PRUEBAS DE

SENSIBILIDAD A
ANTIMICÓTICOS
 Debido al aumento en las infecciones fúngicas
invasores y a la emergencia de hongos resistentes a
los antifúngicos, ha sido necesario desarrollar
métodos estandarizados de susceptibilidad
antifúngica.

 Clinical Laboratory Standards Instutute (CLSI)

 European Committee for Antimicrobial Susceptibility
Testing (EUCAST)
 Susceptibilidad de levaduras por microdilución en caldo
(documentos M27-A2 y E. Dis. 7.1, respectivamente).
 Equivalentes, con diferencias metodológicas y en sus
puntos de corte.
 CLSI: M38-A (hongos filamentosos) y M44-A (difusión en disco).
 EUCAST trabaja en un documento para Aspergillus sp.
 Existen métodos comerciales con buena correlación
con los métodos de referencia: E-test®, Sensititre® y
Vitek2®.
 La interpretación de los resultados debe ser
cuidadosa pues la determinación de la
concentración inhibitoria mínima (CIM) es muy
difícil para hongos, hay factores del hospedero
involucrados y no siempre hay una correlación
entre la CIM y la respuesta a tratamiento.
 Es recomendable derivar los estudios de
susceptibilidad a un laboratorio de referencia.
 Hay cuatro principios básicos a tomar en
cuenta en la interpretación de los resultados en
las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana.
 Una CMI no es una medición física o química.
 Con frecuencia ciertos factores del paciente son más
importantes que los resultados de la pruebas de
susceptibilidad en la determinación de la evolución
clínica.
 La susceptibilidad in vitro no siempre predice el éxito
de una terapia específica.
 La resistencia in vitro con frecuencia se correlaciona
con el fracaso en el tratamiento.
 El M27-A, especifica la implementación de
los procedimientos de macrodilución y
microdilución en caldo para: Candida y
Cryptococcus.
 M27-A es para: amfotericina B, 5-
fluorocitosina, ketoconazol, fluconazol e
itraconazol.

 M27-A2: para los nuevos triazoles;

voriconazol, posaconazol y ravuconazol.
Métodos de dilución en caldo
 Estándar de oro para levaduras y hongos filamentosos, miden CIM a
anfotericina B, fluocitosina, fluconazol, ketoconazol, itraconazol y los
nuevos triazoles como voriconazol, posaconazol y ravuconazol.

 Se han determinado puntos de corte de CIM para fluconazol,

itraconazol, voriconazol y fluocitosina (Tabla l).
 Los puntos de corte para las equinocandinas (caspofungina,
micafungina, anidulafungina) contra Candida, aún no han sido
validados.

 Estándar europeo EUCAST-AFST, cuya versión definitiva se publicó

el año 2007 y que ha establecido puntos de corte clínicos de acuerdo
a la especie y la relación entre criterios farmacocinéticos y
farmacodinámicos y la distribución de las CIMs. Es así como hay
especies con puntos de corte relacionados y no relacionados (Tabla
2).
Esquema del banco de diluciones utilizado para
realizar los ensayos in vitro.
 Hongos filamentosos: M38-A del CLSI, estandarizado para
Aspergillus sp, Fusarium sp, Rhizopus sp,
Pseudalescheria boydii y la forma filamentosa de Sporotrix
shenckii.

 Se encuentra trabajando en la estandarización para

dermatofitos.
 El EUCAST se encuentra estandarizando la determinación
de la CIM para Aspergillus sp.

La determinación de la CIM, de hongos filamentos es

más complicada, pues además del recuento por densidad
óptica, requiere un recuento de conidios en cámara de
Neubauer, debido a la presencia de conidios y elementos
hifales que influyen en la preparación del inoculo. Un
parámetro que se utiliza en hongos filamentosos, además de
la CIM, es la concentración efectiva mínima (CEM), que es
la más baja concentración de fármacos capaz de
producir un crecimiento hifal aberrante.
 Desventajas de la microdilución:
 Necesitan de un largo tiempo para informar los
resultados (24-72 hrs).
 Fallan en discriminar cepas resistentes a
amfotericina B (el uso de medio AM3 o de E-
test® es mejor).
 Falta establecer puntos de corte a varios
hongos y fármacos antifúngicos.
 La interpretación de los azoles y fluocitosina es
difícil en cepas con "trailing" (Figura 1).
Resumen de la metodología para hacer pruebas de
susceptibilidad con antifúngicos en Candida spp y
Cryptococcus
Variables Metodología M27-A2
Subcultivo en agar dextrosa Sabouraud o agar o agar papa
Preparación del inóculo dextrosa
Suspensión en solución salina 0.85%
Método espectrofotométrico
Medio de cultivo RPMI-1640 con MOPS 0,165 M (azoles y 5FC)
Medio para antibióticos 3/buffer fosfatos 10mM (amfotericina B)
pH 7
Concentración del inóculo 0.5-2.5 x 103 UFC/ml
Temperatura de 35oC
incubación
Tiempo de incubación 48 horas (Candida spp)
72 horas (Cryptococcus neoformans)
Lectura de CMI 5-fluotocitocina, ketoconazol, fluconazol, itraconazol, voriconazol,
posaconazol, ravuconazol: 80% reducción en turbidez en
comparación con el tubo control de crecimiento.
Amfotericina B: ausencia de turbidez visible
Control de calidad C. parapsilosis ATCC 22019
C. krusei ATCC 6258
Resumen de la metodología para hacer pruebas de
susceptibilidad con antifúngicos en hongos filamentosos
Variables Metodología M38-A
Preparación del inóculo Subcultivo en agar dextrosa Sabouraud o agar o agar papa dextrosa
Suspensión en solución salina 0.85%
Método espectrofotométrico
Medio de cultivo RPMI-1640 con MOPS 0,165 M (azoles y 5FC)
Medio para antibióticos 3/buffer fosfatos 10mM (amfotericina B)
pH 7

Concentración del 0.4-5 x 104 UFC/ml

inóculo
Temperatura de 35oC
incubación
Tiempo de incubación Rhizopus spp: 21-26 horas
Fusarium spp, Aspergillus spp, S. schenckii: 46-50 horas
Pseudallescheria boydii: 70-74 horas
Lectura de CMI 5-fluotocitocina, fluconazol, ketoconazol: 50% reducción en turbidez en
comparación con el tubo control de crecimiento.
Amfotericina B, itraconazol, voriconazol, posaconazol, ravuconazol:
ausencia de turbidez visible
Control de calidad C. parapsilosis ATCC 22019
C. krusei ATCC 6258
A. flavus ATCC 204304
A. fumigatus ATCC 204305
Método de difusión en disco
 Método simple, desarrollado para levaduras y
disponible para fármacos solubles en agua:
fluocitosina, fluconazol y voriconazol,
estandarizado por el CLSI para especies de
Candida.

 Se obtiene un halo de inhibición cuya

medición correlaciona muy bien con el método
de referencia.

 Desventaja: sólo existen puntos de corte

para fluconazol y voriconazol.
Método de difusión en disco

Antifungigrama realizado a Candida

albicans en agar de Shadomy.
Se observan los halos de inhibición generados
frente a 9 antifúngicos diferentes.
Métodos comerciales: Etest®.
 De los más utilizados, por su factibilidad de montar y
su buena concordancia con los métodos de dilución en
caldo, aprobado por la FDA.
 Se ha utilizado en levaduras y en hongos filamentosos,
amfotericina B, fluconazol, itraconazol, fluocitosina,
voriconazol, posaconazol y caspofungina.
 Inoculación del hongo en la superficie de un agar.
 Aplicación de una tira plástica impregnada con un
gradiente de concentración del antifúngico, lo cual
permite determinar la CIM.
 Incuba a 37°C por 24-48 hrs y se genera una elipse de
inhibición que permite obtener la CIM.
Fenómeno de "trailing". Se observa la presencia de microcolonias dentro del elipse
de inhibición. CIM 24 µg/mL. Fotografía facilitada por Promedar Ltda.
Etest®
La correlación con el método M27-A varía entre el 60 y
el 100%, según los estudios pudiendo depender de
varios factores:
a) Medio de cultivo: mejor correlación, agar casitone
y RPMI 1640 con 2% de glucosa que en el medio
RPMI sin glucosa.
b) Combinación especie/antifúngico con
correlación más baja:
C. glabrata - fluconazol,
C. tropicalis - fluconazol e itraconazol
C. neoformans - amfotericina B.
Etest®
c) Tiempo de incubación: mejor correlación a las 24h que a
las 48 h.
d) Antifúngico: la correlación es más baja en los azoles por
la aparición de doble halo. Útil en la rutina para
amfotericina B y 5-fluorocitosina con Candida spp., poco
útil para los azoles; en C. neoformans, se puede utilizar con
5-fluorocitosina y fluconazol.
Parece ser el método de elección para detectar las cepas
resistentes a amfotericina B usando el medio RPMI 1640
suplementado con un 2% de glucosa, tanto para Candida
spp. como para C. neoformans cambiando los tiempos de
incubación (24 h para Candida spp. y 48-72 para C.
neoformans).
Etest®

Etest: distribución de las tiras.

Etest®

Etest: Lectura de la CMI de itraconazol.

Etest®

Etest: Lectura de la CMI (flecha) en presencia de colonias en el

interior de la elipse de inhibición: a: fluconazol; b: amfotericina B.
Evaluation of Etest Method for Determining
Isavuconazole MICs against Cryptococcus gattii and
Cryptococcus neoformans.
Etest®
 Este método es muy útil para la
determinación de la sensibilidad in
vitro de hongos filamentosas a los
antifúngicos, ya que, al contrario de lo
que ocurre en las levaduras, las elipses
de inhibición son nítidas y más fáciles de
interpretar.
 La correlación con el método M38-P

es superior al 80% y 90% para

amfotericina B e itraconazol.
 Etest®

Placa de Etest inoculada con A.

fumigatus. Lectura de la CMI a
las 24 h (flecha).
Método comercial Sensititre® YeastOne

 Se asemeja más a la metodología del CLSI.

 Aprobado por la FDA y se basa en la

microdilución en caldo, pero con un sustrato
cromogénico para facilitar la interpretación
de la CIM.

 Esta prueba ha incorporado recientemente la

determinación de CIM para voriconazol,
caspofungina y posaconazol.
Colorimetric MIC determination of T-2307 and other agents against C.
glabrata ATCC 90030 using Alamar blue at 24 h and 48 h of incubation. The
susceptibility of C. glabrata to T-2307 and the other agents was tested in RPMI
1640 medium containing 0.2% glucose. Yellow circles, MICs.
 Sensititre YeastOne®

Panel Sensititre Yeast One a las 24h Panel Sensititre Yeast One a las 24 h
de incubación con efecto trailing en los de incubación
antifúngicos azólicos.
Sensititre YeastOne®
Fundamento
Con los azoles sigue habiendo problemas de lectura ya que,
debido al efecto trailing, el cambio de color no es tan evidente
y, en ocasiones, pasa de rosa (crecimiento) a púrpura
(inhibición parcial del crecimiento). La correlación con el método
de referencia (M27-A) oscila entre el 43 y el 100%, siendo mejor
para amfotericina B que para los azoles o 5-fluorocitosina.

Este método no es útil para la detección de cepas resistentes

a amfotericina B, probablemente por la utilización del medio
RPMI 1640. Sin embargo, se considera un método que podría
introducirse de rutina en el laboratorio de Microbiología
clínica.
Sensititre YeastOne®

También puede ser utilizado en los hongos

filamentosos para facilitar la rutina de un
laboratorio de Microbiología. Datos muestran
que con Aspergillus spp la correlación con el
documento M38-P para la amfotericina B, a
las 72 h, es del 97% y para el itraconazol del
90%. El método todavía requiere estudios
adicionales para poder utilizarlo en la
rutina, pero parece un buen método
alternativo.
Método automatizado,
Vitek 2® (Biomerieux)
 Disponible en el mercado, que utiliza una
lectura espectrofotométrica, lo cual facilita
la lectura de la CIM.
 Ventajas:
 Encontrarse acoplado a la identificación
de levaduras.
 Alto nivel de reproducibilidad de los
resultados y una concordancia de 93,7 a
97,9% con el método de dilución en
caldo.
 Los resultados pueden obtenerse a partir de
las 10 hasta las 26 horas de incubación.
Fungitest®
Es otro método colorimétrico fabricado por Sanofi
Diagnostic Pasteur.

En un estudio reciente, Willinger y cols. estudian

distintas especies de Candida por este método y
encuentran buena correlación con el método de
microdilución del NCCLS (excepto para C. glabrata):
100% para amfotericina B, 99% para 5-fluorocitosina,
96% para fluconazol y 86% para itraconazol. Sin
embargo, se han documentado cepas resistentes al
fluconazol o al itraconazol como sensibles por este
método (16,6% y 20%, respectivamente).
Fundamento
Está basado en el método de
microdilución del NCCLS, incluye 6
antifúngicos cada uno de ellos a dos
concentraciones críticas: amfotericina B
(2 y 8 μg/ml), 5-fluorocitosina (2 y 32
μg/ml), miconazol (0,5 y 8 μg/ml),
ketoconazol (0,5 y 4 μg/ml), itraconazol
(0,5 y 4 μg/ml) y fluconazol (8 y 64 μg/ml).
Fungitest®

* ketoconazol
* itraconazol
* fluctonazol
* anfotericina B
* 5-fluorocitosina
* miconazol
Otros métodos
Dilución en agar
 Fácil, económico y rápido, y sirve tanto para Candida spp. como
para Cryptococcus spp.; sin embargo, sólo es aplicable al fluconazol.

 Uso de placas Yeast Morphology Agar (YMA) (Difco) con distintas

concentraciones de fluconazol (0,125-256 μg/ml) inoculadas con una
suspensión de levaduras e incubadas a 35 °C durante 24 h para Candida
spp. y 72 h para C. neoformans.
 La correlación con el método de referencia es buena.

 El método de dilución en agar también se puede aplicar utilizando otros

medios de cultivo, como el CHROMagar Candida. La correlación con el
método de referencia (NCCLS M27-P) es muy buena.
Métodos alternativos para los hongos
filamentosos

Hasta la fecha, el NCCLS sólo ha

publicado un documento para el
estudio de la sensibilidad
antifúngica en hongos filamentosos:
el documento M38-P. Pero, aunque se
acepta como el método de referencia,
todavía no es definitivo, por lo que
puede ser modificado en el futuro.
Dilución en agar
Es similar al método de dilución en agar utilizado
para bacterias. Se preparan diluciones seriadas a
partir de una dilución 10 veces la concentración final
del antifúngico a evaluar y se incorporan al agar
fundido. Las placas con el antifúngico se inoculan con
suspensiones entre 105–107 UFC/ml.

La incubación se realiza a 28 °C ó 35 °C durante 48-

72 h y la lectura de la CMI se hace según el
método convencional.
Difusión en discos
Es un método útil para conocer la sensibilidad
a la amfotericina B y a los nuevos antifúngicos,
como las equinocandinas, de Aspergillus
spp. y otros hongos filamentosos.

En la actualidad, hay pocos estudios con este

método, si bien con caspofungina y
amfotericina B se ha obtenido mejor correlación
con los datos in vivo que con el método M38-P.
Difusión en agar

Difusión en agar
Sabouraud de
antifúngicos comerciales
y DMSO 1% como control
negativo, utilizando
cilindros; crecimiento de
esporas de Aspergillus
niger ATCC 2601
Método más útil
En levaduras:
 Para la mayoría de los antifúngicos: el método

colorimétrico Sensititre YeastOne

 Para la amfotericina B: el método Etest,

utilizando el medio RPMI con 2% de glucosa

En los hongos filamentosos hace falta realizar

más estudios de correlación in vitro-in vivo por
lo que no puede recomendarse ningún
método alternativo.
¿Cuándo deben realizarse las
pruebas de sensibilidad?
1.- En las micosis invasoras, en las que conviene
conocer si la cepa es resistente al antifúngico
puesto que se correlaciona con fracaso
terapéutico. Lo contrario no siempre se cumple.
2.- En las micosis orofaringeas que no responden
al tratamiento.
3.- Cuando se quiere conocer la prevalencia de
cepas resistentes en la institución.
4.- En las micosis producidas por patógenos
emergentes.
 Recomendaciones para el estudio
de susceptibilidad antifúngica
 La realización de estas pruebas tiene indicaciones precisas:
 Efectuar estudios de vigilancia epidemiológica.
 Determinar el nivel de resistencia frente a nuevos
compuestos con actividad antifúngica.
 Predecir la respuesta clínica y optimizar la terapia de
pacientes hospitalizados que no responden al
tratamiento, que presentan infecciones fúngicas
invasoras o en los que se aíslan cepas con alta tasa de
resistencia a fármacos antifúngicos (Ej. C. glabrata y
fluconazol).
 Se recomienda la realización de estas en centros de
referencia.
Interpretación de los resultados

 Hay cepas productoras de ''trailing"

que dificultan la interpretación. Una
forma de objetivar la lectura de la CIM es
realizar una lectura espectrofotométrica,
lo cual recomienda el estándar EUCAST.
El uso de azul de metileno facilita la
lectura del halo o elipse de inhibición en
los métodos de difusión en agar.
Conclusiones
 El desarrollo de métodos estandarizados de
susceptibilidad antifúngica, constituyen un notable avance
en la terapia de infecciones fúngicas, sobre todo las que
comprometen la vida del paciente. Actualmente se cuenta
con puntos de corte para varios antifúngicos de uso clínico
y para levaduras frecuentemente aisladas de infecciones
fúngicas invasoras (p. ej:. Candida, Cryptococcus). Aún
falta establecer puntos de corte para otras levaduras y
hongos filamentosos; sin embargo, con la información
de los métodos estandarizados se ha podido detectar
cepas intrínsecamente resistentes a los antifúngicos y
cepas con CIMs más elevadas que lo habitual, asociado a
falla terapéutica.
 La investigación de cepas con resistencia secundaria
ha permitido, además de cambiar y/o ajustar la terapia
de los pacientes, identificar mecanismos de
resistencia, dando pie a la modificación química de
fármacos existentes (p. ej:. voriconazol) y/o a la
búsqueda de nuevos fármacos dirigidos a otros
blancos de la célula fúngica (p. ej:. equinocandinas).
 Es necesario contar con un laboratorio nacional de
referencia donde realicen los estudios de vigilancia
y las CIMs de las levaduras aisladas de los centros
hospitalarios públicos que no cuenten con los recursos
humanos y/o económicos para realizar estas pruebas.