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captura. Esta línea es un control de que el

PRÁCTICA Nº 5. PRUEBA ensayo ha funcionado bien, porque se colorea
INMUNOCROMATOGRÁFICA PARA EL siempre, independientemente si la muestra es
DIAGNÓSTICO DEL EMBARAZO positiva o negativa (Figuras 3a y 3b).

Introducción

Para el diagnóstico temprano del embarazo se

emplean rutinariamente ensayos que permiten
detectar la presencia de la hormona
Gonadotropina Coriónica humana (hCG) en
muestras de suero u orina. La hCG es una
hormona que normalmente es producida por
las células de la placenta de las mujeres
embarazadas. En embarazos normales los
niveles de hCG aumentan de 5 a 50 UI/L en la
primera semana del óvulo fecundado, llegando
a alcanzar un valor promedio de 100 UI/L el
primer día de pérdida del período. Al final del
primer trimestre del embarazo los niveles
máximos de la hCG oscilan entre 100.000 a
200.000 UI/L.

Fundamento de la inmunocromatografía

La Inmunocromatografía se basa en la
migración de una muestra a través de una
membrana de nitrocelulosa. La muestra es
añadida en la zona del conjugado, el cual está
formado por un anticuerpo específico contra
uno de los epítopos del antígeno a detectar y
un reactivo de detección. Si la muestra
contiene el antígeno problema, éste se unirá al
conjugado formando un complejo inmune y
migrará a través de la membrana de Principio del funcionamiento de la prueba
nitrocelulosa. De lo contrario, migrarán el rápida para el diagnóstico temprano de
conjugado y la muestra sin unirse a lo largo de embarazo en orina
la membrana de nitrocelulosa.
La zona de captura está formada por un HeberFast Line® Embarazo II es un ensayo
segundo anticuerpo específico contra otro cualitativo rápido, de un paso, para la
epítopo del antígeno. Al llegar la muestra a detección de la hCG en orina. Se basa en la
esta zona, los complejos formados por la unión tecnología de la cromatografía acoplada al uso
del antígeno y conjugado quedarán retenidos y de anticuerpos monoclonales específicos
la línea se coloreará (muestras positivas). En contra la hCG y oro coloidal como marcador. El
el caso contrario las muestras son negativas. ensayo detecta la hormona hCG intacta, en
La zona control está formada por un tercer concentraciones que permiten detectar un
anticuerpo que reconoce al reactivo de posible embarazo, desde el primer día de
detección. Cuando el resto de muestra alcanza amenorrea, en un tiempo rápido, entre 5 a 10
esta zona, el anticuerpo se unirá al conjugado minutos.
libre que no ha quedado retenido en la zona de
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Al introducir uno de los extremos de la tira puede dejar la tira sumergida en la muestra
reactiva en la orina, la muestra comienza a hasta que finalice el tiempo de incubación.
desplazarse en su interior reaccionando la 4. Incubar por 5 minutos. Finalizado este
hCG con el conjugado de anticuerpo tiempo, interpretar los resultados. No leer los
monoclonal marcado con oro coloidal, por resultados después de los 10 minutos.
tanto, se forma un complejo antígeno- 5. Una vez culminado el ensayo, descartar
anticuerpo. Este complejo se desplaza hacia la apropiadamente la muestra de orina.
ventana de resultados de la tira reactiva y
reacciona con un segundo anticuerpo
monoclonal anti-hCG fijado a la fase sólida,
esto hace que se forme una primera línea
horizontal coloreada (LÍNEA POSITIVA). En
ausencia de hCG en la muestra problema no
se forma esta LÍNEA POSITIVA. Así mismo, el
exceso de conjugado no atrapado sigue
moviéndose y es capturado en una zona por
encima de esta, formándose una segunda
línea horizontal coloreada (LÍNEA CONTROL),
como demostración de que los reactivos
funcionan apropiadamente. Esta LÍNEA
CONTROL siempre debe formarse tanto en
muestras que contengan hCG como en las
negativas.

Materiales, equipos y reactivos:

- Muestras de orina
- Tiras reactivas

Método

1. Esperar a que las muestras de orina y Cuestionario:

las bolsas con las tiras reactivas estén a
temperatura ambiente. 1. ¿Cuáles son las principales ventajas y
2. Abrir cuidadosamente la bolsa de desventajas de las pruebas rápidas?
aluminio mediante un corte lateral, para luego 2. ¿Qué tipo de muestras se pueden
extraer la tira reactiva, sosteniéndola por el emplear en una inmunocromatografía?
extremo coloreado, evitando manipular las tiras 3. ¿Para qué se utilizan las pruebas
reactivas por el extremo marcado con las rápidas de inmunocromatografía?
flechas.
3. Sumergir el extremo de la tira marcado
con las flechas (ver la figura) en la muestra de
orina, evitando que el nivel de orina sobrepase
la línea señalada con las flechas. Mantener la
tira introducida de forma vertical en la muestra
por un tiempo de 15 segundos. Al finalizar este
tiempo sacar la tira de la muestra y colocarla
en una superficie plana. Opcionalmente, se
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Las muestras de suero que contienen

PRÁCTICA Nº 6. DETERMINACIÓN DE anticuerpos específicos anti-Toxoplasma
ANTICUERPOS ANTI- Toxoplasma gondii
POR HEMOAGLUTINACIÓN PASIVA gondii reaccionan con hematíes sensibilizados
con antígenos solubles del parásito,
Fundamento de la técnica de aglutinación: provocando su aglutinación (formación de una
malla).
Se denomina aglutinación a la interacción
secundaria in vitro de un antígeno particulado
(por lo general células) con su anticuerpo
específico. Cuando la molécula antigénica con
la que interacciona el anticuerpo específico no
forma parte de la estructura nativa de la
partícula, sino que se incluye artificialmente en
su superficie, la aglutinación que tiene lugar se
denomina genéricamente aglutinación pasiva
o indirecta. Los soportes utilizados pueden
ser inertes como partículas de látex o glóbulos
rojos, cuando se emplea el segundo soporte el
método recibe el nombre de
hemoaglutinación pasiva o indirecta. Estas
metodologías son ampliamente utilizadas en el Significado Clínico:
laboratorio clínico para la detección serológica
de anticuerpos en diferentes patologías  Una muestra considerada como
infecciosas. positiva, indica que el paciente está o
estuvo en contacto con el parásito
 Una muestra negativa o ausencia de
Fundamento del método:
aglutinación demuestra que el paciente
no está o estuvo en contacto con el
Se basa en la propiedad que tienen los
parásito.
anticuerpos anti-T gondii de producir
aglutinación en presencia de glóbulos rojos
sensibilizados con antígenos citoplasmáticos y
de membrana del parásito. El empleo de
Materiales y reactivos:
ambos tipos de antígenos incrementa la
sensibilidad del método permitiendo la
detección precoz de la infección. Tanto la Materiales Reactivos
presencia de anticuerpos heterófilos como la
-Placa de micropozos -Buffer fosfato salino (PBS)
aparición de IgM, características del período -Micropipetas (1-200 pH 7,2
agudo de la parasitosis, se investigan µL) -Células sensiblizadas
empleando tratamiento con 2 mercaptoetanol -Células No sensibilizadas
(2 ME) y eritrocitos no sensibilizados para -Suero control positivo
control y absorción de heterofilia. Los -Suero control negativo
anticuerpos heterófilos se absorben con
eritrocitos no sensibilizados. En los sueros de
Método:
pacientes con infección aguda se observa una
caída del título en por lo menos 2 diluciones
1. Identificar una hilera de la placa de
comparado con los mismos sueros sin tratar
micropozos para cada paciente y para los
con 2 ME.
respectivos controles (6 pozos).

2. Preparar las diluciones seriadas desde 1:2
hasta 1:64 de la siguiente manera:
agregar 25 µL de solución buffer del pozo
1 al 6, en el pozo 1 agregar 25 µL del
suero, transferir 25 µL del pozo 1 al 2,
mezclar y repetir el procedimiento hasta el
pozo 6, en este pozo descartar 25 µL.
3. Adicionar 25 µL de las células no
sensibilizadas (previamente
resuspendidas con movimientos de
frotación) a los pozos 1 y 2.
4. Agregar 25 µL de las células
sensibilizadas (previamente
resuspendidas con movimientos de
frotación) al resto de los pozos (3 al 6).
5. Mezclar, colocando la placa sobre un
rotador o apoyándola sobre el mesón para
darle ligeros golpes con el dedo.
6. Tapar la microplaca e incubarla a
temperatura ambiente entre 1 a 2 horas.
7. Observar la reacción de los sueros
problema y compararlo con los sueros
controles.
8. Las muestras con título mayor o igual a
16 (es decir, que presentan
hemoaglutinación), se consideran
positivas y se reportan. Las muestras
que presenten aglutinación en las células
sensibilizadas (hasta la dilución 1/64) y
botón en las no sensibilizadas, se
procesan de nuevo, aumentando las
diluciones hasta obtener la mayor dilución
del suero que muestre aglutinación.
Las muestras que presentan aglutinación
en los pozos para las células no
sensibilizadas (1 y 2) y para las
sensibilizadas (3 al 6), deben ser
sometidas a un proceso de absorción con
glóbulos rojos no sensibilizados, para
eliminar los anticuerpos heterófilos.
A fin de determinar una primoinfección
reciente deben procesarse 2 muestras
tomadas con un intervalo de 2-3
semanas. Un aumento de título mayor de
2 diluciones entre la 1ra y 2da muestra
indican infección recientemente
adquirida.
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Absorción de los anticuerpos heterófilos:
1. Mezclar con suavidad el frasco
identificado como absorbente (es una
suspensión al 10% de glóbulos rojos no
sensibilizados) o el de células no
sensibilizadas.
2. En un tubo de 12x75 mm, mezclar
volúmenes iguales del suero y de las
células absorbentes
3. Tapar el tubo, mezclar bien y dejar en
reposo a temperatura ambiente entre 2-
24 horas.
4. Centrifugar durante 5 minutos.
5. En un vial, separar el sobrenadante y
procesar de nuevo siguiendo el protocolo
de la prueba de descarte.
6. Los sueros deben presentar un botón en
el pozo de las células no sensibilizadas
como indicativo de absorción efectiva. La
reacción en las células sensibilizadas,
dependerá de la presencia o ausencia
de anticuerpos específicos para los
antígenos de Toxoplasma gondii.
Cuestionario:
1. ¿Cuál es la importancia de esta práctica
como futuros licenciados en Bioanálisis?
2. ¿Qué son células sensibilizadas y no
sensibilizadas y cuál es su utilidad?
3. ¿Qué son los anticuerpos heterófilos?
4. ¿Qué importancia tiene detectar
anticuerpos contra Toxoplasma gondii de
tipo IgG en pacientes con VIH?
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