Microdilución en Caldo - Antifungicos

fundacion
Universitaria Juan N. Corpas
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Micología médica básica, 5e
CAPÍTULO 39: Pruebas de susceptibilidad
antifúngica
Gloria M.; González G.
Introducción
Durante las últimas décadas la frecuencia y variedad de infecciones micóticas invasivas se han incrementado en forma importante. Esta
tendencia se atribuye al aumento en la población de pacientes severamente enfermos o inmunocomprometidos, al uso cada vez más frecuente
de procedimientos médicos invasivos, al tratamiento con esteroides o antibióticos de amplio espectro, a estancias intrahospitalarias
prolongadas, a la mayor sobrevida de los pacientes prematuros, etcétera.
Ante tal incremento de infecciones fúngicas, la respuesta de la industria farmacéutica ha sido la generación de nuevos agentes antimicóticos con
una potente actividad, menor toxicidad y mejores perfiles farmacológicos. Estos esfuerzos culminaron con el advenimiento de mejores
formulaciones de anfotericina B (lipídica, liposomal y de dispersión coloidal), recientes triazoles y una nueva familia de antimicóticos denominada
equinocandinas. Con esta proliferación de compuestos se tienen en la actualidad numerosas opciones terapéuticas, por lo que los clínicos
pueden seleccionar el medicamento que dé la mejor respuesta en determinado caso. Sin embargo, el número creciente de reportes sobre el
desarrollo de resistencia a uno o varios compuestos hace que esta decisión sea más difícil.
La expansión de compuestos antimicóticos fue un factor decisivo que creó la necesidad de desarrollar pruebas de susceptibilidad in vitro,
estandarizadas y clínicamente relevantes, a fin de ser utilizadas como guías en las decisiones terapéuticas, así como para evaluar la actividad
antifúngica en las diferentes fases del desarrollo de nuevos medicamentos por parte de las compañías farmacéuticas. Asimismo, se orienta su
uso en estudios de vigilancia epidemiológica, en los cuales es indispensable contar con procedimientos reproducibles que permitan la detección
de resistencia en microorganismos inicialmente susceptibles.
En 1982, el National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS), ahora conocido como Clinical and Laboratory Standards Institute
(CLSI), conformó un subcomité que se encargó de evaluar la práctica común de las pruebas de susceptibilidad con antimicóticos en los
hospitales de Estados Unidos. Los resultados obtenidos de esa investigación demostraron la pobre precisión interlaboratorio de las pruebas de
susceptibilidad practicadas en esa época, hecho que se atribuyó a la definición insuficiente de cada uno de los parámetros de las pruebas en el
momento de llevarlas a cabo. Sin embargo, quedó claro que el mejoramiento en la estandarización de las mismas era necesario antes de que
sus resultados se aplicaran a situaciones clínicas.
La capacidad para calcular una concentración mínima inhibitoria (CMI) es de poco valor sin la habilidad correspondiente para interpretar su
significado clínico. La limitación de estos estudios de laboratorio radica en que son altamente artificiales, de tal manera que algunas veces sólo
puede lograrse una correlación modesta entre las pruebas de susceptibilidad in vitro y la respuesta a la infección clínica. La predicción de la
evolución clínica es un asunto en extremo difícil, donde la CMI es sólo un factor que participa junto con otros y que depende de tres condiciones: el
medicamento, el huésped y el agente etiológico.
Hay cuatro principios básicos a tomar en cuenta en la interpretación de los resultados en las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana:
1. Una CMI no es una medición física o química.
2. Con frecuencia, ciertos factores del paciente son más importantes que los resultados de las pruebas de susceptibilidad en la determinación
de la evolución clínica.
3. La susceptibilidad in vitro no siempre predice el éxito de una terapia específica.
4. La resistencia in vitro con frecuencia se correlaciona con fracaso en el tratamiento.
En la actualidad el CLSI ha publicado cuatro documentos con información de las pruebas de susceptibilidad con antifúngicos, mismos que se
consideran en este apartado.
Métodos de dilución en caldo para levaduras
Después de reconocer la poca reproducibilidad interlaboratorio de las pruebas de susceptibilidad con antifúngicos que se estaban realizando, un
gran número de investigadores inició una serie de estudios que culminaron en el desarrollo, por el CLSI en 1997, del documento M27A
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(aprobatorio), el cual proporciona la información para implementar los procedimientos de macrodilución y microdilución en caldo para la
CAPÍTULO 39: Pruebas de susceptibilidad antifúngica, Gloria M.; González G. Page 1 / 10
determinación de susceptibilidad en levaduras tales como Candida spp. y Cryptococcus neoformans. Contiene información sobre la elaboración
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y concentración de los inóculos, composición del medio de cultivo, tiempo y temperatura de incubación; preparación de los antifúngicos, los
requerimientos de control de calidad y la definición de la lectura de la CMI para: anfotericina B, 5fluorocitosina, ketoconazol, fluconazol e
itraconazol (imágenes 391 y 392). La publicación de este protocolo fue el resultado de cerca de 15 años de trabajo para estandarizar las
En la actualidad el CLSI ha publicado cuatro documentos con información de las pruebas de susceptibilidad con antifúngicos, mismos que se
fundacion Universitaria Juan N. Corpas
consideran en este apartado.
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Métodos de dilución en caldo para levaduras
Después de reconocer la poca reproducibilidad interlaboratorio de las pruebas de susceptibilidad con antifúngicos que se estaban realizando, un
gran número de investigadores inició una serie de estudios que culminaron en el desarrollo, por el CLSI en 1997, del documento M27A
(aprobatorio), el cual proporciona la información para implementar los procedimientos de macrodilución y microdilución en caldo para la
determinación de susceptibilidad en levaduras tales como Candida spp. y Cryptococcus neoformans. Contiene información sobre la elaboración
y concentración de los inóculos, composición del medio de cultivo, tiempo y temperatura de incubación; preparación de los antifúngicos, los
requerimientos de control de calidad y la definición de la lectura de la CMI para: anfotericina B, 5fluorocitosina, ketoconazol, fluconazol e
itraconazol (imágenes 391 y 392). La publicación de este protocolo fue el resultado de cerca de 15 años de trabajo para estandarizar las
pruebas de susceptibilidad con antimicóticos y la metodología descrita, la cual, aunque imperfecta, tiene la gran ventaja de poseer una amplia
reproducibilidad interlaboratorio. En 2002, el CLSI publicó el documento M27A2, mismo que proporciona la definición de la lectura de CMI y los
límites de control de calidad para los nuevos triazoles: voriconazol, posaconazol y ravuconazol.
Imagen 391
Concentración mínima inhibitoria (CMI) de anfotericina B frente a un aislamiento de Candida parapsilosis. CMI = 0.5 μg/ml.
Imagen 392
Concentración mínima inhibitoria (CMI) de fluconazol frente a un aislamiento de Candida tropicalis. CMI = 8 μg/ml.
La continua evaluación por parte de los miembros del CLSI a dicho documento hizo que en el año 2008 se generara otra edición, denominada
M27A3, la cual contiene modificaciones en la lectura de la CMI y tiempos de incubación, e información sobre la lectura e interpretación de los
resultados de las pruebas de susceptibilidad para nuevos agentes antifúngicos: caspofungina, anidulafungina y micafungina; se establece una
escala numérica para la comparación de la lectura visual de la cantidad de crecimiento en los tubos control y, finalmente, incluye los métodos de
macrodilución y microdilución para proporcionar resultados similares de CMI (cuadro 391).
Cuadro 391
Resumen de la metodología para hacer pruebas de susceptibilidad con antifúngicos en Candida spp. y Cryptococcus neoformans.
Variables Metodología M27A3 (2008)
Subcultivo en agar dextrosa Sabouraud o agar papa dextrosa
Preparación del
Suspensión en solución salina 0.85% o agua estéril
inóculo
Método espectrofotométrico
Medio de
RPMI1640 con MOPS 0.165 M
cultivo
pH 7.0 ± 0.1
Concentración
del inóculo 0.5 a 2.5 × 102 UFC/ml
La continua evaluación por parte de los miembros del CLSI a dicho documento hizo que en el año 2008 se generara otra edición, denominada
M27A3, la cual contiene modificaciones en la lectura de la CMI y tiempos de incubación, e información sobre la lectura e interpretación de los
resultados de las pruebas de susceptibilidad para nuevos agentes antifúngicos: caspofungina, anidulafungina y micafungina; se establece una
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escala numérica para la comparación de la lectura visual de la cantidad de crecimiento en los tubos control y, finalmente, incluye los métodos de
macrodilución y microdilución para proporcionar resultados similares de CMI (cuadro 391).
Cuadro 391
Resumen de la metodología para hacer pruebas de susceptibilidad con antifúngicos en Candida spp. y Cryptococcus neoformans.
Subcultivo en agar dextrosa Sabouraud o agar papa dextrosa
Preparación del
Suspensión en solución salina 0.85% o agua estéril
inóculo
Medio de
RPMI1640 con MOPS 0.165 M
cultivo
pH 7.0 ± 0.1
Concentración
del inóculo 0.5 a 2.5 × 102 UFC/ml
Temperatura de
35 °C
incubación
Candida spp.
24 horas: caspofungina, anidulafungina, micafungina.
Tiempo de 24 a 48 horas: anfotericina B, fluconazol.
incubación 48 horas: 5fluorocitosina, itraconazol, voriconazol, ravuconazol, posaconazol.
Cryptococcus neoformans
72 horas para todos los antifúngicos
5fluorocitosina, ketoconazol, fluconazol, itraconazol, voriconazol, posaconazol, ravuconazol: 50% reducción en turbidez en
Lectura de CMI
comparación con el tubo control de crecimiento. Anfotericina B: ausencia de turbidez visible
Control de C. parapsilosis ATCC 22019
calidad
C. krusei ATCC 6258
Uno de los primeros intentos para correlacionar la información de susceptibilidad antifúngica in vitro, con la respuesta clínica en pacientes, fue
realizado por Ghannoum y colaboradores, en 1996. Las conclusiones de su trabajo fueron que las pruebas de susceptibilidad in vitro podrían
predecir la evolución clínica sólo en situaciones clínicas seleccionadas, tales como candidosis orofaríngea en pacientes con HIVSIDA tratados
con fluconazol. En ese mismo trabajo se demostró la carencia de correlación de casos clínicos más complejos, tales como las poblaciones
heterogéneas de pacientes con candidosis invasiva. Por otro lado, Rex y coautores establecieron los puntos de corte tentativos de las CMI para
fluconazol e itraconazol en aislamientos de Candida spp., de pacientes con HIVSIDA que padecían candidosis orofaríngea; y para fluconazol en
pacientes con candidosis invasiva. En este estudio se evaluaron 636 aislamientos de Candida spp.; de éstos, 528 fueron de candidosis
orofaríngea en HIVSIDA tratados con fluconazol, que correspondían a: C. albicans (77%), C. glabrata (13%), C. tropicalis (5%), C. krusei (3%) y
otras especies (2%); y 108 aislamientos de pacientes no neutropénicos con candidosis visceral y candidemia, tratados con fluconazol. Basados
en los resultados obtenidos in vitro e in vivo se estableció la siguiente categorización de los aislamientos clínicos: Susceptibles (S), aquellos con
CMI ≤ 8 μg/ml; susceptibles dependiendo de la dosis (SDD), aquellos con CMI de 16 a 32 μg/ml, y resistentes (R), los que tuvieron una CMI 64 ≥
μg/ml para el fluconazol. Los aislamientos categorizados como SDD fueron aquellos que respondieron a dosis altas de fluconazol.
En este trabajo se estableció que la respuesta de los pacientes tratados con fluconazol varió de acuerdo con las CMI determinadas en los
aislamientos clínicos, y que pueden usarse dosis más altas de fluconazol para el tratamiento de pacientes infectados con aislamientos cuyas CMI
son más altas; además, se demostró que es más probable el fracaso del tratamiento con fluconazol cuando las CMI, determinadas por la
metodología del CLSI, exceden los picos predictivos de niveles séricos del fármaco. Estas conclusiones fueron contundentes para pacientes con
candidosis orofaríngea e infección por C. albicans, pero fue menos categórica la correlación entre las CMI y la evolución clínica de pacientes con
infecciones por Candida noalbicans y para candidosis invasivas. Asimismo, se describió la situación muy particular de C. krusei, donde la
definición de susceptible y resistente no es válida, ya que es considerado intrínsecamente resistente al fluconazol.
En ese mismo estudio se evaluaron aislamientos de Candida spp., en pacientes con HIVSIDA y candidosis orofaríngea tratados con itraconazol;
los 355 aislamientos correspondieron a: C. albicans (87%), C. glabrata (9%), C. krusei (2%) y otras especies (2%). Así como en el caso del
fluconazol, los datos clínicos y su correlación con la farmacocinética del itraconazol permitieron concluir que la respuesta de la candidosis
orofaríngea al tratamiento con éste, varió según la CMI determinada en las pruebas de susceptibilidad. Con base en los resultados obtenidos in
vitro e in vivo se estableció la siguiente clasificación de los aislamientos clínicos: Susceptibles (S), aquellos con CMI ≤ 0.125 μg/ml; susceptibles
dependiendo de la dosis (SDD), aquellos con CMI de 0.25 a 0.5 μg/ml, y resistentes (R), los que tuvieron una CMI ≥ 1 μg/ml para el itraconazol.
Utilizando estos puntos de corte, se han encontrado los siguientes patrones generales: C. albicans, C. parapsilosis y C. tropicalis, por lo general
son susceptibles al fluconazol, mientras que las CMI de C. glabrata están típicamente entre la categoría de susceptible dependiente de la dosis y
resistente. Para el itraconazol, C. glabrata y C. krusei con frecuencia tienen CMI en la categoría de susceptibles dependiendo de la dosis y
resistentes, mientras que las otras especies de Candida son en general susceptibles. Por lo regular, los triazoles, incluyendo la última generación:
voriconazol y posaconazol, son menos activos contra cepas de C. glabrata que contra aislamientos de C. albicans; C. krusei es, como ya se
En ese mismo estudio se evaluaron aislamientos de Candida spp., en pacientes con HIVSIDA y candidosis orofaríngea tratados con itraconazol;
los 355 aislamientos correspondieron a: C. albicans (87%), C. glabrata (9%), C. krusei (2%) y otras especies (2%). Así como en el caso del
fluconazol, los datos clínicos y su correlación con la farmacocinética del itraconazol permitieron concluir que la respuesta de la candidosis
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orofaríngea al tratamiento con éste, varió según la CMI determinada en las pruebas de susceptibilidad. Con base en los resultados obtenidos in
vitro e in vivo se estableció la siguiente clasificación de los aislamientos clínicos: Susceptibles (S), aquellos con CMI ≤ 0.125 μg/ml; susceptibles
dependiendo de la dosis (SDD), aquellos con CMI de 0.25 a 0.5 μg/ml, y resistentes (R), los que tuvieron una CMI ≥ 1 μg/ml para el itraconazol.
Utilizando estos puntos de corte, se han encontrado los siguientes patrones generales: C. albicans, C. parapsilosis y C. tropicalis, por lo general
son susceptibles al fluconazol, mientras que las CMI de C. glabrata están típicamente entre la categoría de susceptible dependiente de la dosis y
resistente. Para el itraconazol, C. glabrata y C. krusei con frecuencia tienen CMI en la categoría de susceptibles dependiendo de la dosis y
resistentes, mientras que las otras especies de Candida son en general susceptibles. Por lo regular, los triazoles, incluyendo la última generación:
voriconazol y posaconazol, son menos activos contra cepas de C. glabrata que contra aislamientos de C. albicans; C. krusei es, como ya se
mencionó, intrínsecamente resistente al fluconazol y resistente o susceptible dependiente de la dosis al itraconazol.
La actividad de la anfotericina B contra levaduras en las pruebas de susceptibilidad ha sido difícil de evaluar. Ningún documento M27 permite la
detección de aislamientos de Candida spp. resistentes. La información disponible en la actualidad indica que aislamientos de Candida spp., con
una CMI > 1 μg/ml, quizá sean resistentes a la anfotericina B; este fenómeno es inusual pero se ha descrito en casi todas las especies de
Candida, en particular en aislamientos de C. lusitaniae, C. krusei, C. guilliermondii y C. glabrata.
Los puntos de corte de las CMI de voriconazol contra aislamientos de Candida spp., fueron publicados por Pfaller y colaboradores. Se tomaron
en cuenta resultados de las pruebas de susceptibilidad in vitro, información de estudios en modelos animales, datos obtenidos a partir de
estudios farmacocinéticos y farmacodinámicos e información clínica de pacientes tratados con este medicamento. Basados en los resultados
obtenidos in vitro e in vivo, se estableció la siguiente categorización de los aislamientos clínicos: susceptibles (S), aquellos con CMI ≤ 1 μg/ml;
susceptibles dependiendo de la dosis (SDD), aquellos con CMI de 2 μg/ml y resistentes (R), los que tuvieron una CMI ≥ 4 μg/ml, para el
voriconazol.
Actualmente, los puntos de corte para las equinocandinas caspofungina, anidulafungina y micafungina se encuentran en un nivel de “tentativos”.
Sólo se han descrito dos categorías en los aislamientos clínicos: susceptibles y no susceptibles. Aquellos aislamientos con CMI ≤ 2 μg/ml son
considerados susceptibles y los que presentan CMI > 2 μg/ml son calificados como no susceptibles.
Métodos de dilución en caldo para hongos filamentosos
Muchos de los parámetros de las pruebas de susceptibilidad para levaduras fueron utilizados en el desarrollo de los procedimientos in vitro para
hongos filamentosos. En 1998, el CLSI publicó el documento M38P que alcanzó el nivel de aprobación en 2002 (M38A).
El procedimiento detalla la metodología de macrodilución y microdilución en caldo para la determinación de susceptibilidad en los hongos
filamentosos más comunes que causan micosis invasivas como Aspergillus spp., Fusarium spp., Rhizopus spp., Pseudallescheria boydii
(Sedosporium boydii) y Sporothrix schenckii s.l. Contiene información sobre la elaboración y concentración de los inóculos, composición del
medio de cultivo, condiciones de incubación, preparación de los antifúngicos, criterios de control de calidad y la descripción de la lectura de CMI
para anfotericina B, 5fluorocitosina, ketoconazol, fluconazol, itraconazol, voriconazol, posaconazol y ravuconazol.
En 2008, el CLSI publicó la segunda revisión del documento designándolo M38A2, el cual contiene material adicional concerniente al control de
calidad de las pruebas; se dan las recomendaciones para evaluar susceptibilidad de equinocandinas y antifúngicos contra dermatofitos, se
añaden las recomendaciones sobre la preparación de inóculos en dermatofitos, se introduce el concepto de CME (concentración mínima
efectiva) y su comparación con el concepto tradicional de CMI (cuadro 392).
Cuadro 392
Resumen de la metodología para hacer pruebas de susceptibilidad con antifúngicos en hongos filamentosos.
Variables Metodología M38A2
Subcultivo en agar papa dextrosa
Preparación
Suspensión en solución salina 0.85%
del inóculo
Medio de
RPMI1640/MOPS 0.165 M
cultivo/buffer
pH 7.0 ± 0.1
4
Concentración No dermatofitos: 0.4 a 5 × 10 UFC/ml
del inóculo
Dermatofitos: 1 a 3 × 103 UFC/ml
Temperatura
35 °C
de incubación
Rhizopus spp.: 21 a 26 horas
Tiempo de Fusarium spp., Aspergillus spp., S. schenckii: 46 a 50 horas
incubación
Pseudallescheria boydii: 70 a 74 horas
Dermatofitos: después de 96 horas
Anfotericina B: ausencia de turbidez visible (100% inhibición) para hongos dermatofitos y no dermatofitos.
para anfotericina B, 5fluorocitosina, ketoconazol, fluconazol, itraconazol, voriconazol, posaconazol y ravuconazol.
En 2008, el CLSI publicó la segunda revisión del documento designándolo M38A2, el cual contiene material adicional concerniente al control de
calidad de las pruebas; se dan las recomendaciones para evaluar susceptibilidad de equinocandinas y antifúngicos contra dermatofitos, se
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añaden las recomendaciones sobre la preparación de inóculos en dermatofitos, se introduce el concepto de CME (concentración mínima
efectiva) y su comparación con el concepto tradicional de CMI (cuadro 392).
Cuadro 392
Resumen de la metodología para hacer pruebas de susceptibilidad con antifúngicos en hongos filamentosos.
Variables Metodología M38A2
Preparación
Suspensión en solución salina 0.85%
del inóculo
Medio de
RPMI1640/MOPS 0.165 M
cultivo/buffer
pH 7.0 ± 0.1
4
Concentración No dermatofitos: 0.4 a 5 × 10 UFC/ml
del inóculo
Dermatofitos: 1 a 3 × 103 UFC/ml
Temperatura
35 °C
de incubación
Rhizopus spp.: 21 a 26 horas
Tiempo de Fusarium spp., Aspergillus spp., S. schenckii: 46 a 50 horas
incubación
Pseudallescheria boydii: 70 a 74 horas
Dermatofitos: después de 96 horas
Anfotericina B: ausencia de turbidez visible (100% inhibición) para hongos dermatofitos y no dermatofitos.
Fluconazol, 5fluorocitosina, Ketoconazol: 50% reducción en turbidez en comparación con el tubo control de crecimiento, para
no dermatofitos. Un 80% o más de reducción en turbidez para dermatofitos
Lectura de
Itraconazol, posaconazol, ravuconazol y voriconazol: ausencia de turbidez visible (100% de inhibición) para no dermatofitos. Un
CMI
80% o más de reducción en turbidez para dermatofitos.
Equinocandinas (caspofungina, anidulafungina y micafungina): aplicar el concepto de concentración mínima efectiva (CME), la
cual consiste en la más baja concentración de antifúngico que lleva a la formación de formas hifales compactas, pequeñas,
redondeadas.
C. parapsilosis ATCC 22019
Control de
C. krusei ATCC 6258
calidad
A. flavus ATCC 204304
Debido a que la frecuencia de infecciones por hongos filamentosos oportunistas es baja, no es factible llevar a cabo estudios prospectivos con un
número grande de pacientes de los cuales se aíslen cepas con diferentes CMI, y se comparen con la evolución clínica del tratamiento
antimicótico. Por esta razón, se ha estudiado la relevancia de las CMI de los hongos emitidas por las pruebas de susceptibilidad, con los
resultados del tratamiento en sistemas de prueba animal.
Los modelos animales se utilizan con frecuencia inicialmente para establecer una correlación entre los resultados de las pruebas de
susceptibilidad in vitro y la evolución clínica de la enfermedad inducida a nivel artificial. Estos estudios ofrecen la ventaja de una integración total
de los resultados de los factores antimicóticos y del hospedero. El efecto de la CMI puede estudiarse con detalle al ejecutar estudios paralelos de
microorganismos que difieren sólo en su susceptibilidad in vitro. Este procedimiento es muy efectivo, y los estudios con agentes antifúngicos han
demostrado con regularidad una correlación general entre la CMI y la evolución clínica de la enfermedad. No obstante, resulta desafortunado que
los modelos animales no siempre reproducen la infección humana; además, la cinética de las drogas con frecuencia difiere en esencia entre los
seres humanos y otros animales. Sin embargo, este tipo de investigación puede proporcionar un punto de inicio muy útil para el establecimiento
de la correlación entre los resultados tanto in vitro como in vivo.
Odds y colaboradores evaluaron la posible correlación entre los resultados de pruebas de susceptibilidad in vitro de aislamientos de A.
fumigatus, A. flavus, F. oxysporum, F. solani, P. boydii y R. arrhizus (R.oryzae) y la evolución del tratamiento con anfotericina B e itraconazol en
modelos animales con ratones y cobayos. Sus conclusiones arrojaron sólo una modesta correlación in vivo e in vitro y, por tanto, sugirieron que el
valor predictivo de las CMI generadas por estas pruebas de susceptibilidad ameritaba mayor investigación.
EspinelIngroff y colaboradores estudiaron otros hongos filamentosos que son importantes agentes etiológicos de infecciones severas, en
particular en el escenario de pacientes inmunocomprometidos. Se incluyeron aislamientos clínicos de: Bipolaris hawaiiensis, B. spicifera,
Cladophialophora bantiana, Dactylaria constricta, Purpureocillium lilacinum (antes: Paecilomyces), Scedosporium prolificans, Trichoderma
longibrachiatum y Exophiala dermatitidis. Los fármacos evaluados en este estudio fueron: itraconazol, voriconazol, posaconazol, ravuconazol y
anfotericina B. Sus resultados mostraron una mayor precisión interlaboratorio, cuando el punto de corte para leer la CMI en todos los
antimicóticos se llevó a cabo en 100% de inhibición del crecimiento fúngico. Se propuso además que estos resultados merecían ser tomados en
de la correlación entre los resultados tanto in vitro como in vivo.
Odds y colaboradores evaluaron la posible correlación entre los resultados de pruebas de susceptibilidad in vitro de aislamientos de A.
fumigatus, A. flavus, F. oxysporum, F. solani, P. boydii y R. arrhizus (R.oryzae) y la evolución del tratamiento con anfotericina B e itraconazol en
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modelos animales con ratones y cobayos. Sus conclusiones arrojaron sólo una modesta correlación in vivo e in vitro y, por tanto, sugirieron que el
valor predictivo de las CMI generadas por estas pruebas de susceptibilidad ameritaba mayor investigación.
EspinelIngroff y colaboradores estudiaron otros hongos filamentosos que son importantes agentes etiológicos de infecciones severas, en
particular en el escenario de pacientes inmunocomprometidos. Se incluyeron aislamientos clínicos de: Bipolaris hawaiiensis, B. spicifera,
Cladophialophora bantiana, Dactylaria constricta, Purpureocillium lilacinum (antes: Paecilomyces), Scedosporium prolificans, Trichoderma
longibrachiatum y Exophiala dermatitidis. Los fármacos evaluados en este estudio fueron: itraconazol, voriconazol, posaconazol, ravuconazol y
anfotericina B. Sus resultados mostraron una mayor precisión interlaboratorio, cuando el punto de corte para leer la CMI en todos los
antimicóticos se llevó a cabo en 100% de inhibición del crecimiento fúngico. Se propuso además que estos resultados merecían ser tomados en
cuenta para incluirlos en las posteriores revisiones del protocolo M38A.
La evaluación de la actividad antifúngica in vitro de las equinocandinas contra los hongos filamentosos representa un reto para la metodología
presente. Las diferentes equinocandinas tienen una acción fungicida comprobada contra Candida spp., causando la destrucción de las células
metabólicamente activas; su actividad contra Aspergillus spp. es más compleja; causan daño sólo en los extremos hifales metabólicamente
activos; se asume que este efecto previene la dispersión del hongo y, por tanto, su acción es considerada fungistática contra Aspergillus y otros
hongos filamentosos.
El criterio del punto de corte en las pruebas de susceptibilidad ocupa una posición central entre las numerosas variables que pueden influir en los
resultados de estos ensayos. Estudios in vitro con Aspergillus spp. mostraron la presencia de crecimiento del hongo en todas las
concentraciones ensayadas con las diferentes equinocandinas. Se formuló la posibilidad de cambiar el parámetro de CMI en las pruebas de
susceptibilidad in vitro por otro parámetro que realmente reflejara la actividad mostrada in vivo por esta clase de compuestos. Kurtz y coautores
hicieron observaciones microscópicas de las hifas que se encontraban en los pozos de la placa de microtitulación y mostraron que en presencia
de caspofungina, las hifas estaban distalmente divididas y muy engrosadas en sus extremos. Desde el punto de vista macroscópico, estos
cambios correspondieron a la producción de grumos o microcolonias de crecimiento fúngico en los pozos de las placas. Por ello surgió el término
de concentración mínima efectiva (CME) como el nuevo punto de corte en la determinación de susceptibilidad in vitro, con compuestos de esta
naturaleza química para el caso de los hongos filamentosos.
Método de difusión en disco para levaduras
Con el objetivo de desarrollar pruebas de susceptibilidad que fuesen más rápidas, menos laboriosas y de menor costo en el laboratorio clínico,
se inició una serie de estudios que llevaron a la elaboración del documento M44A en 2004. En el año 2009, el CLSI publicó la segunda edición
conocida como M44A2.
La metodología especifica la implementación del procedimiento de difusión en disco para la determinación de susceptibilidad en Candida spp.
Contiene información sobre la preparación y concentración de los inóculos, medio de cultivo, condiciones de incubación, requisitos de control de
calidad y la definición de la lectura de la CMI para: fluconazol, voriconazol y caspofungina (cuadro 393).
Cuadro 393
Resumen de la metodología para hacer pruebas de susceptibilidad con antifúngicos en Candida spp.
Subcultivo en agar sangre o agar dextrosa Sabouraud
Preparación del inóculo Suspensión en solución salina 0.85%
Agar MüellerHinton
Medio de cultivo 2% glucosa
0.5 μg/ml azul de metileno
pH 7.2 a 7.4
Concentración del inóculo 1 a 5 × 106 UFC/ml
1 μg (voriconazol)
Concentración de antifúngico 5 μg (caspofungina)
25 μg (fluconazol)
Temperatura de incubación 35 °C
Tiempo de incubación 20 a 24 horas
Lectura de CMI mm de inhibición de crecimiento
C. krusei ATCC 6258
CAPÍTULO 39: Pruebas de susceptibilidad antifúngica, Gloria M.; González G.
Control de calidad Page 6 / 10
C. albicans ATCC 90028
C. tropicalis ATCC 750
se inició una serie de estudios que llevaron a la elaboración del documento M44A en 2004. En el año 2009, el CLSI publicó la segunda edición
conocida como M44A2.
La metodología especifica la implementación del procedimiento de difusión en disco para la determinación de susceptibilidad en Candida spp.
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Contiene información sobre la preparación y concentración de los inóculos, medio de cultivo, condiciones de incubación, requisitos de control de
calidad y la definición de la lectura de la CMI para: fluconazol, voriconazol y caspofungina (cuadro 393).
Cuadro 393
Resumen de la metodología para hacer pruebas de susceptibilidad con antifúngicos en Candida spp.
Subcultivo en agar sangre o agar dextrosa Sabouraud
Agar MüellerHinton
Medio de cultivo 2% glucosa
0.5 μg/ml azul de metileno
pH 7.2 a 7.4
Concentración del inóculo 1 a 5 × 106 UFC/ml
1 μg (voriconazol)
Concentración de antifúngico 5 μg (caspofungina)
25 μg (fluconazol)
Tiempo de incubación 20 a 24 horas
Lectura de CMI mm de inhibición de crecimiento
C. krusei ATCC 6258
Control de calidad
C. tropicalis ATCC 750
Basados en resultados obtenidos in vitro e in vivo se estableció la siguiente clasificación de los aislamientos clínicos para el fluconazol: 1)
susceptibles (S), aquellos con CMI ≥ 19 mm; 2) susceptibles dependiendo de la dosis (SDD), aquellos con una CMI entre 15 y 18 mm, y 3)
resistentes (R), aquellos que tuvieron una CMI ≤ 14 mm en la inhibición del crecimiento.
Para el voriconazol la categorización de los aislamientos es: 1) susceptible (S), aquellos con una CMI ≥ 17 mm; 2) susceptibles dependiendo de
la dosis (SDD), aquellos aislamientos con una CMI de 14 a 16 mm, y 3) resistentes (R), aquellos con CMI ≤ 13 mm de inhibición del crecimiento,
mientras que para la caspofungina, la tipificación de los aislamientos es: 1) susceptibles (S), aquellos con una CMI ≥ 11 mm, y 2) no susceptibles
(NS), para aquellos que tuviesen una CMI ≤ 10 mm.
Para estos antimicóticos las zonas de inhibición del crecimiento en levaduras del género Candida se correlacionan con las CMI de las pruebas
de susceptibilidad de dilución en caldo.
Método de difusión en disco para hongos filamentosos no dermatofitos
La metodología de difusión en disco empleada para levaduras sirvió para el desarrollo de la misma prueba en hongos filamentosos no
dermatofitos. En 2009, el CLSI publicó el documento de propuesta conocido como M51P, el cual alcanzó el nivel de aprobación en 2010 (M51
A). Fue desarrollado para los siguientes hongos filamentosos: Alternaria spp., Aspergillus spp., Bipolaris spp., Fusarium spp., Paecilomyces
spp., Mucorales y Pseudallescheria boydii. Los antifúngicos que pueden utilizarse son anfotericina B, itraconazol, posaconazol, caspofungina y
voriconazol (cuadro 394).
Cuadro 394
Resumen de la metodología para hacer pruebas de susceptibilidad en hongos filamentosos no dermatofitos.
Variables Metodología M51 (2009)
Medio de cultivo Agar MüellerHinton
pH 7.2 a 7.4
Concentración del inóculo 0.45 × 106 UFC/ml
La metodología de difusión en disco empleada para levaduras sirvió para el desarrollo de la misma prueba en hongos filamentosos no
dermatofitos. En 2009, el CLSI publicó el documento de propuesta conocido como M51P, el cual alcanzó el nivel de aprobación en 2010 (M51
A). Fue desarrollado para los siguientes hongos filamentosos: Alternaria spp., Aspergillus spp., Bipolaris spp., Fusarium spp., Paecilomyces
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spp., Mucorales y Pseudallescheria boydii. Los antifúngicos que pueden utilizarse son anfotericina B, itraconazol, posaconazol, caspofungina y
voriconazol (cuadro 394).
Cuadro 394
Resumen de la metodología para hacer pruebas de susceptibilidad en hongos filamentosos no dermatofitos.
Variables Metodología M51 (2009)
Medio de cultivo Agar MüellerHinton
pH 7.2 a 7.4
Concentración del inóculo 0.45 × 106 UFC/ml
10 μg (anfotericina B)
5 μg (caspofungina)
Concentración de antifúngico 10 μg (itraconazol)
5 μg (posaconazol)
1 μg (voriconazol)
16 a 24 horas: Mucorales
Tiempo de incubación 24 a 48 horas: Aspergillus spp.
48 a 72 horas: Alternaria spp., Bipolaris spp., Fusarium spp., Paecilomyces spp., Pseudallescheriaboydii
Lectura de CMI mm inhibición de crecimiento
Paecilomyces variotii ATCC MYA3630
Control de calidad Candida krusei ATCC 6258
Este protocolo carece de puntos de corte clínicamente relevantes para los antifúngicos ensayados.
Nuevos puntos de corte especieespecíficos
Debido a que la mayoría de las especies del género Candida proporcionan suficiente crecimiento a las 24 horas de incubación, se han realizado
esfuerzos para estandarizar las CMI en ese periodo. Un tiempo de 24 horas de incubación en las pruebas in vitro de susceptibilidad antifúngica
es más útil en el laboratorio clínico, ya que proporciona información de una manera más rápida. Por tanto, se han publicado nuevos puntos de
corte especieespecíficos para fluconazol, voriconazol y equinocandinas.
En el caso particular del fluconazol, los aislamientos de C. albicans, C. tropicalis y C. parapsilosis con CMI ≤ 2 µg/ml se categorizan como
susceptibles y aquellos con CMI > 4 µg/ml deben categorizarse como resistentes. C. glabrata se considera susceptible dependiente de la dosis a
CMI ≤ 32 µg/ml y se categoriza como resistente a CMI > 32 µg/ml. Para el voriconazol los resultados de los estudios arrojan los siguientes
criterios: aislamientos de C. albicans, C. tropicalis y C. parapsilosis con CMI ≤ 0.125 µg/ml son clasificados como susceptibles; CMI de 0.25 a
0.5 µg/ml son considerados como intermedios y CMI ≥ 1 µg/ml son categorizados como resistentes.
Para las tres equinocandinas, es decir, caspofungina, anidulafungina y micafungina, los puntos de corte quedaron de la siguiente manera: para
aislamientos de C. albicans, C. tropicalis y C. krusei con CMI ≤ 0.25 µg/ml son clasificados como susceptibles y CMI > 0.5 µg/ml como
resistentes. Aislamientos de C. glabrata con CMI para anidulafungina y caspofungina ≤ 0.12 µg/ml se categorizan como susceptibles y CMI > 0.25
µg/ml como resistentes; para micafungina las CMI ≤ 0.03 µg/ml son consideradas como susceptibles y las CMI > 0.12 µg/ml como resistentes.
Los aislamientos de C. parapsilosis y C. guilliermondii con CMI ≤ 0.12 µg/ml son categorizadas como susceptibles para las tres equinocandinas
y CMI > 4 µg/ml son resistentes para las tres equinocandinas.
Para antifúngicos como anfotericina B y posaconazol no se han publicado nuevos puntos de corte tomando en cuenta la lectura de CMI a las 24
horas de incubación.
Conclusión
Las pruebas de susceptibilidad con antimicóticos han evolucionado rápidamente desde 1982. Con toda seguridad se puede afirmar que el
conocimiento actual de estas pruebas en levaduras y hongos filamentosos es comparable al de las realizadas con bacterias. Sin embargo, a
pesar de tal progreso permanece la duda acerca de su utilidad como un instrumento orientador en el momento de la toma de decisiones
terapéuticas. Deben continuar los esfuerzos encaminados hacia el establecimiento y validación de la interpretación de los puntos de corte de
Los aislamientos de C. parapsilosis y C. guilliermondii con CMI ≤ 0.12 µg/ml son categorizadas como susceptibles para las tres equinocandinas
y CMI > 4 µg/ml son resistentes para las tres equinocandinas. fundacion Universitaria Juan N. Corpas
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Para antifúngicos como anfotericina B y posaconazol no se han publicado nuevos puntos de corte tomando en cuenta la lectura de CMI a las 24
horas de incubación.
Conclusión
Las pruebas de susceptibilidad con antimicóticos han evolucionado rápidamente desde 1982. Con toda seguridad se puede afirmar que el
conocimiento actual de estas pruebas en levaduras y hongos filamentosos es comparable al de las realizadas con bacterias. Sin embargo, a
pesar de tal progreso permanece la duda acerca de su utilidad como un instrumento orientador en el momento de la toma de decisiones
terapéuticas. Deben continuar los esfuerzos encaminados hacia el establecimiento y validación de la interpretación de los puntos de corte de
nuevos medicamentos disponibles, y la optimización de los procedimientos actuales. Cada nuevo antimicótico imprimirá desafíos adicionales
para la metodología existente, la cual requerirá ajustes esenciales para que la actividad antifúngica in vitro sea un reflejo indudable de relevancia
clínica.
Lecturas recomendadas
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Approved guideline. National Committee for Clinical and Laboratory Standards, Wayne, PA, 2010.
Clinical and Laboratory Standards Institute. Method for antifungal disk diffusion susceptibility testing of yeasts. Approved guidelinesecond edition
M44A2. National Committee for Clinical and Laboratory Standards, Wayne, PA, 2009.
Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antifungal disk diffusion susceptibility testing of nondermatophyte
filamentous fungi. Informational Supplement M51S1 (Approved). National Committee for Clinical and Laboratory Standards, Wayne, PA, 2010.
Clinical and Laboratory Standards Institute. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility of yeasts. Approved standardthird edition
M27A3. National Committee for Clinical and Laboratory Standards, Wayne, PA, 2008.
Clinical and Laboratory Standards Institute. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of filamentous fungi. Approved
standardsecond edition M38A2. National Committee for Clinical and Laboratory Standards, Wayne, PA, 2008.
Clinical and Laboratory Standards Institute. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts. Third Informational
Supplement. National Committee for Clinical and Laboratory Standards, Wayne, PA, 2008.
Clinical and Laboratory Standards Institute. Zone diameter interpretative Standards, corresponding minimal inhibitory concentration (MIC)
interpretative breakpoints, and quality control limits for antifungal disk diffusion susceptibility testing of yeasts. Third Informational Supplement M44
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[Archives of Internal Medicine Full Text]

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