REACCIÓN DE FENTON

FORMACION DE OXIDO NITRICO (NO)

ANTIOXIDANTES NATURALES (DIETARIOS)

Ascorbato (Vitamina C)
Tocoferoles (Vitamina E)
Carotenoides (identificados más de 600)
Ej.: Licopeno (tomate)
Flavonoides (más de 4.000)
antocianidina
catequinas
flavanonas
flavonas-isoflavonas
flavonoles
El estrés Oxidativo es la
oxidación no controlada,
de origen exógeno o endógeno
que se produce por
desbalance de los mecanismos
antioxidantes a nivel celular.
Mecanismo de acción de un antioxidante fenólico
Estructura del acido Ascorbico
OH

HO O
O

HO OH

(AscH2)
Sinergismo entre Vitamina E y Vitamina C
 vitC y vitE como Co-Antioxidantes
H2 O

OO OH
R R

R
O

Lipid Se representa una

capa lipídica de la
X H bicapa de una
membrana, Una vez
X que el oxígeno
reacciona con la
cadena lipídica, el
O2 OO cambio de los
momentos dipolares
determina que los
radicales peroxilos
puedan flotar hacia Vitamin E
a b la
c interface
 vitC and vitE como Co-Antioxidantes
H2 O - As c
As c H
Px FA-Co A
G
OOH O OH

Ph GPx
PLA 2
R R R R

R R
O O

Lípido

La vitamina E remueve
los radicales peroxilos;
el ascorbato puede Vitamina E
reciclar la vitE; luego, las
enzimas remueven los
ácidos grasos dañados y
insertan uno nuevo,
reparando los lípidos de
la membrana.

d e
 vitC y vitE : Co-antioxidantes
La ordenación termodinámica muestra que el radical tocoferol TO,
es más oxidante que Asc-
Se cree que el ascorbato ayuda a reciclar el TO, el que vuelve a TOH

TO + AscH-  TOH + Asc-

Este mecanismo protege las moléculas de la oxidación cuando no hay

enzimas que puedan reciclar al TO. Está en debate si este mecanismo es
importante en células o tejidos, aunque se piensa que protegería a las LDL
de las oxidaciones.
1 – Autoxidacion

Este es un proceso radicalario, en cadena

que se desarrolla en tres etapas:

1.1 Iniciación. Abstracción de un hidrógeno desde un

grupo metileno por ataque de un ROS a un lípido.
Formación de dienos conjugados para estabilizar
el radical.
1.2 Propagación. Los radicales peroxilos pueden
abstraer hidrógenos de otras moléculas.Origina
peróxidos lipídicos.
1.3 Terminación. Reacción entre radicales para
dar especies más estables no iniciadoras y no
propagadoras.Se liberan aldehídos, hidrocarburos
de cadena corta, etc.
Initiation

En condiciones aeróbicas, los dienos en presencia del O2 originan peroxilos (ROO·)

Propagación

Termination
 Eventos de
Peroxidación iniciación
de lípidos Iniciación
Radical libre
Centrado en
el carbono O2
R-OO-H R
Hidroperoxido Lipidico Reacción
en Propagación
cadena

R-H ROO
H H Radical
= Peroxilo

Grasa poliinsaturada
Diagrama que representa el balance entre las características antioxidantes
y pro-oxidantes de los flavonoides y otros fenólicos dietarios. Las formas
reducidas de los flavonoides actúan como antioxidantes, sin embargo, las
Formas oxidadas (radicales fenoxilos y intermediarios quinonas) pueden
tener actividades prooxidantes.
Acción antioxidante, como donadores de hidrógenos
Índices y métodos para evaluar el estrés oxidativo
Lipoperoxidación.
Productos de las vías y
Métodos para evaluar las
Concentraciones.
 Ensayo de TBARS para MDA: El Ensayo
más usado para medir Peroxidacion de lípidos.
• Popular
- Es muy simple de ejecutar

• Problemas
– El ensayo de los TBARS
no es específico para MDA
 OXIDACION DE LDL
DIENOS CONJUGADOS
 Antioxidantes en Plasma y LDL

Proteínas no-enzimas
Proteínas de unión para Cu y Fe
(albúmina, ceruloplasmina, transferrina)

Enzimas
Superóxido dismutasa extracelular,
glutatión peroxidasa
 Concentraciones
Pequeñas moleculas plasmáticas
antioxidantes típicas

  Solubles en agua µM

   Ácido Úrico 300

   Ácido Ascórbico (Vitamina C) 50

   Bilirrubina-Albúmina 15

   Glutatión (GSH) <2

 Lipido-solubles (asociada a lipoproteina) mol/mol LDL

     ,  -Tocoferol (Vitamina E) 25 10
   Ubiquinol-10 (coenzima
Q10) 1.0 0.4

   ß-Caroteno (Pro-Vitamina A) 0.5 0.2

   Licopeno 0.5 0.2

MEDICION DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE IN VITRO

• FRAP Ensayo de la actividad antioxidante para reducir al Fe3

(plasma u otros)

• TRAP Ensayo del Potencial Total Atrapador

de Radicales Peroxilos (Wilson, 2001)

• FOX Ensayo de Lipoperoxidación.

Medición Hidroperóxidos

• ORAC Oxygen radical absorbance capacity (Ou et al, 2001)

• TEAC (o TAS) Capacidad antioxidante equivalente al trolox.

Oxidación de ABTS a ABTS+ por ferrilmioglobina.

Estos ensayos se usan para evaluar la eficacia de un antioxidante, en

Soluciones.
Fig 1.
Medición de F2-Isoprostanes:
Como Índice de Estrés Oxidativo

Son Productos de Oxidación del Acido

Araquidónico
 F2-Isoprostanos
• Los PGF2 son producidos no-enzimáticamente por peroxidación
del ácido araquidonico (AA)
inducida por radicales libres

• Son producidos en abundancia in vivo, en cantidades que exceden

los PGs derivados
de la ciclooxigenasa

• Son capaces de ejercer potentes acciones biológicas

• Se forman 4 isómeros (series 5-, 8-, 12-, and 15-), cada una de
ellas comprende 8 diastereoisómeros racémicos
 Ventajas de Medir F2-IsoPs como
Biomarcadores de Peroxidación Lipídica

• Son Productos Específicos de peroxidacion de

lípidos.
• Son Estables.
• Son Detectables en todos los tejidos y fluídos
biológicos normales.
• Se puede definir un rango normal
Qué es la oxidación de una proteína.

Es la modificación covalente de una

proteína inducida por
intermediarios reactivos del oxígeno
o por productos intermediarios de
estres oxidativo.
 Grupos carbonilos proteicos
• Los grupos carbonilos son estables (ayuda a la
detección y se puede guardar)
• Están presente en bajos niveles en las preparaciones
preoteicas (~1 nmol/mg protein ~ 0.05 mol/mol ~ 1/3000
amino acids)
• Se observan elevaciones de 2- a 8- veces los
carbonilos de las proteínas en condiciones de estrés
oxidativo in vivo
• in vitro son inducibles por casi todos los tipos de
oxidantes.
• Se dispone de ensayos sensibles (≤ 1 pmol)
Agentes que producen la oxidación de una
proteína
 Reactivos Químicos
(H2O2, Fe2+, Cu1+, glutation, HOCl, HOBr,
1
O2, ONOO-)
 Fagocitos Activados (actividad oxidativa)
 -irradiación en la presencia de O2
 UV , ozono
 Peróxidos Lipidicos (HNE, MDA, acrolein)
 Mitocondria (transporte electronico)
 Enzimas Oxidoreductasas
(xantine oxidasa, mieloperoxidase, P-450
enzimas)
 Drugs y sus metabolitos
Amino acidos que forman carbonilos por
oxidación catalizada por metales

• Proline (-glutamylsemialdehyde)
• Arginine (-glutamylsemialdehyde)
• Lysine (amino-adipicsemialdehyde)
• Threonine (amino-ketobutyrate)
 Detección de carbonilos proteicos

• Medición de los niveles de carbonilos totales, por

reacción con DNPH*, seguido por espectroscopía
(A370), ELISA, o immunohistoquímica

• Medición de los niveles de carbonilos en

determinada proteína dentro de una mezcla de
proteínas (muetra de tejidos, extracto de células)
por reacción con DNPH seguido por
inmunoensayo Western blot

*DNPH, dinitrophenylhydrazine
 Measurement of total carbonyls
(Spectrophotometric DNPH assay)

O DNP

H2 O2 Fe DNPH Absorbance
protein oxidized DNP-
activated protein protein at 370 nm
neutrophil

e.g. arg ---> -glutamylsemialdehyde Dinitrophenylhydrazone-protein

 Componentes de
DNA y RNA
Pyr im id in es :
H O CH 2 OH
O NH 2 O O
NH 2
CH 3 CH 3
HN N HN
N H H
O N O N O N OH H
O N
H H H
H -D-2 -Deoxyr ib os e
t h ym in e cyt os in e 5 -m et h ylcyt os in e u r a cil
H O CH 2 OH
Pu r in es O
NH 2 O
H H
N N HN N
OH OH
H N N H H2 N N N H -D-Rib os e
H H
a d en in e gu a n in e
azúcares
bases
Puntos posibles para el ataque por Radicales
libres
O

6
N7 5 1 NH
O
- 8 9 4
3
2

O P O CH 2 N N NH 2
O
-O
O
4' 1'
3' CH 3
2'
H N3 4
5
O 2
1 6

O P O CH 2 O N
O O

4' 1'
3'OH
2'
 Oxidative Damage to the Bases
Ataque de HO• sobre pirimidinas
O
OH
HN 3 4 CH 3
5

O
2 1 6
N . H
reducing

O O

HN CH 3
. HN
. CH 3
+ HO oxidizing
O N H N H
H O OH
H

Thymine
O
.
CH 2
HN

O N H
H
 Daño Oxidativo a las Bases
Ataque del HO• sobre las purinas
O

HN1 6 5
. 7N
2 4
3 9 8
H2N N N H
HO H

O O
OH
HN N
. HN N

H2N N N H
+ HO
H2N N
.N H
H H

O
Guanine
HN N

H2N N
.N H
OH
H
Oxidación del DNA puede conducir a mutaciones

8 -h yd r oxygu a n in e

O O
Ba s ep a ir s
HN
N N HN
N N H
A T
H2N N N OH H2N N N O
H H G C
8 OH-Gu a (en ol) 8 oxo-Gu a (k et o) 8 OHd G A

N La lectura del 8-OHdG

H H
H
N O H N puede conducir a una
H2N NH
N
mutación (GCAT)
N N
H
N H Ad en in e
N
H
O
8 OH-Gu a
A. Cálculo del ensayo comet.
B. Jerarquización de los comets, desde 1 a