¡Bienvenidos!

DIAGNOSTICO DEL VIH

PRUEBAS DE TAMIZAJE

ENZIMOINMUNO ENSAYO (ELISA)

INMUNOCROMATOGRAFIA (PRUEBAS RÁPIDAS)

PRUEBAS CONFIRMATORIAS

WESTERN BLOT
INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA
INMUNOENSAYO EN LINEA
PCR ADN CUALITATIVO
 PRUEBAS DE LABORATORIO

• Métodos Directos:
Evidencian/cuantifican
la presencia de
antígenos en la
muestra.
• PCR cualitativa,
• PCR cuantificada
• cultivo y aislamiento
viral,
• antigenemia P-24)
 PRUEBAS DE LABORATORIO

• Métodos Indirectos:
• Evidencian la
presencia o ausencia
de anticuerpos totales
en la muestra.
• Son los más utilizados.
• Pruebas rápidas
• ELISA
 DIAGNÓSTICO DE VIH

 Se usan dos niveles de prueba :

 Pruebas de Tamizaje: serológicas
 Ensayos inmunoenzimáticos
 Test de aglutinación
 Test de detección rápida
 Tienen alta sensibilidad.
 La posibilidad de tener falsos negativos es bajo.
 Pruebas rápidas disponibles en el mercado

Multispot
HIV-1/HIV-2

Uni-Gold
Recombigen

OraQuick
Advance

Reveal
G2
 INMUNOCROMATOGRAFÍA

Flujo lateral en el dispositivo

Control
Antígeno
de VIH

- CORE HIV
PRINCIPIO: Flujo a lo largo de un dispositivo

Añadir
Línea de Línea de
Muestra Conjugado control
prueba

Anticuerpos a IgG Oro Coloidal Antígeno de VIH Anticuerpos Anti-

conjugado a IgG/Oro coloidal
Anticuerpos a VIH
antígeno de VIH
 PRINCIPIO: Flujo a lo largo de un dispositivo

Banda De Prueba Banda Control

* La muestra fluye a lo largo de la membrana y los anticuerpos
anti-VIH (si están presentes) se unen al antígeno de VIH
conjugado al oro coloidal formando una banda roja visible.
* Los anticuerpos anti-IgG/Oro Coloidal en la línea control se
une a cualquier partícula de Oro coloidal no unido formando
una banda roja visible.
 PROCEDIMIENTO

PASOS A SEGUIR:

1. Kit a Temperatura ambiente

2. Abrir la bolsa individual y extraer el test

3. Codificación del test

4. Añadir dos gotas de suero, plasma o sangre total en

el pocillo marcado como A

5. Añadir cinco gotas de buffer en el pocillo B

6. Lectura e interpretación a los 15 minutos

C T A B
 INTERPRETACION

C T A B

REACTIVO

C T A B

NO REACTIVO
 VENTAJAS PRUEBAS RAPIDAS

• Fácil uso, con entrenamiento mínimo

• Fácil conservación

• No necesidad de equipo

• Toma de muestra utilizando sangre total

• A ser utilizado en sistemas periféricos de salud

• Resultados de 10 a 30 minutos

• Para el diagnostico y estrategia de prevención de la transmisión

vertical de VIH
 ELISA
ELISA = ensayo inmunoenzimático ( Enzyme
Linked Inmuno Sorbent Assay).

Se basa en la detección de antígeno o anticuerpo

inmovilizado sobre una fase sólida, mediante anticuerpos
que directa o indirectamente producen una reacción
cuyo producto coloreado puede ser medido
espectofotométricamente.
 PRUEBA ELISA

H2SO4

Fase * Antígeno Muestra Conjugado Sustrato Stop

Sólida (1°,2°,3°,4° Gen) Antígeno Ag/AbM + +
(Poliestireno) * AnticuerpoM Anticuerpo Enzima Cromógeno
 EVOLUCIÓN DEL DIAGNÓSTICO
DEL VIH

1st gen 2nd gen 3rd gen 4th gen

Proteínas Proteínas Proteínas
recombinantes recombinantes recombinantes
Antígeno usado Lisado
y péptidos y péptidos y péptidos
Viral sintéticos sintéticos sintéticos

Elisa indirecto indirecto sandwich indirecto y directo

anti-HIV Ig IgG IgG IgG Ac

detección IgM Ag P24

Sensibilidad + ++ +++ ++++

Especificidad + ++ + +++ +++

Año aparición 1985 1987 1989 1997

 ELISA

Antígenos inactivados ,parcialmente purificados

pre-cubiertos sobre una placa de ELISA

Suero de paciente contiene anticuerpos,que se

unirán a los antígenos de la placa

Inmunoglobulina antihumana conjugada a

una enzima . Este segundo anticuerpo se
une a los anticuerpos humanos

Cromógeno o substrato el cual cambia de

color cuando es dividido por la enzima
H2 O2
unida al segundo anticuerpo.
ELISA: REACCIÓN ANTÍGENO-
ANTICUERPO

Antígeno Anticuerpo
ELISA: REACCIÓN AC-
CONJUGADO
ELISA: REACCIÓN SUBSTRATO
Cromógeno TMB
OPD
O2

H2 O2

H2O
 ELISA

Antigen detection

TMB

Solid phase Sample Conjugate

 ELISA PROTOCOLO ESTANDARD :

1.- DISPENSAR LA MUESTRA

Dispensar muestra Lavado

incubar

37°C
 ELISA PROTOCOLO ESTANDARD :
2.- DISPENSAR CONJUGADO

Dispensar conjugado Lavar

incubarar

37°C
 ELISA Protocolo estandard :

3.- Dispensar el substrato

Dispensar substrato
e incubar
TMB Temp. ambiente
H2O2
H2O2 TMB TMB
TMB H2O2
H2O2 TMB
 ELISA Protocolo estandard :
4.- Stop reaction

H2SO4
 REACCIÓN ENZIMÁTICA DEL SUBSTRATO
Adición de H2SO4
Absorbancia

2000 Positivo Alto

1800
1600
1400
1200
1000
800
600
400 Positivo bajo
200
0

30’ Tiempo
 Reacción Enzimática del Substrato

Addición de H2SO4
Absorbancia
Positivo alto
2000
1800
1600
1400
1200 Positivo bajo
1000
800
600
400
200
0

30’ 60’ Tiempo

 MARCADORES ENZIMÁTICOS MÁS
COMÚNMENTE UTILIZADOS

Enzima Substrato Buffer/Substrato Color Filtro

secundario
(OPD) Citrate Phosphate Naranja- 492 nm
o-Phenylene Buffer, 0.02% H2O2
marrón
Diamine
HRP
(peroxidasa (TMB) 30% Hydrogen amarillo 450 nm
de rábano ) 3,3',5,5'- Peroxide (H2O2)
Tetramethyl
benzidine
(ABTS) Citrate Phosphate verde 405 nm
2,2'-azinodiethyl- Buffer, 30% H2O2
benzthiazoline
sulfonate)
 ELISA : controles y muestras

P P P N N B

• Control Negativo: asegura que la

placa no reacciona
inespecíficamente
• Control Positivo: asegura que la
placa reaciona correctamente
frente a una muestra positiva
• Control Negativo y Positivo :
Cálculo del Cut-Off
• Blanco asegura que la adición del
substrato no añada ningún
background a la placa
 TIPOS DE ELISA:

ELISA cuantitativas:

Son técnicas Elisa que nos indican la cantidad

de antígeno ó anticuerpo presente en la
muestra. Los kits incluyen +/-6 standards
(sueros de diferentes concentraciones del
antígeno objetivo) con los cuales se realiza una
curva para así poder determinar la
concentración de la muestra.
 TIPOS DE ELISA:

Técnicas cualitativas:

• Son técnicas Elisa que nos indican la ausencia ó

presencia de un antígeno o anticuerpo
determinando.
• Los kits incluyen controles positivos y negativos
para poder determinar esta presencia o
ausencia de antígenos.
 TIPOS DE TÉCNICAS ELISA:

Técnicas semi-cuantitativas:

• Son técnicas Elisa que nos dan un indicio de

la cantidad de antígeno ó anticuerpo
presente en la muestra con la utilización de
un standard ó calibrador
 TIPOS DE ENSAYOS ELISA

ELISA DIRECTO (ensayo ELISA simple de dos

capas).

• Las placas ELISA se preparan recubriendo los

pocillos con las soluciones en las que se sospecha
se encuentra el antígeno
• Se incuban con anticuerpos marcados.
• Indican la presencia de antígeno en la solución
analizada.
• Es necesario incluir controles negativos y positivos
 TIPOS DE ENSAYOS ELISA

Método competitivo:

• Se basa en la competencia que se establece entre

un antígeno/anticuerpo marcado enzimáticamente y
el mismo antígeno /anticuerpo sin marcar (muestra
problema) al ser colocados frente a una cantidad
limitada del anticuerpo/antígeno fijado a la fase
sólida.
• En estos casos la cantidad de antígeno es
indirectamente proporcional a la cantidad de
producto enzimático formado.
 TIPOS DE ENSAYOS ELISA

ELISA indirecto.
• Pocillos recubierto con antígeno
• . El sistema de detección emplea dos
anticuerpos : uno primario contra el antígeno, y
uno secundario marcado contra el primario.
• La detección tiene mayor sensibilidad por
presentar una amplificación de señal debida a
la unión de dos o más anticuerpo secundarios
por cada primario.
• En estos casos la cantidad de antígeno es
directamente proporcional a la cantidad de
producto enzimático formado
ELISA AUTOMATIZACIÓN

Sistema manual

sistema Semi automático

ELISA:SISTEMA AUTOMÁTICO
 DIAGNOSTICO DE VIH

PRUEBAS CONFIRMATORIAS

• WESTERN BLOT
• INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA
• INMUNOENSAYO EN LINEA
• AISLAMIENTO VIRAL
• DNA PCR
 WESTERN BLOT

• Western Blot o Inmunobloting es una

técnica utilizada para la detección de
anticuerpos específicos generados contra
agentes infecciosos.
• Prueba específica que permite desglosar
la reactividad total detectada por ELISA y
determinar que proteínas del patógeno son
reconocidas por el sistema inmune.
• Permite escoger marcadores serológicos
específicos que indique infección.
 FUNDAMENTO TEORICO

• Separación por electroforesis de mezclas complejas de

proteínas y transferidas a membranas.
• Proteínas inmovilizadas se enfrentan a sueros de
pacientes,detectándose por medio de un Ac.anti-
inmunoglobulina humana unida a enzima si hubo el
reconocimiento Ag-Ac.
PRINCIPIO DE WESTERN BLOT

• ELECTROFORESIS DE LAS PROTEINAS

• TRANSFERENCIA DE
PROTEINAS

• DETECCION DE ANTICUERPOS
 ELECTROFORESIS DE LAS PROTEINAS

• Separación de mezcla de proteínas en sus diversos

componentes a partir de lisado celular por
electroforesis en gel denaturante SDS-
poliacrilamida (PAGE).
• Gel de poliacrilamida compuesto por acrilamida y
bisacrilamida formando malla.
• Proteínas de alto peso molecular :gel de bajo
porcentaje
• Proteínas de bajo peso molecular:gel de alto
porcentaje.
• Gel de empacamiento y gel de resolución.
 TRANSFERENCIA DE LAS PROTEINAS

• Proteínas separadas por electroforesis son transferidas

y fijadas a una membrana de nitrocelulosa
• Transferencia electroforética:proteínas migran bajo
campo eléctrico atraídas al ánodo (polo positivo) debido
a carga negativa conferida por SDS.
• Transferencia semi seca (semi-dry blotting): gel y la
membrana colocados horizontalmente entre papeles de
filtro sumergidos en buffer de transferencia, colocado
entre electrodos con la membrana hacia lado anódico.
 DETECCION DE ANTICUERPOS

• ANTICUERPO PRIMARIO (sueros).-

Anticuerpos utilizados a mayor dilución
posible que permita distinguir señal
positiva.rango de dilución 1/100 -
1/1500

• Determinar tiempo mínimo de

incubación para evitar ruidos de fondo
por uniones inespecíficas.
 DETECCION DE ANTICUERPOS

ANTICUERPO SECUNDARIO
• mediante un Ac. secundario: anti-inmunoglobulina unida en
forma covalente a una enzima
• Fosfatasa alcalina (AP) : 10-50 picogramo de poteína.
• Peroxidasa (HRPO): 250-500 picogramos de proteína.
 WESTERN BLOT

• Prueba de confirmación
• Principio: Ensayo
inmunoenzimático
• Detecta anticuerpos contra
proteínas específicas del
VIH 1
• Interpretación: visual
• Muestras: suero y plasma
• Volumen: 20 µl
• Tiempo: 3.5 hrs
• Sensibilidad: 100%
• Especificidad: 100%
NEGATIVO
POSITIVO
INESPECIFICO
 RESULTADO POSITIVO

Pocillo Superior Pocillo Inferior

 RESULTADO NEGATIVO

Pocillo Superior Pocillo Inferior

DIAGNOSTICO DEL VIH POR PCR AN
CUALITATIVO
 NESTED PCR
• Técnica que comporta dos reacciones en de PCR sucesivas, con dos
pares de primers distintos: cebadores utilizados en la segunda PCR
(interno o nested PCR) flanqueen una región genómica amplificada en
la primera reacción en cadena (externo PCR).

• Este tipo de PCR es muy específica y sensible.

• Si se tienen pequeñas cantidades del ADN de interés

• Si se quieren evitar las amplificaciones inespecíficas que a veces se

observan con la PCR clásica: cada etapa se realiza un número menor
de ciclos (las PCR de muchos ciclos conllevan a menudo errores de
lectura y de síntesis, debido, entre otras cosas, a la falta de fidelidad
de la polimerasa Taq).
PROCESOS PRE-PCR

Obtencion de muestras

Extracción de ADN
PRE AMPLIFICACION Y AMPLIFICACION

DETECCION
 Determinación del estado de Infección en
FICHA DE SEGUIMIENTO DE LA GESTANTE SEROPOSITIVA Y EL NIÑO EXPUESTO AL VIH
INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Y RED NACIONAL DE LABORATORIOS EN SALUD PÚBLICA niños expuestos a VIH
menores de 18 meses de edad
DATOS GENERALES DE LA GESTANTE
1. Gestante en CPN ( ) / Gestante en parto ( ) / Madre de niño expuesto ( )

_______________________________________________________________________________________
(escribir el nombre completo de la gestante en letra de imprenta) Niño < 18 meses de
2. Establecimiento de salud u hospital / DIRESA/ DISA en donde recibe atención:
edad nacido de
__________________________________________________________ _____________________________
(establecimiento u hospital) (DIRESA / DISA) madre infectada
3. Fecha de nacimiento 4. Fecha de diagnóstico 5. Edad (día/mes/año)

6. Evidencia de laboratorio: a. prueba rápida - b. ELISA - c. prueba confirmatoria - d. no sabe

( )antes del CPN ( )durante el CPN ( ) durante el parto ( )después del parto

Prueba DNA PCR para

DATOS DEL PRE NATAL VIH
7. Lugar de atención pre natal:
________________________________________________________________________________
8. Edad gestacional al Dx.: 9. Fecha probable de parto: 10. Estadio SIDA ( )

__________Semanas de gestación a. Si - b. No - c.No sabe

11. Resultado CD4 12. Resultado carga viral 13. Tratamiento antiretroviral ( ) Si es positiva, repetir la prueba
___________________cel/mm3 ______________ copias/ml a. Si - b. No - c. No sabe
14. Profilaxis materna con Comentarios: lo más pronto posible.
antiretroviral ( )
Si es negativa, repetir después
a. Si, inició en la semana_______de
gestación de dos ó tres meses
b. No inició
c. No sabe

DATOS DEL PARTO

15. Lugar de atención del parto:
_____________________________________________________________________________
16. Edad gestacional al parto: 17. Fecha del parto: 18. Recibió Control pre natal ( )

__________Semanas de gestación a. Si - b. No - c. No sabe

19.Tiempo que la madre recibió 20. Evolución de la gestación 21. Recibe tratamiento con 2 pruebas positivas Niños < 18meses son no
profilaxis ARV antes del parto ( ): ( ): antiretrovirales ( ):
DNA PCR para VIH infectados si tienen 2 resultados
a. Si durante ____________ semanas
b. No usó
a. parto vaginal
b. parto por cesárea
a. Si, esquema___________________
b. No
obtenidas en diferentes negativos ocurridos en 2 ó más
c. No sabe c. aborto c. No sabe días confirma la DNA PCR para VIH ,cuando uno
22. Madre fallecida ( ): 23. Niño ( ): 24. Inicio profilaxis ARV al niño ( ):
infección por VIH es realizado a los tres meses de
a. Si b. No a. Vivo b. Natimuerto a. Si, en las primeras 24 horas edad y el otro es realizado
Comentarios: b. Si, después de 24 horas de nac.
c. No se realiza
después de dos ó tres meses(*),
d. No sabe
ALGORITMO PARA EL DIAGNOSTICO DE INFECCION POR VIH

1er
ELISA
Resultado Resultado (-
(+) )
2do se reporta
ELISA no reactivo
Resultado Resultado (-
(+) IFI )
se reporta
no reactivo

+ INESPECIFICO -

WESTERN
BLOT

+ INDETERMINADO -

REPETIR
3 MESES

+ INDETERMINADO -

PCR