ELISA competitivo para determinación cuantitativa de tiroxina total

(T4) en suero humano o plasma

F. Santana- J. Santana- E. Sepúlveda- C. Solís- I. Soto- S. Triviño- N. Trujillo- C. Uribe- E. Vera-

A. Vera- V. Villa- D. Villagrán- A. Zúñiga.

INTRODUCCIÓN

La tiroxina es una hormona tiroidea secretada por las células foliculares de la glá ndula tiroides,
la que puede ser medida por la técnica de ELISA.

El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) es una técnica en la cual

un antígeno inmovilizado se detecta mediante un  anticuerpo especifico  unido a una
enzima capaz de generar un producto que se visualiza por la presencia de un color
determinado. La aparició n de colorantes permite medir indirectamente
mediante espectrofotometría el antígeno en la muestra. Existen diferentes tipos de ELISA que
varían de acuerdo al analito que deseamos buscar, en este caso nos enfocaremos al uso de un
ELISA competitivo para la detecció n de tiroxina total (T4). Este ensayo, como su nombre indica
se basa en que los antígenos que buscamos en este test compitan frente a antígenos
comerciales marcados con una enzima por el anticuerpo que está unido al pocillo, para poder
realizar una cuantificació n del analito (T4) presente en el plasma del paciente.

OBJETIVOS

i. Desarrollar un test de ELISA competitivo comercial para reforzar el conocimiento

teó rico.
ii. Determinar concentració n de T4 mediante ELISA competitivo para diagnosticar
una posible patología hormonal.
iii. Identificar posibles errores en la realizació n de la técnica de ELISA.
MATERIAL Y MÉTODOS

Método: ELISA competitivo para determinació n de T4 total en suero humano o plasma.

Materiales:

 Pipetas y tips
 Lector de placas de ELISA
 Probeta
 Tubo de centrifuga
 Kit ELISA:

- 96 pocillos poliestireno

- 12 tiras de micropocillos (MIC) desprendibles para 8 pocillos recubiertas con anti-T4

(oveja)

- Calibradores CAL (2 ml, tapa blanca) Tienen distintos niveles de T4:

A: 0 µg/dl.
B: 2 µg/dl.
C: 5 µg/dl.
D: 10 µg/dl.
E: 15 µg/dl.
F: 25 µg/dl.

- Conjugado enzimático-antígeno: CON (1,5 ml al 1%, tapa blanca)

T4 conjugado con HRP, coloreado amarillo en una matriz proteica estabilizada.

- Buffer Conjugado: C-DIL (13ml, tapa blanca)

Buffer de fosfato, coloreado rojo.

- Solución de lavado: WS (20 ml, tapa negra)

Concentrado para aproximadamente 1000 ml de buffer Tris NaCl 250 mmol/l.

- Reactivo sustrato SUB (14 ml, tapa amarilla)

3,3’; 5,5’-tetrametilbenzidina (TMB) 0, 55 g/l
Peró xido de urea hidró geno 0,03 %
Buffer acetato de sodio 0,05 mol/l

- Solución de parada STOP (7,5 ml, tapa roja)

Á cido sulfú rico: 0,5 mol/ml

- 3 tiras adhesivas.
PROCEDIMIENTO

Antes de realizar el Test de ELISA preparar las

siguientes soluciones:

250 ml de solució n de lavado: 5 ml de solució n

de lavado madre (WS) y 245 ml de agua en una
probeta.

2420 µl de conjugado enzima-antígeno (es

necesaria esta cantidad, ya que se utilizaran 24
pocillos, 100µl por cada uno): 1 parte (220µl)
de conjugado enzima-antígeno (CON) y 10 partes (2200µl) de buffer conjugado (C-DIL) en un
tubo de centrifuga.

A los 12 Primeros pocillos agregar calibradores (CAL) A, B, C, D, E y F en duplicados en su

respectivo orden.

x 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 12
1
A A E
B A E
C B F
D B F
E C
F C
G D
H D

Posteriormente agregar las muestras de los pacientes 23, 28, 33, 41 y 47 (plasma) en
duplicado en sus respectivos pocillos, 2 pocillos quedaran libres, solo el pocillo G3 servirá
como control negativo. Sellar los pocillos con tiras adhesivas.

x 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 12
1
A A E 33
B A E 33
C B F 41
D B F 41
E C 23 47
F C 23 47
G D 28 CN
H D 28
Esta placa es sometida a incubació n durante 45 minutos a 37°C.

Después de incubar observamos una coloració n roja. Retirar tiras adhesivas. Eliminar el exceso
y lavar con la solució n de lavado (mínimo 3 veces aprox. 300µl por pocillo en cada lavado).
Agregar 100µl de conjugado enzima-antígeno a cada pocillos e incubar por 15 minutos a Tº
ambiente con tiras adhesivas.

Observar el cambio de color a azul. Agregar 100µl del reactivo sustrato (SUB) a cada pocillo. La
reacció n será visible por la visualizació n de color amarillo. Finalmente agregar 50µl de
solució n de parada (STOP) para terminar la reacció n cinética.

Llevar al lector de micro placa y medir a 450 nm. Evitar la luz.

RESULTADOS

Los resultados de las Absorbancias, después de haber hecho el procedimiento de ELISA

competitivo para cuantificar T4 total en suero humano, fueron:

(Papelito de las Absorbancias)

  Como los calibradores de concentraciones conocidas se hicieron en duplicado, lo
mismo que nuestras muestras de suero, calculamos el promedio a las absorbancias
resultantes de ambos y ademá s el logaritmo de los está ndares, para realizar
posteriormente una curva de calibració n e interpolar las concentraciones desconocidas
de las muestras a partir de su Absorbancia.

Estándar Concentración (µg/dl) Absorbancia (450nm) Logaritmo

A 0 0,964 0
B 2 0,816 0,301
C 5 0,641 0,699
D
E 15 0,382 1,176
F 25 0,319 1,398

Muestras Concentración (µg/dl) Absorbancia (450nm) Logaritmo

1 5,2 0,5175 0,7178
2 5,1 0,5305 0,7117
3 5,4 0,4905 0,7306
4 4,9 0,572 0,6920
5 5,4 0,485 0,7332
 Absorbancia v/s Log [estándar]
1.6

1.4 f(x) = 0.28 x − 0.24

1.2

0.8
Absorbancia
0.6

0.4

0.2

0
0 1 2 3 4 5 6 7
Logaritmo concentración estándar

A partir de este grá fico, obtuvimos la pendiente y= -2,1119x + 2,0335.

Con esta ecuació n de la recta hicimos los cá lculos para obtener los resultados de la
concentració n:

Ejemplo de cálculo:

Muestra1:
Absorbancia: 0, 5175, representada por y.
Concentració n: x (obtendremos el log de la concentració n).

0, 5175= -2,1119x + 2, 0335

Despejamos x que sería el logaritmo de la concentració n:

(0, 5175 – 2,0335)/ -2,1119 = 0,7178

Finalmente aplicando antilogaritmo a ese resultado, obtenemos la concentració n de la muestra

1.

10^0,7178 = 5,2 µg/dl.

  Se excluyó del grá fico el logaritmo de la Absorbancia del calibrador D (10 µg/dl), ya
que la pendiente no resultaba lineal con este valor, probablemente debido a algú n error
durante el procedimiento del método.

Interpretació n de Resultados:

 Los valores esperados para hombres y mujeres son:

HOMBRES MUJERES
Media (X) 7,6 µg/dl 8,2 µg/dl
Desviació n está ndar (D.S) 1, 6 µg/dl 1,7 µg/dl
Rango esperado (+2 D.S) 4,4 – 10,8 µg/dl 4,8 – 11,6 µg/dl

 Nuestros resultados fueron:

Concentració n (µg/dl)
Muestra 1 5,2
Muestra 2 5,1
Muestra 3 5,4
Muestra 4 4,9
Muestra 5 5,4

CONCLUSIÓN

La hormona T4 circula unida a la proteína TBG en un 99%; só lo el 1% circula de forma libre. Se

cree que la forma libre es la forma activa de la hormona. La T4 libre al igual que la T3 libre, es
la que se utiliza para determinar la presencia de patologías. Una alta concentració n de la
misma, es un signo de presencia de hipertiroidismo, mientras que una baja indica
hipotiroidismo; Por lo tanto podemos concluir que los resultados está n dentro del rango de
valores esperados, sin embargo cada laboratorio debe establecer sus propios valores
esperados, utilizando la instrumentació n, métodos de colecció n de sangre y técnicos de
aná lisis, ya que los niveles de T4 son influenciados por factores geográ ficos y dieta.

DISCUSIÓN
Si bien los valores obtenidos mediante esta técnica realizada en clases estuvieron dentro de los
rangos normales, hay que tener presente que siempre puede haber algú n margen de error al
realizar la técnica, por ejemplo:

Usar las concentraciones ó ptimas tanto de Ags como Acs para que la reacció n se cumpla, así
como la verificació n de lote junto al kit comercial para que se verifique que se trabaja con el
material correcto.

Que las condiciones de incubació n sean las apropiadas para que la reacció n inmunoló gica se
realice sin problemas, ya sea el tiempo, temperatura y humedad adecuada, ya que se podrían
arrojar resultados alterados o con un margen de error muy altos.

Realizar lavados entre cada paso del inmunoensayo, generalmente se hacen entre 3-6 lavados,
si no realizamos lavado, se va a ver alterado de igual manera la reacció n

Problemas en el pipeteo. Un mal pipeteo de la muestra o reactivos puede hacer que no haya
reacció n, en el caso de pipetear menores cantidades, o reacciones exacerbadas al pipetear
cantidades demasiado grandes.

Y finalmente que la lectura de densidad ó ptica se haga a las longitudes de ondas adecuadas,
para así realizar la curva de calibració n sin mayores problemas.