CLASE 12

TECNICA DE MICROCOLUMNA EN GEL

Docente: T.M. Luisa Torres

Inmunohematología y Hemoterapia
VII CICLO 2016
METODOS Y TECNICAS CONVENCIONA
Métodos y técnicas convencionales

•Grupos sanguíneos en Lámina

(Antisueros monoclonales).
•Grupos sanguíneos en tubo.

•Grupo sanguíneos en soporte de

microplaca.

•Grupo sanguíneos en microcolumna de

Gel.
 PRINCIPIO DEL MÉTODO

La prueba se basa en la exclusión en base al tamaño

de los elementos reactantes que tiene lugar en el
seno de una matriz inmunológicamente inerte.

La columna de gel contiene:

•Un anticuerpo específico
•NaCl
•Suero antiglobulina humana.

Método que emplea el gel como base para la

diferenciación y/o evidencia de una reacción
inmunohematológica, basada en el uso de los
hematíes como fuente de reacción, utilizando
de manera controlada la velocidad de
centrifugación e incubación según técnica
requerida.
 Los hematíes sensibilizados reaccionan con el
antisuero específico durante la centrifugación
dejando los líquidos reactantes (incluyendo
cualquier globulina no fijada) en la cámara de
reacción.

Los hematíes no sensibilizados, en la fase de

centrifugación de la prueba, forman un “punto” o
Solamente los hematíes “botón” en la base del microtubo en tanto que
ingresan en la matriz de gel. aquellos que hayan sido aglutinados se distribuirán a
lo largo de la columna de gel.
Según sea la intensidad de la
reacción, los hematíes podrán
ocupar la parte superior de la
columna de gel o dispersarse a lo
largo de la misma.
FORMA DE LOS MICROTUBOS

•Los microtubos están incorporados en una pieza integral de 70 milímetros de largo por
53 milímetros de alto, denominada “tarjeta” (ID-Card).

•La extremidad superior de los mismos es ancha (4 milímetros de diámetro) de manera

tal de permitir en él la incubación de los reactantes.

•Al extremo superior se lo conoce como “CÁMARA DE REACCION”.

•La parte intermedia o “COLUMNA”, es larga y estrecha, lo cual permite en la fase de

centrifugación un contacto prolongado de los hematíes con el gel.

•El fondo del microtubo tiene aspecto “CÓNICO”. Cuando los hematíes atraviesan la
columna de gel durante la fase de centrifugación forman un punto en el fondo del
mismo según sea el gradiente de aglutinación
Aspecto de la tarjeta
 Cámara de
Reacción

Tubo largo con

fondo cónico

Zona de Identificación
de contenido
Etiqueta Zona de Identificación
de Muestra
Zona de Asignación
de resultado
 Fecha de Vencimiento

Código de Barras

Id. Del Tipo de Tarjeta

Tº de Almacenamiento Número de Lote

 COMPOSICIÓN DEL GEL

El gel utilizado es el SEPADEX G ultra fino y

se presenta en tres modalidades básicas:
REACCIÓN 4+
Las células rojas aglutinadas forman una banda sólida en la parte superior del
gel.
REACCIÓN 3+
Las células rojas aglutinadas comienzan a dispersarse por la columna de gel y se
concentran en el tercio superior de la columna de gel.
REACCIÓN 2+
Las células rojas aglutinadas comienzan a dispersarse por la columna de gel y se
las observa ocupando toda su longitud.
REACCIÓN 1+
Las células rojas aglutinadas se dispersan por el gel y se concentran en el tercio
inferior del microtubo.
REACCIÓN NEGATIVA

Todas las células rojas atraviesan el gel y forman un botón celular bien
definido en la base del microtubo.

DOBLE POBLACIÓN

La reacción de doble población también conocida como campo mixto se

caracteriza por una banda de células rojas aglutinadas en la parte
superior de la columna de gel en tanto que las células no aglutinadas se
depositan en el fondo del microtubo.
Leer:
 CONSIDERACIONES en la lectura

•Coágulos, fibrina, detritus y otros artefactos pueden atrapar hematíes en la

parte superior del gel, induciendo a lecturas e interpretaciones erróneas.

•Por tal motivo se solicita que las muestras a analizar sean extraídas mediante una
correcta técnica (exenta de hemólisis) en tubos con EDTA (de preferencia).

•El EDTA es una solución de sales sódicas y potásicas que se comportan como
poderosos anticoagulantes ya que inhiben la participación del ión Ca++ en la
cascada de la coagulación de la sangre.

•Se desaconseja la congelación y descongelación de sueros, dado que durante esa

.
práctica, se destruyen proteínas e inmunoglobulinas.
 ¿PLASMA O SUERO?
IMPORTANCIA DEL COMPLEMENTO

Las instrucciones de trabajo impartidas en los insertos de las diferentes

“ID-Cards” dan por indistinto el uso de suero o plasma.

Pero el Complemento es necesario para la reacción de algunos anticuerpos

poco frecuentes.

El Complemento se conserva en cantidades suficientes cuando la muestra de suero es mantenida a

4°C durante dos semanas.

Por lo general se recomienda un tiempo que no exceda las 72 horas de extraída la muestra
(después de separar los hematíes del suero por centrifugación) y si el estudio se realizará más
allá de ese tiempo, la muestra de suero debe congelarse en alícuotas a -30°C durante un plazo no
superior a los tres meses.
Si hay lisis inmunológica de los hematíes es signo de la
presencia de aloanticuerpos.

Por lo tanto el suero a analizar ha de estar libre de

hemoglobina.

En caso de que la presencia de hemoglobina libre en el suero

en estudio sea inevitable, se debe comparar el color
sobrenadante de la prueba con el color presente en el suero
problema separado inicialmente de los hematíes.
DILUYENTES
 Solución de bromelina modificada, con actividad enzimática
estabilizada por un prolongado período. (D1)

•grupos sanguíneos en tarjetas de gel

•como aditivo para pruebas enzimáticas con hematíes no tratados para
detección de anticuerpos
•pruebas de compatibilidad.

Aumentan la reactividad de algunos sistemas

de grupo sanguíneo (en especial los del
sistema Rh)
Las enzimas proteolíticas
modifican los antígenos
eritrocitarios.
Suprimen otros como los antígenos de los
sistemas MNSs, Duffy y Xg.

La papaína suele emplearse para el

Las enzimas más utilizadas en la tratamiento enzimático de los hematíes antes
serología de grupos sanguíneos son de su uso,
la papaína y la bromelina. La bromelina se utiliza además como reactivo
aditivo.
 Liss modificada para suspensiones de hematíes (D2)

La solución de baja fuerza iónica (Liss) aumenta la tasa de asociación de

anticuerpos, con lo que potencia las reacciones antígeno – anticuerpo.

Solución modificada de baja fuerza iónica destinada a preparar:

• suspensiones de hematíes al 5% para determinación de grupos

sanguíneos en tarjetas de gel con reactivo de origen monoclonal.

•suspensiones de hematíes al 1% para pruebas de compatibilidad,

pruebas de la antiglobulina humana.
 VOLÚMENES A DISPENSAR

Son volúmenes de suspensiones de hematíes y

plasma (o suero) muy pequeños.

50 μl de suspensión de hematíes y 25 μl de
suero o plasma.

En las tradicionales pruebas en tubo, el

volumen de suero o plasma a utilizar es
de 2 gotas (lo que equivale a 100 μl), en
tanto que para esta microtécnica se
necesitan solamente 25 μl.
 Es importante la máxima precisión
en el pipeteo

Se respeta rigurosamente el orden para dispensar los

reactantes:

•en primer lugar sosteniendo la pipeta en un ángulo de 45° y

con el puntero apuntando a la pared lateral del microtubo, se
verterán 50μl de la suspensión de hematíes (previamente
preparada en el diluyente que corresponda)

•en segundo lugar, manteniendo la pipeta en posición vertical y

próximo a la boca del microtubo, se verterán 25 μl del suero o
plasma en estudio.
 ¿Qué se necesita para trabajar éste
método?

1. Tarjetas adecuadas para lo que se investiga.

2. Soluciones adecuadas para evidenciar las reacciones
esperadas.
3. Dispensadores apropiados.
4. Pipetas adecuadas y debidamente calibradas.
5. Equipo mínimo: Incubador y Centrífuga
6. Equipo adecuado: Equipo mínimo mas Lector de
tarjetas con Software Maestro.
 Preparar a suspensión de hemáties del paciente al 1% ó 5%

Suspensión de
Diluente Hematíes
Muestra del
Paciente

GR 5%: 500uL D2 + 50uL Sx ó

25uL Concentrado GR

GR 1%: 1mL D2 + 10uL

Concentrado GR
 Prueba de Coombs Poli específico en
Tarjeta Gel:
Tarjeta ID- Card LISS/Coombs

La detección e identificación de aloanticuerpos

Pruebas de compatibilidad
Prueba directa de antiglobulina.

La función mas importante de la AGH poli

especifica es detectar la presencia de IgG.
 Prueba Cruzada
Tarjeta: LISS/Coombs
Preparación:
Muestra: GR 1%: 1000uL D2 + 10uL Concentrado GR, agitar suavemente, puede usarse inmediatamente.

Diluente

Muestra del
Paciente
 Prueba Cruzada
Tarjeta: LISS/Coombs
Procedimiento:
Pipetear 50uL de la suspensión de los hematíes del donante en el microtubo correspondiente.
De requerir auto control depositar 50uL de la suspensión de hematíes del paciente
Agregar 25uL de Plasma o Suero del paciente a cada microtubo.

Muestra del
Paciente
 Determinación de Grupo sanguíneo en Tarjeta Gel
Preparación:
Muestra: GR 5%: 500uL D2 + 25uL concentrado GR, agitar suavemente, puede
usarse inmediatamente.

Diluente
Muestra del
Paciente
Procedimiento:
Identificar la tarjeta correctamente
Pipetear 10uL de la suspensión de GR a los 3 microtubo.

Muestra del
Paciente
Diluente
Muestra del
Paciente

Incubar a 37 ºC x 15 min. , Centrifugar

x 10 min. Leer y registrar resultados.
Procedimiento: centrifugar la tarjeta x 10 minutos
Leer y registrar

Diluente
Centrifugar e
Interpretar

Muestra del
Paciente
 Resultados Obtenidos
Una reacción Negativa indica COMPATIBILIDAD de la sangre del
Donante con el Receptor.

Una reacción Positiva indica INCOMPATIBILIDAD de la sangre del

Donante con el Receptor, debido a la presencia de anticuerpos dirigidos
contra los antígenos existentes en los eritrocitos del Donante, en este
caso deben hacerse estudios adicionales para identificar la
especificidad de los anticuerpos.
Limitaciones

•Se tiene conocimiento que algunos fármacos pueden producir

resultados positivos.

•La contaminación de los materiales empleados, bacteriana o

de otro tipo, pueden dar reacciones falsas positivas o
negativas.

• El empleo de soluciones distintas al ID-Diluent 2 pueden

provocar modificación en las reacciones.

• El uso de Reactivos celulares distintos al Diacell (células)

pueden modificar los patrones de reacción.
Ventajas de la micro técnica

Es una técnica estandarizada en sus

procedimientos lo cual conduce a reacciones e
interpretación de los resultados en forma
OBJETIVA.

La prueba de Coombs, sin necesidad de

realizar los lavados (que si requiere si se
hiciera en la clásica prueba en “tubo”)
disminuye las posibilidades de errores
técnicos y aumenta la sensibilidad de la
prueba.
¿Porqué no se necesita lavado ?

¿Por qué en la
técnica de gel no es
necesário realizar
lavados y tampoco
utilizar el control de
AGH?

¿Por qué no se lavan los

eritrocitos, previo a la fase de
Coombs?
 Para
hace la prueb
n a
ya q inneces de ant
u a ig
ante e la sus rios pro lobulina
s pe c
barr del pla nsión d edimient indirecta
e sm e o
neut ra sobre a/suero eritroc s de lav se
r , it a
del s alización la suspen con lo os se añ do,
uero de la si qu ade
. AGH ón de ge e crea
por l l un
as pr e impide a
oteín l
as Ig a
G
ID - LISS / Coombs ID - LISS / Coombs

AGH AGH
 Anticuerpos
anti-eritrocitários
 Ausencia de
Reacción Ag- Ac
Reacción Ag- Ac
Hematies sensibilizadas
capturadas por la AGH

COOMBS SIN LAVADOS!

Acs libres en la cámara de incubación
Micro columna en Gel
El catálogo ID-System de Bio-Rad reúne 65 variedades de
tarjetas de gel con una gama que abarca la determinación de
grupos sanguíneos ABO y Rh D para donantes, pacientes y
recién nacidos, prueba inversa, fenotipo Rh, Kell, antígenos
simples, test de coombs directo, investigación e identificación
de anticuerpos irregulares, pruebas de compatibilidad y
estudios en medio enzimático entre otras aplicaciones.
End…………………