras, como otros organismos heterotrficos, el metabolismo de la energa y el carbono estn ntimamente interconectados, es decir, el anabolismo est acoplado al catabolismo. El ATP provee la energa para toda clase de trabajo celular y es provisto por la oxidacin de molculas orgnicas que tambin sirven como fuente de carbono para la biosntesis. En la naturaleza, las diferentes especies de levaduras utilizan un espectro de fuentes de carbono, tales como polioles, alcoholes, cidos orgnicos, aminocidos, pero prefieren los carbohidratos. Enfocando la atencin sobre la levadura Saccharomyces cerevisiae, es un microorganismo facultativo que emplea la respiracin aerobia al igual que la fermentacin alcohlica para metabolizar la glucosa como fuente de energa y de carbono. La glucosa inicialmente es transformada a travs de la gliclisis hasta la formacin de piruvato, el cual es un punto de ramificacin del flujo metablico, dependiendo de la presencia o no de oxgeno. En la presente prctica, se tiene como objetivo que el alumno determina la cantidad de biomasa producida, la velocidad de consumo de glucosa y formacin evidente de metabolitos bajo condiciones de aerobiosis y anaerobiosis, para establecer la diferencia del crecimiento de la levadura.

MATERIAL. Medio de extracto de malta Glucosa Agua destilada Levadura seca Solucin de azul de metileno 0.01% Solucin de DNS

Microscopio de campo claro Microscopio de contraste de fases Hematocitmetro Pipeta Pasteur Tubos de vidrio Etanol Bao mara Termmetro

METODOLOGIA. Medio de cultivo. 1.- Prepare 1 matraz erlenmeyer de 500 mL con 50 mL de medio extracto de malta 2.- Prepare 1 matraz erlenmeyer de 125 mL con 50 mL de medio extracto de malta 3.- Preparacin del medio extracto de malta: pese 35 g de extracto de malta, 20 g de glucosa, disolver el extracto de malta y la glucosa en 1 L de agua destilada. 4.- Esterilizar en un tubo de ensayo 10 mL de agua destilada 4.- Colocar el medio en los matraces y esterilizar por calor. Suspensin de levadura. 1.- Pesar 0.5 g de levadura seca y adicionar a 10 mL de agua destilada en un tubo de ensaye, mezclar hasta obtener una suspensin uniforme. 2.- Realizar conteo en cmara de Neubauer 3.- Anotar la cuenta de levaduras y calcular el nmero de clulas por mL. Incubacin. 1.- Tome uno de los matraces y transfiera 1 mL de suspensin de levaduras, etiquete como fermentacin y coloque en una incubadora a 30C. 2.- Tome el segundo matraz y transfiera 1 mL de suspensin de levaduras, etiquete como respiracin y coloque en una agitadora a 30C y 200 rpm. 3.- Realice observaciones en 1 hora, 12 horas y 24 horas. Tome muestre en cada matraz y gurdelos en refrigeracin. 4.- Determine el nmero de levaduras para cada muestra. 5.- Determine la cantidad de glucosa en cada muestra. Conteo de levaduras. A la muestra de 1 mL con levaduras adicionar 0.1 mL de azul de metileno y homogenizar. De la solucin homognea, colocar una alcuota en el hematocitmetro y realice el conteo al microscopio. En el apndice 1 encontrar informacin acerca del uso del hematocitmetro o de la cmara de Neubauer. 1. Verifique que el microscopio est alineado, y en su caso haga la correccin necesaria. 2. El conteo se realiza en 5 cuadros grandes, considerando que estos formen una cruz. 3. Realice el clculo del nmero de clulas/mL.

Determinacin de glucosa. La determinacin de glucosa se realiza utilizando el mtodo del DNS (apndice 2). 1) Diluir la muestra, calculando que la concentracin de glucosa se encuentre en el rango de 0 a 1 mg/mL de glucosa. Anotar dilucin. 2) Tomar un alcuota de 0.5 mL de muestra diluida, si es el caso 3) Agregar 1.5 mL de solucin de DNS y agitar 4) Calentar en agua hirviendo por 5 minutos 5) Aforar a 10 mL adicionando 8 mL de agua destilada y homogeneizar 6) Dejar enfriar y leer absorbancia en el espectofotmetro a 550 nm, calibrando con el blanco. 7) Interpolar lectura en la curva patrn para determinar la concentracin de glucosa.

CUESTIONARIO 1.- Cul es el papel del azul de metileno en la tincin de levaduras? 2.- Qu es fermentacin desde el punto de vista bioqumico? 3.- Cuntas y cules son formas de reproduccin tiene Saccharomyces cerevisiae? 4.- Explique cmo se coloca la muestra para el conteo en la cmara de Neubauer 5.- Qu es respiracin celular? 6.- Dnde se obtiene mayor biomasa, en la respiracin o en la fermentacin? Explique por qu 7.- La tcnica del DNS es til para cuantificar sacarosa, por qu 8.- Qu es la gluclisis? 9.- Qu es el catabolismo? 10.- Durante los experimentos que desarroll, Saccharomyces cerevisiae realiz anabolismo, explique.

REPORTE. Realice un reporte por equipo que contenga: Titulo de la prctica, objetivo, introduccin breve, metodologa, resultados, discusin, conclusin, bibliografa. Como gua puede utilizar el formato de cualquier artculo cientfico.

APENDICE 1. CUANTIFICACION DE LEVADURAS OBJETIVO. El alumno cuantificar levaduras mediante la tcnica de conteo directo al microscopio. CONTEO EN CMARA DE NEUBAUER. La cmara de Neubauer es una cmara de conteo que se utiliza para determinar el nmero de clulas.

Figura 1. Cmara de Neubauer. Para utilizar la cmara de Neubauer realice el siguiente procedimiento: Limpie la cmara y la laminilla de cuarzo suavemente con alcohol. Revise la laminilla de cuarzo que no debe estar desbordada o quebrada. Coloque la laminilla de cuarzo sobre la cmara en forma vertical, esta debe quedar centrada. Proceda a llenar la cmara. Este paso es muy importante y definitivo en la distribucin de las clulas. Es recomendable llenarla con micropipeta pequea o con una jeringa ya que la cmara se llena con una gota. El llenado debe ser continuo en un solo intento. La cmara no puede quedar seca esto se detecta porque en las esquinas del recuadro de llenado se ven porciones secas. Tampoco se debe inundar, la apariencia en la cmara es de lquido abundante en las terminaciones del recuadro. Para el conteo: Lleve la cmara al microscopio y enfoque el cuadro de conteo con el ocular de 4X. Al hacerlo observar en el campo una imagen parecida a la figura 2.

Figura 2. Cmara de Neubauer en 4X Si las clulas que va a contar son pequeas como son las levaduras, bacterias, etc., ubicarse en la cuadricula central y pasar al ocular de 10X. Se visualizar de la siguiente manera:

Figura 3. Cmara de Neubauer en 10X En esta cuadricula se visualizan 25 cuadros, de los cuales se cuentan las clulas presentes en 5 campos, generalmente se cuentan los cuadros de las esquinas y el central, lo que garantiza un conteo aleatorio. Para realizar el conteo se pasa al ocular de 40X, donde se visualiza cada uno de los campos y con ayuda de el carro del microscopio se desplaza la cuadricula hasta contar en todos los cuadros. El conteo en estos campos de la cmara de conoce como AP (alto poder). Con el lente de 40X cada cuadro se ve de la siguiente manera:

Figura 4. Cmara de Neubauer en 40X Las clulas se cuentan cuadro por cuadro y se hace un total. Se recomienda realizar el conteo siguiendo las flechas para evitar que se cuenten las clulas dos veces o no que no se cuenten. Alrededor de cada cuadricula se observa que hay tres lneas que delimitan el cuadro, que son fundamentales en el momento del conteo ya que definen cuales clulas son contables o cuales estn fuera del campo de conteo. Las clulas que no tocan la segunda lnea son contables, si la tocan o estn encima de ella no se incluyen. Grficamente se puede apreciar la forma correcta de conteo. Las clulas que tiene una X son las que no se deben contar.

Figura 5. Conteo en cmara de Neubauer.

 Despus de contar las clulas se procede a calcular el nmero de clulas por unidad de volumen. Para esto se utiliza el rea de cada cuadro, el espacio ocupado por el lquido en el que estn las clulas que es el mismo espacio que hay entre la cuadricula de la cmara y la laminilla de cuarzo. La cmara de Neubauer tiene las siguientes dimensiones, y su profundidad es de 0.1 mm. Las suspensiones celulares deben ser diluidas lo suficiente para que las clulas u otras partculas no se sobrepongan, y deben estar uniformemente distribuidas. Para clulas pequeas se recomienda contar cuatro esquinas 1/25 mm2 y el cuadro del centro. Por ejemplo, si se cuentan 187 clulas en los cinco cuadros descritos. Cada cuadro tiene un rea de 1/25 mm2, y 0.1 mm de profundidad. El volumen total en cada cuadro es de (0.04x0.1 = 0.004) 0.004 mm3. Si se contaron 5 cuadros, entonces se tiene un volumen de 0.02 mm3. Por lo tanto, se tienen 187 clulas en 0.02 mm3, que equivale a 9350 clulas/mm3. Hay 1000 mm3 en 1 cm3, por lo que la cuenta es de 9 350 000 cluals/mL. Para fines prcticos, si se cuentan 5 cuadros como los indicados anteriormente: Clulas/mL = Total de clulas contadas * 50000 Para determinar el nmero de clulas en la muestra original hay que multiplicar por la dilucin.

METODOLOGIA. A la muestra de 1 mL con levaduras adicionar 0.1 mL de azul de metileno y homogenizar. De la solucin homognea, colocar una alcuota en la cmara de Neubauer y realice el conteo al microscopio.

APENDICE 2. DETERMINACION DE AZUCARES REDUCTORES POR DNS OBJETIVO: Determinar el contenido de azcares reductores en mosto fermentado mediante el uso del cido 3,5-dinitrosaliclico (DNS) mediante espectroscopia visible. INTRODUCCION El mtodo del cido 3,5-dinitrosaliclico (DNS) se basa en la reduccin del DNS (de color amarillo) al reaccionar con un azcar reductor para formar cido 3-amino-5nitrosaliclico (de color rojo ladrillo), cuya presencia puede detectarse por lectura de la absorbancia en la zona de 540-570 nm.

MATERIALES. DNS (cido 3,5-dinitrosaliclico) Fenol Sulfito de sdio Hidrxido de sodio Agua destilada 2 Vasos de precipitado de 600 mL 1 Matraz aforado de 100 mL 1 Matraz aforado de 1 L Tubos de ensaye Espectrofotmetro Pipetas volumtricas de 1 mL Pipeta volumtrica de 2 mL Pipeta volumtrica de 5 mL PROCEDIMIENTO. Preparacin de la solucin de DNS. 1) Pesar 1 g de hidrxido de sodio y disolverlo en 70 mL de agua destilada en un matraz Erlenmeyer con agitacin. CUIDADO EL HIDRXIDO DE SODIO IRRITA LA PIEL. 2) Pesar 1 g de DNS y adicionar por porciones a la solucin de hidrxido de sodio con agitacin, para lograr una disolucin rpida y completa. 3) Esperar a que la solucin se enfri a temperatura ambiente 4) Pesar 0.2 g de fenol y adicionar a la solucin anterior con agitacin. 5) Pesar 0.05 g de sulfito de sodio y adicionar a la solucin anterior con agitacin. 6) Una vez que todo este bien disuelto y mezclado, transferir cuantitativamente a un matraz aforado de 100 mL y aforar con agua destilada. Homogeneizar la solucin.

7) Guardar la solucin en un frasco mbar para proteger de la luz. Preparacin de curva patrn. 1) Preparar una solucin estndar de 1 mg/mL de glucosa 2) Preparar una serie de tubos con las cantidades indicadas en el cuadro siguiente: Tubo Nmero 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Concentracin Glucosa (mg/mL) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 mL de Solucin Estndar 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 mL de agua destilada 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0

3) Tomar una alcuota de 0.5 mL de la solucin de glucosa para cada dilucin 4) Agregar 1.5 mL de solucin de DNS y agitar 5) Calentar en agua hirviendo por 5 minutos 6) Aforar a 10 mL adicionando 8 mL de agua destilada y homogeneizar 7) Dejar enfriar y leer absorbancia en el espectofotmetro a 550 nm, calibrando con el blanco. Preparacin de muestras. 1) Diluir la muestra si el contenido de azcares reductores es mayor a 1 mg/mL, para que se encuentre en el rango de 0 a 1 mg/mL de glucosa. Anotar dilucin. 2) Tomar un alcuota de 0.5 mL de muestra diluida, si es el caso 3) Agregar 1.5 mL de solucin de DNS y agitar 4) Calentar en agua hirviendo por 5 minutos 5) Aforar a 10 ml adicionando 8 mL de agua destilada y homogeneizar 6) Dejar enfriar y leer absorbancia en el espectofotmetro a 550 nm, calibrando con el blanco. Clculos 1) Con las lecturas de la curva patrn hacer una regresin lineal de concentracin de glucosa contra absorbancia y calcular la ecuacin de regresin lineal correspondiente. 2) Sustituir el valor de absorbancia de la muestra en la ecuacin de regresin y calcular la concentracin de azcares reductores expresados como glucosa. Al dato obtenido multiplicarlo por la dilucin.