Inmunodetección de proteínas

Cuantificación de proteínas
Cuantificación de proteínas
Cuantificación de proteínas
Cuantificación de proteínas
 Producción de anticuerpos monoclonales

1
2

3
 Inmunoensayos

•Anticuerpo: proteína producida como

respuesta a una sustancia “invasora”
(extraña).
•Antígeno: sustancia extraña que se trata de
combatir.
•Los inmunoensayos son pruebas que
utilizan reacciones antígeno-anticuerpo que
con la ayuda de un marcador generan una
señal medible.
 ELISA (Configuración Sandwich)

Incoloro Amarillo
Ej.
pNPP

pNPP – para-Nitrofenol Fosfato & lMax = 405 nm

Voet D., Voet J. G., & Pratt C. W; Fundamentals of Biochemistry; 1 st Ed; John Wiley & Sons, Inc; U.S.A; 1999; p. 98
 Enzimoinmunoensayos
Enzimas más usadas como marcadores:

Generación de la señal:
a. Colorimétrica

b. Fluorimétrica

c. Quimioluminiscente

d. Electroquímica (potenciométrica, voltamétrica o amperométrica)

 2H2O + D 4- metilumbeliferilferona + P
HRP AP
H2O2 +DH2 4- metilumbeliferilfosfato

Ag Ratas (ELISA HRP) Ag Ratas (INMUNOHISTOQUÏMICA AP)

2H2O + D 4- metilumbeliferilferona + P
HRP AP
H2O2 +DH2 4- metilumbeliferilfosfato

Anti conejo

Conejo anti rata

Ag Ratas (ELISA HRP) Ag Ratas (INMUNOHISTOQUÏMICA AP)

 2H2O + D 4- metilumbeliferilferona + P
HRP AP
H2O2 +DH2 4- metilumbeliferilfosfato

Ag Ratas (ELISA HRP) Ag Ratas (INMUNOHISTOQUÏMICA AP)

2H2O + D 4- metilumbeliferilferona + P
HRP AP
H2O2 +DH2 Anti conejo 4- metilumbeliferilfosfato
Anti cabra

Conejo anti rata

Cabra anti rata
Ag Ratas (ELISA HRP) Ag Ratas (INMUNOHISTOQUÏMICA AP)
 MARCADORES FLUORESCENTES EMPLEADOS
EN INMUNOENSAYOS
Marcador ex./nm em./nm /ns
Isotiocianato de
492 516-525 4.5
fluoresceina (FITC)
Derivado diclorotriazínico
492 516-525 4.5
de aminofluoresceina (DTAF)
Umbeliferona (U) 325 465
4-metil-U 325 450
Tetrametilrodamina
535-545 570-580 1-3
isotiocianato (TRITC)
Rodamina-B
545-560 585 3
isotiocianato (RBITC)

O O OH
O O OH

HO O O
COOH
COOH
U
CH 3
Cl N NH
N=C=S
N N
Cl HO O O
FITC DTAF
4-metil-U
H3C CH 3
O N H3CH 2C CH 2CH 3
N CH 3
H3C N O N
H3CH 2C CH 2CH 3

O
C O O
C O

N=C=S
N=C=S

TRITC RBITC

-21-
 Amplificación de señal

Fig 1A: A directly conjugated primary antibody binds specifically to the protein of interest
(antigen); Fig 1B: Multiple conjugated secondary antibodies bind to each primary antibody,
amplifying signal; Fig 1C: Further signal enhancement is achieved by using a biotinylated
secondary antibody, followed by a conjugated streptavidin.
 Amplificación de señal

Fig 1A: A directly conjugated primary antibody binds specifically to the protein of interest
(antigen); Fig 1B: Multiple conjugated secondary antibodies bind to each primary antibody,
amplifying signal; Fig 1C: Further signal enhancement is achieved by using a biotinylated
secondary antibody, followed by a conjugated streptavidin.
Amplificación de señal
 ELISA

•Técnica basada en la detección de la proteína

mediante la utilización de anticuerpos.
•Se han desarrollado múltiples variantes de
ensayos ELISA:

“ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas”

Lector de ELISA y Microplaca
 ELISA Directo

Es el tipo de ELISA más sencillo y rápido, el anticuerpo primario

marcado con una enzima se unirá directamente al antígeno de interés
permitiendo la detección del mismo.

lavado lavado

El antígeno se inmoviliza en
la placa. Se añade el anticuerpo primario Se agrega el sustrato y se convierte en
marcado que se unirá al un producto coloreado gracias a la
antígeno de interés. enzima; la intensidad del color es
proporcional a la cantidad del
antígeno de interés.
 ELISA Indirecto

En este tipo de ELISA se utilizan 2 anticuerpos: uno primario y otro

secundario, este último estará conjugado con una enzima.

lavado lavado lavado

Se añade el anticuerpo
El antígeno se Se añade el anticuerpo Se agrega el sustrato para
secundario marcado que se
inmoviliza en la placa. primario que se unirá al generar la señal visible, la
unirá al anticuerpo
antígeno de interés. primario. intensidad del color es
proporcional a la cantidad de
anticuerpos primarios.
 ELISA Sándwich
El antígeno queda atrapado entre 2 anticuerpos, uno de captura
(anticuerpo primario) y uno de detección (anticuerpo secundario
marcado con una enzima).

lavado lavado lavado

Se agrega el sustrato para

El anticuerpo primario
se inmoviliza en la
placa.
Se añade el antígeno de
interés que se unirá al
anticuerpo primario.
Se añade el anticuerpo
generar la señal visible, la
secundario marcado que se
intensidad del color es
unirá al antígeno.
proporcional a la cantidad de
antígeno de interés.
 ELISA Competitivo

Es utilizado cuando el antígeno de interés es tan poco que no se va a

notar su presencia, se adiciona una proteína conocida marcada para que
genere la señal visible.

lavado lavado o

El anticuerpo primario Se agrega el antígeno de Se agrega el sustrato. Entre más colorida sea la muestra, más
se inmoviliza en la interés y la proteína proteína marcada contiene y por ende, menos antígeno de interés.
placa. marcada. Si la muestra es menos colorida, significa que se unió una mayor
cantidad del antígeno de interés.
Nelson D. L. & Cox M. M; Lehninger Principles of Biochemistry, 3 rd Ed; Worth Publishers ; U.S.A; 2000; p. 232
 Western Blot
Técnica inmunológica en sólido, rápida y muy sensible basada en la
especificidad de reconocimiento entre antígeno y anticuerpo de la
interacción PROTEÍNA-PROTEÍNA.

1. Separación por 2. Transferencia cuantitativa

SDS-PAGE Electroforesis e irreversible a membrana de
PVDF/NYLON
proteínas

proteínas

3. Incubación con los 4. Revelado

Anticuerpos
SUSTRATO
2dario proteína H
H
interés
R proteína R
PRODUCTO
interés
P P
1ario
 Western Blot

A B C D E

Placa teñida con rojo de

Ponceau Sistema de transferencia
WESTERN BLOT
Resultado
SDS-PAGE

SDS-PAGE Western BLOT

Western BLOT

Todas Proteína
las de interés
proteínas

El Western Blot detecta la presencia o ausencia de anticuerpos, el

resultado se informa como negativo ante la ausencia total de bandas y
positivo en el caso contrario.
WESTERN CUANTIFICABLE
 Inmunoprecipitación

Es un método que permite el aislamiento de proteínas (o complejos

proteicos) de una muestra biológica a partir del aprovechamiento de la
afinidad antígeno-anticuerpo.
Sus principales aplicaciones son:
● enriquecimiento de proteínas en muestra para permitir la detección de
proteínas que se encuentren en menor cantidad
● aislar o detectar proteínas de interés
● estudiar las interacciones proteína-proteína y/o complejos
proteicos
● identificar proteínas desconocidas dentro de un complejo
● verificar la presencia de proteínas en un tejido específico
 Inmunoprecipitación
Pasos principales para la inmunoprecipitación
● Selección de anticuerpo
● Incubación de la muestra con el anticuerpo para la
proteína de interés
● Separación del complejo proteína-anticuerpo del
resto de la muestra
● Análisis de la muestra obtenida

Electroforesis
INMUNOPRECIPITACIÓN
 Inmunoprecipitación

Inmunoprecipitación usando perlas de sefarosa

INMUNOPRECIPITACIÓN
INMUNOPRECIPITACIÓN PDK1

A
AC
IRS PI3K

A
AC PDK2
IRS

A
AC
IRS PI3K

A
AC
IRS
 Inmunohistoquímica

¿Qué es?
Es una técnica utilizada para identificar la presencia de
antígenos específicos en tejidos o células basándose en la reacción
antígeno-anticuerpo
¿Cómo lo hace?
Mide la expresión proteica utilizando anticuerpos específicos
marcados con una enzima que se unen a la proteína que
necesitas identificar.
¿Qué la hace diferente de las otras técnicas?
Se realiza en cortes de tejido y te dice exactamente en qué parte de
la célula se encuentra tu proteína de interés.
Inmunohistoquímica
 2. Inclusión
Su propósito es sustituir el agua del tejido por un medio líquido capaz de solidificar la
muestra que le de la consistencia adecuada para poder realizar el corte de tejido.
 3. Corte

El taco ahora puede cortarse en secciones delgadas.

La mayoría de las preparaciones para microscopia óptica tienen un grosor de 3 a 10

micrómetros,estos cortes se realizan con un microtomo.
 4. Montaje método directo

1. El corte se fija en un portaobjetos y se deshidrata.

2. Incubó con anticuerpo primario

3.Se adiciona el sustrato Genera fluorescencia

 4. Montaje método indirecto

1. El corte se fija en un portaobjetos y se deshidrata.

2. Incubó con anticuerpo primario

3.Incubó con anticuerpo secundario marcado con la enzima. (Se

pega al anticuerpo primario)

4. Se adiciona el sustrato Genera fluorescencia

Ejemplos de micrografías
 INMUNOHISTOQUIMICA

(Gp:) N-myc/CD56 Rat neurons Inmunofluorescencia