FREE-T4
Cat. IIDE-2024
Inmunoensayo Enzimático para la Determinación Cuantitativa de la
Hormona Tiroxina en su fracción libre (fT4) en Suero Humano
Solo para diagnóstico In Vitro
Para uso exclusivo en laboratorios clínicos o de gabinete
Conservar entre 2°C a 8°C
NOMBRES COMUNES Y DE PROPIEDAD
Inmunoensayo enzimático de fT4
USO DESTINADO
Para la determinación cuantitativa de la hormona tiroxina en su fracción
libre en suero humano
INTRODUCCIÓN
L-Tiroxina (T4) o 3,3’,5,5’-tetraiodotironina es la hormona tiroidea más
comúnmente medida para el diagnóstico de función tiroidea. La T4 tiene
una influencia primaria en la síntesis de proteínas y el consumo de oxig-
eno virtualmente en todos los tejidos pero también es importante para el
crecimiento, desarrollo y maduración sexual.
La T4 es sintetizada por la glándula tiroides y es secretada al torrente
sanguíneo. Aquí la T4 se convierte en límite para las proteínas del su-
ero para el trasporte a las células. La proteína de transporte principal es
la globulina fijadora de tiroxina (TBG) la cual normalmente cuenta con
el 80% del límite de T4. Otras proteínas obligatorias de la hormona de
tiroides son la pre-albumina y la albúmina. La mayor parte del suero de
t4 está limitado a estas proteínas de transporte que salen de solamente
cerca de 0.03% libremente para ejercer su efecto sobre las células. Este
es el T4 libre (F-T4) que representa metabólicamente la fracción activa;
por esta razón la medida de la concentración de F-T4 es considerada
a ser un indicador del estatus tiroidea de un paciente. El hipotiroidismo
primario resulta en la baja producción de T4 por la glándula Tiroides y
consecuentemente y anormalmente baja circulación de concentración de
F-T4 en la sangre. Hipertiroidismo primario lleva a la producción excesiva
de T4 y resultando la concentración elevada de F-T4.
Las concentraciones de T4 en suero total son dependientes del nivel
de circulación de TBG así como el estatus de tiroides del paciente. La
concentración de TBG puede ser afectada por ciertas drogas, hormonas
esteroides, embarazo y por varias enfermedades no tiroideas. En una
generación temprana de pruebas de funciones de la tiroides, el efecto de
la concentración variable fue ocupado por calcular un índice de tiroxina
libre (FTI). Este (FTI) es el producto de la concentración total de T4 (TU)
captación de tiroides, el cual determina el número de puntos de enlace
de el TBG. Este acercamiento requiere la realización de dos determina-
ciones separadas del análisis (T4 total y TU), pero proporciona un mejor
indicador del estado de la tiroides T4 total solamente. La prueba de F-T4
está diseñada para reflejar directamente el equilibrio existente en suero
entre T4 y TBG T4. Estos métodos, incluyendo esta prueba de F-T4, pu-
eden generalmente reflejar el estatus tiroideo en un solo análisis.
PRINCIPIO DE LA PRUEBA
La prueba de F-T4 es un inmunoensayo enzimático competitivo de la fase
sólida. Muestras de pacientes, estándares y reactivo de tiroxina-enzima
VER.2
conjugada operante son añadidos a pozos recubiertos con anticuerpo
monoclonal de T4. La F-T4 en la muestra del paciente y el conjugado eti-
quetado de T4 compite para los puntos de enlace disponible en el anticu-
erpo, después de 60 minutos de incubación a temperatura ambiente, los
pozos son lavados con agua destilada para remover el conjugado de T4
no adherido. Una solución de H2O2/TMB es después añadida e incubada
por 20 minutos, resultando en el desarrollo de un color azul. El desarrollo
del color es detenido con la adición de solución de paro (3N HCI), y la
absorbancia es medida espectrofotométricamente a 450 nm. La intensi-
dad del color formado es proporcional a la cantidad de enzima presente y
es relacionado inverso a la cantidad de F-T4 no adheridos de la muestra.
Por referencia a las series de los estándares de F-T4 ensayados en la
misma manera, la concentración de F-T4 en la muestra desconocida es
cuantificada.
REACTIVOS
Materiales provistos en el equipo
1. Placa con micropozos cubiertos de Anticuerpo de T4 con 96 pozos.
2. Enzima Conjugada, listo para usarse
3. Estándares de Referencia de F-T4, que contienen 0, 0.3, 0.95, 2.1,
3.6 y 7.0 ng/dL
4. Reactivo de Color A
5. Reactivo de Color B
6. Solución de Paro (3N HCI)
7. Solución Buffer de Lavado Concentrado
Materiales requeridos pero no abastecidos
1. Pipetas de precisión 25 µL, 50 µL, 100 µL, 200 µL y 1.0 mL
2. Puntas para pipetas desechables.
3. Agua destilada o desionizada
4. Mezclador Vórtex o equivalente.
5. Papel absorbente o toalla de papel
6. Papel cuadriculado
7. Un lector de MicroElisa.
ALMACENAMIENTO DEL EQUIPO E INSTRUMENTRACIÓN
El equipo que no sea abierto debe ser almacenado entre 2 a 8 °C la
micro placa debe estar en una bolsa sellada con anti-humectantes con
una mínima exposición al aire húmedo. Los equipos abiertos pueden ser
estables hasta la fecha de caducidad, almacenados como esta descrito.
Un lector de micro placa con una anchura de banda de 10 nm o de lon-
gitud de onda de 450 nm es aceptable para el uso en la medida de la
absorbancia.
PREPARACIÓN DE REACTIVO
1. Solución de Trabajo de Substrato (Working Substrate Solution) Pre-
párelo inmediatamente antes de su uso. Para la preparación de la
solución H2O2/TMB, prepare una mezcla 1:1 de reactivo de color A
con reactivo de color B hasta un ahora antes de su uso. Mezcle gen-
tilmente para completar la mezcla. El reactivo preparado de H2O2/
TMB debe estar hecho al menos 15 minutos antes de ser usado y
es estable a temperatura ambienten la oscuridad hasta por 3 horas.
Deseche el exceso después de usarse.
Distribuido por:
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2. Preparar la solución buffer de lavado aforando, el líquido concentra- EJEMPLO DE CURVA ESTÁNDAR
do de solución buffer con agua destilada, multiplicando el valor de la Los resultados de una corrida estándar típica con lecturas de densidad
concentración marcada en el frasco contra el volumen indicado en el óptica a 450 nm mostradas en el eje “Y” contra las concentraciones de
mismo. Ejemplo: Concentración 50x, volumen 20 mL. 20x50=1000. fT4 mostradas en el eje “X”. Esta curva estándar es para el propósito de
Por lo tanto se afora a 1000 mL para llegar a una concentración de ilustración solamente, y no debe ser usada con cálculos desconocidos
1x. cada usuario debe obtener sus propios datos y curva estándar en cada
experimento.
PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO
Antes de proceder con la prueba, traiga todos los reactivos, referencias fT4 (ng/dL) Absorbancia (450 nm)
de suero y los controles a temperatura ambiente (18 a 25 °C).
0 2.496
1. Corte y enumere los pocillos para cada suero de referencia, control
y muestra del paciente que se va a probar por duplicado. 0.3 2.292
2. Dispense 50 µL del suero de referencia, control y muestra dentro del 0.95 1.903
pozo apropiado. 2.1 1.295
3. Añada 100 µL del reactivo FT4- enzima conjugado a todos los pozos. 3.6 0.819
4. Agite la Micro placa cuidadosamente por 20-30 segundos para mez-
7.0 0.410
clar.
5. Incube por 60 minutos a temperatura ambiente.
6. Deseche la mezcla incubada vaciando el contenido en un recipiente
para desechos. Lave y enjuague la microplaca 5 veces con la solu- 2.5

ción buffer de lavado.

7. Añada 200 µL de solución de sustrato de trabajo a todos los po- 2.0

Absorbancia (450nm)
zos, (siempre añada los reactivos en el mismo orden para minimizar
las diferencias de tiempo de reacción entre los pozos). Mezcle cui- 1.5

dadosamente por 10 segundos.

8. Incube a temperatura ambiente en la oscuridad por 20 minutos. 1.0

9. Detenga la reacción añadiendo 50 µL de solución de paro (3H HCI)

a cada pozo. 0.5
10. Mezcle cuidadosamente por 30 segundos. Es importante asegu-
0 1 2 3 4 5 6 7
rarse que todo el color azul cambie a color amarillo completa- fT4 Conc. (ng/dL)

mente.
11. Lea la absorbancia a 450 nm en un lector de Micro placa en un plazo
no mayor a 30 minutos.
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
1. Los resultados confiables y reproducibles serán obtenidos cuando el
procedimiento de ensayo sea llevado a cabo con un completo enten-
dimiento de las instrucciones del inserto en el paquete y con acato a
las buenas prácticas de laboratorio.
2. El procedimiento de lavado es crítico. Un lavado insuficiente cau-
sará una deficiente precisión y lecturas de absorbancia falsamente
elevadas.
3. Muestras de suero que presenten fuerte lipemia, hemolisis severa o
turbidez no deben ser utilizados en este test.
4. Los resultados obtenidos del uso de este equipo de prueba deben
ser utilizados solamente como una adición a otros procedimientos
diagnósticos e información disponible para el médico.
CÁLCULO DE LOS RESULTADOS
1. Calcule el valor de la media de la absorbancia (A450) por cada set de
estándares de referencia, controles y muestra de pacientes.
2. Construya una curva estándar trazando la media de la absorbancia
de cada estándar de referencia contra la concentración en ng/dL en
papel gráfico, con los valores de la absorbancia sobre el eje vertical o
eje “Y”, y las concentraciones sobre el eje horizontal o eje “X”.
3. Use los valores de la media de absorbancia de cada espécimen a
determinar la concentración correspondiente de fT4 en ng/dL de la
curva estándar.
REFERENCIAS
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Press, Phila., 1976.
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