Cocobacilos Gram negativos

Haemophilus
TME-147
 Bacterias gram negativas, HACEK
Haemophilus • Residente de la cavidad bucal

• Rara vez causan infecciones

Aggregatibacter
• Infecciones generalmente en
la cavidad bucal
Cardiobacterium
• Pueden ocasionar infecciones
graves como endocarditis
Eikanella
• Son exigentes y de crecimiento
lento
Kingella
 Haemophilus
• Famila Pasteurellaceae
• Es un pequeño microorganismo ( 1 x 0.3 pm)
gram negativo de forma cocobacilo
pleomórfico.
• Anaerobio facultativo
• Fastidioso
• Indol variable
• Prueba de oxidasa (positiva) y requerimiento
de factores de crecimiento como hemina
(factor X) y NAD (factor V).
• Las especies de H.influenzae, H.aegyptius,
H.ducreyi, H.pittmaniae, H.parainfluenzae, H.
haemolyticus, H.parahaemolyticus y
H.paraphrohaemolyticus.
• Mas del 90% de los niños de 1 año
tiene uno o mas Haemophilus en la
nasofaringe
13-03-2017 Tecnología Medica 5
Haemophilus
influenzae
• Muestras clínicas puede ser
aislado de:
• Líquido cefalorraquídeo ( LCR ),

• Sangre

• Esputo.

• Ocasiona infecciones respiratorias

y rara vez endocarditis
 Virulencia
• H. influenzae tipo b es el más virulento desde el punto de vista clínico (su cápsula contiene fosfato de polirribitol [PRP])

• Haemophilus se adhiere a las células hospedadoras a través de pili y de estructuras no pilosas.

• Coloniza en los primeros meses de vida o en individuos sanos escapando de la IgA. (en la mucosa ciliar) y la coline kinasa.

• Gen que codifica igaB la IgA Proteasa

• Fimbrias (familia de proteínas LKP)

• Adhesina (Proteinas HMW1 y HMW2) Gen que codifica hap

• Lipopolisacaridos - LPS
 ENFERMEDAD INVASORA
Fijación a la nasofaringe

Colonización de nasofaringe

Inactivación del mecanismo mucociliar “escalador”

Penetración a la submucosa (tight juntions)

Entrada al torrente sanguíneo y defensa de la actividad bactericida del suero

Entrada al plexo coroideo a través de las células endoteliales

Activación de la respuesta inflamatoria causando edema y daño neuronal

13-03-2017 Tecnología Medica 9
IDENTIFICACION
• Gram

• Antígenos capsulares

• Molecular

• Espectrometría de masas (MALDI-TOF)

• Cultivo

13-03-2017 Tecnología Medica 10

Gram

13-03-2017 Tecnología Medica 11

 Antígenos capsulares
• H. influenzae posee 6 tipos de polisacáridos capsulares, mediante el cual
lo podemos serotipificar : a, b, c, d, e y f.
• Las cepas no capsuladas no pueden ser serotipificadas. (50-80% de
portación)

12 13-03-2017 Tecnología Medica

Antígenos capsulares y su relación con la
clínica
• H. influenzae posee 6 tipos de polisacáridos capsulares, mediante el cual lo podemos serotipificar
:
• A, C y F - Sinusitis
• B - Enfermedad invasora
• D
• E

• Los no-tipificables un tercio de causa otitis media.

• Enfermedad en el recién nacido.

13-03-2017 Tecnología Medica 13

13-03-2017 Tecnología Medica 14
Molecular
La identificación de H. influenzae,
H. aegyptius y H. influenzae
• Secuenciación de genes 16S rRNA biogrupo aegyptius puede ser
• rtPCR problemática debido al alto
• Microarrays grado de homología en sus
• Fluorescencia y hibridación in situ secuencias.
• Cuando se realiza en organismos recuperados
en cultivo Se complementa el estudio con el
uso de secuenciación combinada
y estudios bioquímicos.

FilmArray (BioFire Diagnostics, Salt Lake City, UT)

Paneles multiplex
Verigene (Nanosphere, Inc., Northbrook, IL)

13-03-2017 Tecnología Medica 15

MALDI-TOF

Tecnología Medica 13-03-2017 16

 CULTIVO
agar chocolate con factores de crecimiento (factores X y V). La temperatura óptima es 35°C, pH 7,6 y
condiciones atmosféricas de 5-7 % de CO2 por 48hrs.

13-03-2017 17
Tecnología Medica
 CULTIVO

13-03-2017 Tecnología Medica 18

 CULTIVO

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13-03-2017 Tecnología Medica 20
 IDENTIFICACION

La fermentación de carbohidratos se determina en caldo rojo de fenol que contiene 1% de carbohidratos

suplementado con 10 μg / ml de NAD y hemina.
13-03-2017 Tecnología Medica 21
IDENTIFICACION
 Factor V y X- ALA TEST

FACTORES V y X en ALA DISK

agar tripticasa de soya (Remel)

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13-03-2017 Tecnología Medica 24
 ALA TEST
Haemophilus
influenzae
4hrs 35ºC 1 atm
H. parainfluenzae
Ácido delta-aminolevulínico (ALA)

Porfirina Protoporfirina H. influenzae

Factor X 360-nm-long-wave UV light

13-03-2017 Tecnología Medica 25
TEST ALA

13-03-2017 Tecnología Medica 26

Mecanismos de Resistencia en antibióticos
Betalactamicos
• Producción de Betalactamasas (enzimático)

• Alteración de las PBP

• Alteración de la permeabilidad de la membrana externa

• Eflujo

13-03-2017 Tecnología Medica 27

Mecanismo enzimático (prevalente)

• Aproximadamente el 40% de los aislamientos de H. influenzae producen una

beta-lactamasa mediada por un plásmido que confiere resistencia a amoxicilina y
ampicilina.
• Las beta-lactamasas TEM-1 y ROB-1 se encuentran en H. influenzae. Se observan
valores de CIM > 128 ug/ml.
• A nivel de laboratorio realizar prueba de Betalactamasa para su identificación.

13-03-2017 Tecnología Medica 28

 Interpretación: Un resultado positivo indica resistencia a: ampicilina y amoxicilina
CLSI 2014.
13-03-2017 Tecnología Medica 29
 Alteración de PBP (no enzimático)
• Ocasionalmente hay cepas de H. influenzae que no producen beta-lactamasa
pero no obstante son resistentes a amoxicilina y ampicilina debido a los cambios
en las proteínas de unión a penicilina (PBPs). Estas cepas son designadas como
“beta-lactamasa negativas, resistentes a ampicilina” o cepas BLNAR. (baja
frecuencia <1%), descritas principalmente en Japón.

• H. influenzae posee 5 PBPs: 1 A, 1B, 2, 3 y 4

• Mutaciones en gen fts-l que codifica para PBP3 que tiene baja afinidad por
betalactamicos.

ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY, May 2004, p. 1630–1639

13-03-2017 Tecnología Medica 30

 Alteración de PBP
• PBPs 3A y 3B de baja afinidad.

• Bajo nivel de resistencia a ampicilina: 0,5 a 16 ug/ml

• Independiente del serotipo, origen del aislamiento y área geográfica.

• Difícil detección, falsamente categorizadas como sensibles.

• Asumir resistencia AMP/SUL, AMOX/CLAV, CEF, CXM, PIP/TAZ, a pesar de su aparente

sensibilidad in vitro.

• Se describe alteraciones en gen acrR, produce sobrexpresión de la bomba eflujo AcrAB

13-03-2017 Tecnología Medica 31

 Betalactamasa positiva –
amoxicilina clavulanico resistente
BLPACR
AMP 2- 64 ug/ml

Beta lactamasa TEM- 1

+
Mutaciones en gen fts-I (PBP3)

Probable falta de actividad con

AMOX/CLA, CEFACLOR, CEFUROXIMA

Doern. A. A. Ch.,1999, 43:385-389

JAC, Octubre 2003. 52:1018-21
13-03-2017 Tecnología Medica 32
 Clasificación de las cepas BLNAR
en base a las mutaciones en gen ftsl

Grupo I Arg517His
CIMs
Bajas AMP
(0.5-2 ug/ml)
Grupo II Asn526Lys

Grupo III Met377IIe CIMs

Ser385Thr Altas AMP
Leu389Phe (1-16 ug/ml)

13-03-2017 Tecnología Medica 33

 Clasificación de las cepas BLNAR
en base a las mutaciones en gen ftsl

Low BLNAR:

CIMs AMP 0.5-2 ug/ml, CTX 0.06- 0.25 ug/ml

Mutaciones Grupo II o Grupo I

High BLNAR:

CIMs AMP 1-16 ug/ml, CTX 1-2 ug/ml

Mutaciones Grupo II o Grupo I, mas una Grupo III

13-03-2017 Tecnología Medica 34

 Resumen de Fenotipos de Resistencia a Betalactámicos

BLNAs: AMP S Ninguno

BLPAR: AMP R B-lact Pos TEM-1, ROB-1

BLNAR-low: AMP R b-lact Neg Mutac. PBP3

AMP 0.5-2 ug/ml Grupo I o II

BLNAR-high: AMP R b-lact Neg Mutac. PBP 3

AMP 1-16 ug/ml Grupo I o II + Grupo III
BLPACR-I:
AMP R B-lact Pos. AMOX/CLA R TEM-1 +
Low AMP 2-64 ug/ml Mutac. PBP3 Grupo I o II

BLPACR-II:
TEM-1 +
AMP R B-lact Pos. AMOX/CLA R
Mutac. PBP3 Grupo I o II
High AMP 16-64 ug/ml
+ Grupo III
13-03-2017 Tecnología Medica 35
 Correlación entre la CIM y
los mecanismos de
resistencia a los
Betalactámicos

CMR. 2007. 20:368-389

13-03-2017 Tecnología Medica 36

 Bombas de Eflujo
+
Alteración de PBPs

Bomba AcrAB

Perdida funcional del represor AcrR:

gen acrA / acr/B : Hiperproducción de AcrAB

13-03-2017 Tecnología Medica 37

 Resistencia a Cloranfenicol
Enzimático

• Mediada gen cat que codifica a la enzima Cloranfenicol acetil

transferasa (CAT tipoA-II)

• Gen cat se transporta en un plasmidio el cual, también,

transporta los genes de resistencia para ampicilina y tetraciclina

• Alto nivel de Resistencia

13-03-2017 Tecnología Medica 38

Resistencia a Tetraciclinas
• La resistencia se asocia con un mecanismo de eflujo
codificado por el gen tetB, el cual se localiza en un plasmidio
conjugado.

• El plasmidio, además, transporta los genes de resistencia para

ampicilina y cloranfenicol. (descrito en H. influenzae tipo b).

13-03-2017 Tecnología Medica 39

 Plasmidio Conjugado
• Tn3: Resistencia a ampicilina (bla)
• Tn9: Resistencia a cloranfenicol (cat)
• Tn10: Resistencia a la tetraciclina (tet)

13-03-2017 Tecnología Medica 40

Resistencia a Sulfametoxazol- trimetoprim

• Disminución de la afinidad entre el trimetoprim y la Dihidrofolato reductasa (DHFR), producto de

mutaciones puntuales en el gen dhfr, que codifica a esta enzima.

• La resistencia a trimetoprim-sulfametoxazol entre las cepas de H. influenzae es común y es

causada por un aumento en la producción de DHFR con afinidad alterada por trimetoprim.

• Alrededor de 20% de las cepas chilenas de H. influenzae son resistentes a SXT (SIREVA 2012).

13-03-2017 Tecnología Medica 41

 Resistencia a otros agentes

• La resistencia a nuevos macrólidos (azitromicina), los que se usan comúnmente

para tratar infecciones de vías respiratorias, es poco frecuente en H. influenzae y
esta relacionada con la bomba de eflujo Acr-AB-TolC

• La resistencia a las fluoroquinolonas es también infrecuente y esta relacionada

con mutaciones solamente en la gyrA o mutaciones en la gyrA mas parC

• No se ha reportado resistencia a cefalosporinas de tercera generación ni a

carbapenemes.

13-03-2017 Tecnología Medica 42

 Resistencias Inusuales o Inexistentes
• Resistencia a cloranfenicol sin resistencia a ampicilina

• BLNAR

• BLPACR: Beta lactamasa positiva con resistencia a AMC

• Resistencia a cefotaxima, cefixima, cefepime.

• Resistencia a azitromicina

• Resistencia o sensibilidad reducida a fluorquinolonas.

13-03-2017 Tecnología Medica 43

13-03-2017 Tecnología Medica 44
Haemophilus ducreyi
• No es habitante normal de la biota
• Cocobacilos gram negativos pleomorficos
formando filamentos o “cardumen”
• Oxidasa negativo
• Catalasa Negativo (directo de la colonia)
• Muy susceptible a la temperaturas y deben
ser cultivado inmediatamente al ser
obtenida la muestra
• Cultivo se debe realizar a 33ºC y 5-10% CO2
además la jarra debe estar en humedad
constante que se logra con una gasa
humedecida con agua estéril (similar al
cultivo de Neisseria gonorrhoeae)

13-03-2017 45
Tecnología Medica
 Virulencia

13-03-2017 Tecnología Medica 46

CULTIVO
•
H. ducreyi requiere factores de crecimiento adicionales
y medios especiales para el cultivo en el laboratorio.
Dos tipos de medios utilizados en el laboratorio
incluyen

• Agar de chocolate basado en Mueller-Hinton

suplementado con 1% de IsoVitaleX y 3 μg / mL de
vancomicina y

• Agar basado en infusión cardíaca suplementado con

10% de suero bovino fetal y 3 μg / ml de vancomicina.
La vancomicina inhibe organismos colonizadores
gram-positivos del tracto genital

13-03-2017 Tecnología Medica 47

 Epidemiologia
• La enfermedad está asociada
con un bajo nivel
socioeconómico, mala higiene,
prostitución y abuso de drogas.
También se cree que las
trabajadoras sexuales
comerciales sirven como
reservorios para H. ducreyi.
• El chancroide es una infección
de transmisión sexual causada
por H. ducreyi que se
caracteriza generalmente por el
desarrollo de una única úlcera
genital dolorosa, con
linfadenopatía inguinal
asociada que ocurre 2 a 7 días
después de la exposición.

13-03-2017 Tecnología Medica 48

 Diagnostico
• Los estudios han demostrado que la precisión diagnóstica del chancroide basado
en la presentación clínica y la historia del paciente oscila entre 33-80%
• El cultivo es sensible al 50-75% con especifidad del 100%
• Se han desarrollado estrategias moleculares para detectar directamente H.
ducreyi a partir de muestras clínicas.
• Los cebadores para estos ensayos han sido diseñados para amplificar secuencias
de cualquiera de los genes del rRNA 16S de H. ducreyi, los ribosomal rrs (16S) -rrl
(23S)

• Debido a las dificultades para establecer un diagnóstico etiológico de la infección

por H. ducreyi y recursos limitados en muchos países de endemicidad, se
desconoce la verdadera incidencia del chancroide.

13-03-2017 Tecnología Medica 49

 TRATAMIENTO

13-03-2017 Tecnología Medica 50

Otros Haemophilus
Hemólisis

SI NO

H. influenzae
H. haemolyticus
H. parainfluenzae
H. ducreyi
H. aegypticus
H. aphrophilus
H. paraaphrophilus

13-03-2017 Tecnología Medica 51

Otros Haemophilus
Factores de crecimiento

Factor X Factor V Factor V y X

H. ducreyi H. parainfluenzae
Catalasa+ H. influenzae
ALA + H. aegypticus
H. paraaphrophilus Ureasa +
Catalasa - H. haemolyticus
Hemolisis +
Tecnología Medica
Caracteristicas
en el
Cultivo
Casos clínicos

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• ¿De que sospecharia?

13-03-2017 Tecnología Medica 55

Cocos Gram negativo
Neisseria
TME-147
Introducción ITS
• Cuadros clínicos infecto contagiosos trasmitidos por contacto
sexual , sangre y/o líq. Estériles o vía vertical.

• Ausencia de Respuesta Inmune (RI) protectora

• → Reinfecciones

• Problema de Salud Publica (SP)

• Riesgo VIH y otras ITS

• Incidencia y prevalencia real son desconocidas

 Uretritis Gonocócica o Gonorrea
• Gonorrea o blenorragia

• Descripciones clínicas desde A de C.

• Uretritis tras la infección por Neisseria gonorrhoeae

(Ng).

• Transmisión:
 Contacto sexual (vaginal, rectal o faríngea)
 Canal de parto

• 2° causa de ITS bacteriana.

• Infección exclusiva del humano.
Neisseria gonorrhoeae (Ng)

Bacteria gram (-), aerobia e inmóvil

1879: Albert Neisser
Relacionada con Neisseria meningitidis: precursor??
Disposición en pares “granos de café” (diplococo)
Fagocitada por PMN intracelular
Oxidasa positiva y sólo usa la glucosa para crecer
Crece en medios selectivos
Diagnóstico
Toma de muestra : factor crítico en rendimiento diag.
Muestra adecuada según sitio anatómico

• ♀:

Tinción de Gram: E: 95 %, S: 50% (presencia en cérvix de otros DGN

no patogénicos)
Dg. requiere cultivo de secreción endocervical en medio selectivo
Diagnóstico
• ♂:
• Tinción de Gram: S: 95% y E: 99% para secreción

• Suficiente para dg. de infección gonocócica.

• DGN extracelulares implica sospecha: debe confirmarse por cultivo

en medio selectivo (Thayer Martin).
 Laboratorio
Métodos Moleculares:

Mejor sensibilidad que cultivos en asintomáticos

Uso limitado para muestras urogenitales

No permite estudios de suscept. ATB y son más costosos

ELISA e IF en orina y secreción vaginal

Amplificación del ácido nucleico : PCR

 Historia de la Resistencia ATB

— Sulfanilamidas (1937) → PNC en (1943)

— PNC de 50.000 UI (1945) a 4.8 millones de UI (1974)

CDC: 1987 desaconsejan uso de PNC

— Quinolonas (Ciprofloxacino): droga ideal , 1º en 1993

— 2000: Cepas resistentes, CDC limita su uso y lo excluye el 2007.

— CFP: 3º G tratamiento de elección actual. Cepas con baja resistencia

en San Diego (2011). CDC: 250 mg.

— Régimen actual más efectivo: tratamiento dual: CFP 3º G +

Azitromicina
Esquemas de tratamiento
La guinda de la torta
1. N. meningitidis:
 1. N. meningitidis:
5 serogrupos (A, B, C, Y y W135)
reconocidos como causantes de epidemias.

Determinados por diferencias estructurales en PS

CDC, 2005; National Health and Medical Research Council, 2003

 1. N. meningitidis:
5 serogrupos (A, B, C, Y y W135)
reconocidos como causantes de epidemias.

Determinados por diferencias estructurales en PS

13 subtipos (química y antigénicamente

distintos)

Determinados por diferencias en las Proteinas

de Membrana Externa (OMP)

CDC, 2005; National Health and Medical Research Council, 2003

 1. Neisseria meningitidis
Cytoplasmic membrane
Cytoplasmic-membrane Periplasmic space
proteins Outer membrane

Lipooligosaccharide

Pilus

Polysaccharide
capsule
(serogroup)
Outer-membrane proteins
(serotype/serosubtype)
Phospholipi
d

Modified from Rosenstein NE, et al. N Engl J Med. 2001;344:1378-1388.

 1. Neisseria meningitidis
Cytoplasmic membrane
Cytoplasmic-membrane Periplasmic space
proteins Outer membrane

Lipooligosaccharide

Pilus

Polysaccharide
capsule
(serogroup)
Outer-membrane proteins
(serotype/serosubtype)
Phospholipi
d

Polisacárido capsular: Serogrupos (13)

A, B, C, W, Y

Modified from Rosenstein NE, et al. N Engl J Med. 2001;344:1378-1388.

 2. Vigilancia Integrada: Chile

Neisseria meningitidis es un agente que está sujeto a

vigilancia de laboratorio
 2. Vigilancia Integrada: Chile
Neisseria meningitidis es un agente que está sujeto a
vigilancia de laboratorio
D.S. 158 / 2004
Sistema de Vigilancia
de Agentes
Infecciosos en Chile
 2. Vigilancia Integrada: Chile
Neisseria meningitidis es un agente que está sujeto a
vigilancia de laboratorio
D.S. 158 / 2004
Sistema de Vigilancia
de Agentes
Infecciosos en Chile

Enfermedad
Meningocócica
Invasora

Enfermedad de
notificación
obligatoria e
inmediata
 2. Vigilancia Integrada: Chile
Neisseria meningitidis es un agente que está sujeto a
vigilancia de laboratorio

Neisseria meningitidis D.S. 158 / 2004

Sistema de Vigilancia
Sujeta a vigilancia de de Agentes
laboratorio y resistencia Infecciosos en Chile
a antimicrobianos

Enfermedad
Meningocócica
Invasora

Enfermedad de
notificación
obligatoria e
inmediata
 2. Vigilancia Integrada: Chile
Neisseria meningitidis es un agente que está sujeto a
vigilancia de laboratorio

Neisseria meningitidis D.S. 158 / 2004

Sistema de Vigilancia
Sujeta a vigilancia de de Agentes
laboratorio y resistencia Infecciosos en Chile
a antimicrobianos

Enfermedad
Meningocócica
Invasora

ISP: Enfermedad de
• Confirmar notificación
• Seroagrupar obligatoria e
• Resistencia inmediata
antimicrobiana
2. Cómo investigamos al Caso Sospechoso?
Caso sospechoso:
Paciente que presenta
fiebre súbita ≥ 38°C y
cefalea asociada a:
•Alteración de conciencia:
somnolencia, confusión
(Escala de Glasgow)
•Rigidez de nuca
•Signos de irritación
meníngea (Kernig-
Brudzinski)
•Rash purpúrico o petequias
2. Cómo investigamos al Caso Sospechoso?
Caso sospechoso:
Paciente que presenta
fiebre súbita ≥ 38°C y
cefalea asociada a: Laboratorio local:
Muestras estériles • Tinción de Gram en
•Alteración de conciencia: (hemocultivo, L.C.R.) búsqueda de
somnolencia, confusión diplococos Gram (-)
(Escala de Glasgow) • Estudio citoquímico
•Rigidez de nuca del L.C.R.
•Signos de irritación • Cultivo
meníngea (Kernig-
Brudzinski)
•Rash purpúrico o petequias
2. Cómo investigamos al Caso Sospechoso?
Caso sospechoso:
Paciente que presenta
fiebre súbita ≥ 38°C y
cefalea asociada a: Laboratorio local:
Muestras estériles • Tinción de Gram en
•Alteración de conciencia: (hemocultivo, L.C.R.) búsqueda de
somnolencia, confusión diplococos Gram (-)
(Escala de Glasgow) • Estudio citoquímico
•Rigidez de nuca del L.C.R.
•Signos de irritación • Cultivo
meníngea (Kernig-
Brudzinski)
•Rash purpúrico o petequias (+) (─)

100% L.C.R.

ISP ISP
2. Vigilancia LCR por PCR en Tiempo Real
Laboratorio local envía al ISP, una muestra de LCR, si a las 24 hrs. no
presenta desarrollo el cultivo de LCR o hemocultivo; cumpliendo con las
siguientes condiciones:

Criterio de laboratorio
Criterio Clínico-Epidemiológico
Estudio citoquímico de LCR
sugerente de meningitis y/o Caso sospechoso de meningitis
bacteriana según:
bacteriana:
Circular B.51 Nº 50 de 2011,
Recuento de leucocitos > 100
MINSAL.
células / mm3.
2. Vigilancia de Laboratorio
Confirmación de Cepas

Seroagrupación
Estudio Susceptibilidad Standard CLSI
Diagnóstico en LCR: PCR-TR
Caracterización Molecular:

 Subtipificación: PFGE MLST,

Por A.

MLST: Gold Standard para relaciones evolutivas

PFGE: Gold Standard para análisis de brotes
2. Subtipificación
Mult
por Secuenciación de
Multilocus
ISP Chile

Selección y Amplificación por PCR de Secuenciación de fragmentos internos (~300-

Siete Genes Esenciales (housekeeping 500 bp) de Siete Genes en los Aislamientos.
genes) a partir de ADN genómico.

Análisis Filogenético Basado

en las Diferencias entre Comparación de Secuencias y Asignación de
Secuencias para Inferir Tipos Número de Alelo y Tipo de Secuencia (ST), en
de Relaciones Genéticas entre base de datos mundial MLST.net
Aislamientos.