Recuento de micropartículas

¿Qué son las micropartículas plasmáticas?

• Fragmentos celulares.
• Apoptosis o activación.
• Antes considerados debris
celular.
• 0.1 um - < 1.5um
• Se diferencian de exosomas (40-
100 nm) y cuerpos apoptoticos
(>1.5um)
• Hematies, células del endotelio,
plaquetas y globulos blancos.
Importancia de su cuantificación
• Células liberan MP posiblemente revertir proceso apoptotico,
escapaar fagocitos, enviar “señales” a los fagocitos o células cercanas.
• Aumento en diferentes tipos de enfermedades.
• Solo como estudio.
• Dificil cuantificación.
Preanalitica
• Punción no traumática
• Aguja 21G a menos.
• Descartar los primeros 3 mL
• No se recomienda EDTA ni Heparina.
• Anticoagulante de elección citrato: CTDA, menos activación de PMP
• No aceptar muestras hemolizadas o con coágulos.
• Procesar lo antes posible, preferentemente dentro de 1 hora de
colectada la muestra.
PFP: 1era centrifucación.
1550g x 20 min.
Centrifugación.
T° ambiente (20-25°C)

2da centrifucación: Pellet de microparticulas.

Trabajar PFP dentro de las 4 horas.
Se puede almacenar -80°C

Protocolos de 3 a más centrifugaciones a partir de PRP.

Pueden realizarse lavados del pellet. NO excederse.
NO hay concenso.
Cuantificación: Citometria de flujo
• El método más usado.
• No ayuda a medir el tamaño de
las MP
• MP > 300 nm
• Beads o plaquetas como
estándar.
• Disminuir contaminación
ultrafiltrando liquido de sistema.
Cuantificación: Citometria de flujo

• Marcaje:
• Annexin V: PS
• Plaquetas: CD41+, CD62P+,
CD61+, Pac1+.
• Megacariocitos: CD62P-
• Hematíes: CD235a
• Leucocitos: CD14, CD4, CD8,
CD66b
• Células endoteliales: CD144,
CD146
Cuantificación: Elisa

• Mismo anticuerpos usados en

citometría.
• Resultados en U/ml
• Las MP capturadas pueden ser
detectadas/cuantificadas por una sonda
secuandaria(anticuerpo-peroxidasa)o
usando la propiedad funcional de la MP(
acción procoagulante)
• Interferencia con antígenos solubles.
• Podría ser usado en apliaciones clínicas.
• Desarrollo de métodos alternativos.
Nuevos métodos: impedance based flow
cytometry
• Usa el principio de impedancia
de Coulter.
• Mide simultaneamente los
cambios de impedancia electrica
y la fluorescencia.
• Pulso proporcional al volumen.
• Calibrado con microesferas de
poliestireno.
• El tamaño de detección depende
de la celda de flujo. 0.3 um
Nuevos métodos: AFM

• Atomic force microscopy

• Sensa la superficie de la muestra con un
tip de silicona <100 A diametro
• Cantilever: 100–200 μm largo.
• El detector mide la desviacion del
cantilever.
• Se generan imagenes topograficas 3D de
la superficie
• Cuantificación de MP usando un
software de procesamiento de
imágenes.
• Proceso demora unas 2 horas
Otros métodos
• Microscopia electronica.
• MIcrocopia confocal de
fluorescencia
• Cromatografía liquida de alta
resolución.
• Espectrofotometría de masas.
• Movimiento browniano de
particulas en solución: DLS y
NTA.
Gracias!!