Técnicas de hibridación

 La hibridación es la unión complementaria de ácidos nucléicos (ADN o ARN). Técnicas de

hibridación se utilizan a menudo para detectar una molécula diana partiendo de una sonda
complementaria a ella, también se usan habitualmente en el diagnóstico de enfermedades, la
identificación de microorganismos patógenos, el estudio de perfiles de expresión génica, la
localización de genes en cromosomas o de ARNm en tejidos (hibridación in situ) o en la
comparación de especies hibridando su ADN.

Se parte de dos poblaciones de ácidos nucléicos: un conjunto homogéneo de ácidos nucléicos de

secuencia conocida que actúa como sonda y otro conjunto heterogéneo de ácidos nucléicos de
secuencia desconocida donde queremos detectar la secuencia diana. Una de ellas debe estar
marcada. Si lo está la sonda, la hibridación es estándar. Si lo está la diana, la hibridación es
reversa. Los ácidos nucléicos de partida son de cadena sencilla, bien procedentes de ADN clonado
y fragmentado por enzimas de restricción, bien oligonucleótidos sintéticos. Durante la hibridación
se produce la unión de las moléculas diana con las moléculas sonda. Esta unión depende de la
complementariedad de bases. Así, aumentando la fuerza iónica (por ejemplo, la concentración de
cloruro sódico NaCl) o disminuyendo la temperatura se permite la hibridación aunque existan
algunas bases no complementarias.

Reacción en cadena de la polimerasa

Kary Mullis en los años ochentas, hace posible estudio y análisis de una amplia gama de genes.
Permite producir un enorme número de copias de una secuencia de DNA específica (amplificarla),
sin recurrir a la clonación.

El método se basa en las características de la estructura química del DNA y su replicación

semiconservartiva. Las dos cadenas de DNA se separan fácilmente cuando las uniones hidrógeno
de las bases se rompen. Esto se realiza cuando una solución de DNA es calentada entre 77 y 100ºC.
Las bases complementarias se reasocian espontáneamente para formar la doble hélice cuando la
temperatura desciende. Este proceso de renaturalización se denomina alineamiento. La facilidad
con la cual la doble hélice puede separarse y reasociarse es crucial para las funciones biológicas
del DNA.

El PCR implica varios ciclos de síntesis in vitro del DNA dirigida por un oligonucléotido iniciador. Las
secuencias de los oligonucleótidos iniciadores se determinan en base a una parte conocida de la
secuencia de DNA molde, ya que deben ser complementarias a cada una de las cadenas del DNA,
dejando libres los lados opuestos para poder ser amplificados. Dichos oligonucleótidos sirven
como iniciadores para la síntesis in vitro del DNA, la cual es catalizada por la DNA polimerasa.

Básicamente, cada ciclo de PCR consiste de tres etapas:

1. DNA es incubado entre 92 y 98ºC de 30 a 90 segundos, para separar las cadenas
complementarias, desnaturalización del DNA y así hacerlas accesibles al apareamiento con
el iniciador específico.
2. Alineamiento o hibridación, la mezcla de reacción es enfriada para permitir que los
oligonucleótidos iniciadores se alineen o hibriden las secuencias complementarias del DNA
blanco.
3. La reacción de extensión, llevada a cabo a una Tº intermedia en la cual la DNA polimerasa
copia el DNA entre las secuencias correspondientes a los oligonucleótidos iniciadores.
Componentes de la reacción:
1. DNA polimerasa purificada de bacterias Thermus aquiaticus.
2. DNA molde.
3. Oligonucleótidos sintéticos iniciadores.
4. dNTPs, las concentraciones mínimas de estos disminuyen el índice de incorporación
errónea de los nucleótidos, mientras que concentraciones altas disminuyen la
especificidad de la reacción.

Una de las principales ventajas del PCR es su alta sensibilidad, la que se transforma en desventaja,
ya que puede amplificarse cualquier DNA contaminante no deseado.

Southern blot
El Southern Blot es una  técnica que permite la identificación de secuencias específicas de DNA, 
mediante el uso de electroforesis en gel y de hibridación utilizando sondas especificas. Para
analizar una muestra de DNA cromosomal ésta debe ser previamente fragmentada, por ejemplo
utilizando  sonicación ó enzimas de restricción.

Los fragmentos obtenidos se separan,  de mayor a menor tamaño mediante una electroforesis en
gel de agarosa. Una vez terminada la electroforesis y sin teñir el gel, los fragmentos de DNA  se
traspasan a un filtro de nitrocelulosa ó a una membrana de nylon.

A continuación, el filtro se incuba con una sonda marcada, específica para la secuencia que se
desea identificar. Esta sonda es una secuencia de ácido nucleico, DNAds ó RNAm, que reconocerá
a la secuencia de DNA inmovilizada en el filtro, a través del reconocimiento de secuencias
complementarias de ácidos nucleicos.

El traspaso de las muestras desde el gel al filtro es una etapa esencial, porque el reconocimiento
de bases complementarias entre sonda y secuencias de DNA en el gel es muy ineficiente.

Northen blot

El Northern Blot es una técnica muy similar al Southern Blot que  permite la identificación de
secuencias específicas de RNA.

La muestra de RNA a analizar no requiere fragmentación y se somete a electroforesis en geles de

agarosa, donde las moléculas de RNA se separan desde mayor a menor tamaño.

Una vez terminada la electroforesis, y sin teñir el gel, los fragmentos se traspasan a un filtro de
nitrocelulosa ó a una membrana nylon, luego el filtro se incuba con una sonda marcada, específica
para la secuencia que se desea identificar.

Esta sonda es una secuencia de ácido nucleico, por ejemplo cDNA, que reconocerá a la secuencia
de RNA inmovilizada en el filtro, a través del reconocimiento de secuencias complementarias de
ácidos nucleicos.

El nombre de la técnica deriva por analogía al Southern Blot.

 Hibridación in situ

Técnicas para identificación de proteínas

Western blot

El Western Blot o Inmunoblot es una técnica que permite la identificación de polipéptidos

específicos, básicamente de una manera análoga al Southern y Northern Blot, con la diferencia
que ésta técnica utiliza 2 sondas.

La muestra de proteínas se somete a una electroforesis denaturante en gel de poliacrilamida

(Fig.1). Después de la electroforesis, y sin teñir el gel, los polipéptidos se traspasan a un filtro de
nitrocelulosa.

Las etapas que siguen a continuación son las siguientes:

·         Bloqueo del filtro con una proteína que no presente reconocimiento con las sondas que
se utilizarán. Para ésto se utiliza generalmente la proteína BSA (albúmina de suero bovino)
ó caseína

·         Incubación del filtro con la primera sonda, que es un anticuerpo específico para la
proteína que se desea identificar

·         Incubación con la segunda sonda, que es un anticuerpo que se encuentra marcado, y que
es específico para reconocer al primer anticuerpo

·         Revelado, según la marca que tenga el segundo anticuerpo. Por ejemplo, si la marca del
segundo anticuerpo es una enzima, como la peroxidasa ó la fosfatasa, el revelado ocurre a
través de la actividad enzimática, la que al generar un producto coloreado, permite la
identificación de la proteína específica

Inmunohistoquímica
Las técnicas de inmunohistoquímica (IHQ) permiten la identificación, sobre muestras tisulares o
citológicas, de determinantes antigénicos característicos de distintas líneas de diferenciación y
funcionalismo celular. La aplicación directa de anticuerpos policlonales o monoclonales sobre
secciones tisulares permite la localización microanatómica de su expresión y su correlación con los
parámetros morfológicos, aumentando la sensibilidad y especificidad del estudio y
proporcionando información adicional esencial en muchos casos.

En las últimas décadas la utilización de IHQ ha sido progresivamente creciente y se ha consolidado

como tecnología esencial en el diagnóstico patológico de rutina. En general y muy especialmente
en patología oncológica, son cada vez más las patologías cuyo diagnóstico y clasificación requiere
IHQ. La incorporación de nuevos protocolos de recuperación antigénica y la afluencia constante de
nuevos anticuerpos están ampliando notablemente el ámbito de aplicación con nuevas utilidades
en diagnóstico y pronóstico.

La IHQ requiere una metodología de laboratorio muy distinta de la del laboratorio clásico de
anatomía patológica y, para su correcta utilización, es indispensable conocer en profundidad sus
ventajas y limitaciones. Es fundamental disponer de una amplia batería de anticuerpos que
permita trabajar con paneles amplios protocolizados y actualizados. La elección de un panel de
anticuerpos inapropiado o excesivamente limitado puede llevar a conclusiones insuficientes o
erróneas. El panel inicial de estudio debe elaborarlo el patólogo en función de la clínica y del
estudio morfológico previo y, siempre que sea posible, debe incluir distintos anticuerpos para cada
una de las líneas de diferenciación que se investigan.

El personal técnico y médico debe estar específicamente entrenado en el manejo y evaluación de

los distintos anticuerpos y disponer de información apropiada acerca de su sensibilidad y
especificidad, del método de evaluación de resultados y de su posible trascendencia clínica. La
interpretación debe efectuarse siempre conjuntamente con el contexto clínico y los hallazgos
morfológicos.

Es importante conocer las posibles causas de falsos positivos y falsos negativos con los distintos
anticuerpos y seguir una sistemática escrupulosa de controles negativos y positivos en cada
proceso de laboratorio. Los anticuerpos de nueva incorporación requieren siempre un enfoque
crítico y cauto en las pimeras fases de utilización ya que la presunta especificidad y sensibilidad
inicial puede modificarse al acumular experiencia y publicaciones.

Un aspecto elemental, pero esencial, es la preservación del tejido desde el momento de su

obtención. La inmensa mayoría de técnicas de IHQ pueden aplicarse a tejido fijado e incluido en
parafina con buenos resultados, siempre que la fijación tisular, su procesado e inclusión se realicen
correctamente. La utilización de métodos o reactivos inapropiados en el tratamiento tisular previo
a la IHQ determina pérdidas de antigenicidad que limitarán o impedirán la obtención de resultados
fiables.