TINCIÓN DE GRAM

Esta tinción diferencial fue creada en el año 1884 por el histólogo Christian Gram,
discípulo de Robert Koch, como un método para la tinción de bacterias en tejidos.
Mediante esta técnica las bacterias se pueden clasificar en Gram positivas (Gram+) o
Gram negativas (Gram-). La reacción Gram+ es rara en Biología, aparece sólo entre
bacterias, levaduras y hongos filamentosos. Muy pocas estructuras biológicas son Gram+.

Se han propuesto diversas teorías para explicar el mecanismo de la reacción Gram,

la más aceptada propone una diferencia de permeabilidad entre las bacterias Gram+ o
Gram-. Todas las evidencias apoyan esta teoría, que está basada en la estructura y
composición de la pared celular bacteriana. Cuando la pared bacteriana se tiñe con el
complejo cristal violeta - yodo, éste queda atrapado dentro de los microorganismos
Gram+ y no puede ser retirado fácilmente por el solvente alcohólico, debido a la
naturaleza fisicoquímica de sus paredes celulares. Se sabe que las paredes celulares
Gram+ son menos permeables a las moléculas más pequeñas después del tratamiento
por grandes concentraciones de alcohol. Sin embargo, la diferente naturaleza de las
bacterias Gram- permite eliminar el complejo colorante-yodo por tratamiento con
alcohol; esta separación puede ser facilitada por el mayor contenido de lípidos de las
paredes celulares Gram.

La tinción de Gram es la más utilizada en Bacteriología.

Comparación de la estructura de envoltura de una bacteria gramnegativa y una

grampositiva.
PASOS PREVIOS A LA TINCIÓN DE GRAM

Preparación de un frotis bacteriano: Previo a la tinción es necesario preparar un frotis

en un portaobjetos. Para preparar un frotis se deben realizar tres etapas: extensión,
secado y fijación.

Frotis desde medio líquido

• Extensión: En un portaobjeto limpio y desengrasado se deposita en el centro una

gota del material a observar. Con la misma asa con la que se ha transportado el
material, se extiende en una capa delgada y uniforme, no mayor a un cm
cuadrado.

• Secado: Se deja secar al aire o suavemente a la llama.

Luego, se debe depositar una segunda gota y volver a secar y por último depositamos
sobre las gotas anteriores una tercera muestra y secamos.

• Fijación: Este procedimiento se realiza a fin de lograr que el material se adhiera

firmemente al portaobjeto, de manera que no se desprenda durante los lavados,
además, es necesario matar los gérmenes antes de la coloración, en forma
instantánea para mantener sus caracteres y estructuras. La muerte se debe a la
coagulación rápida de las proteínas de la célula bacteriana. Como fijadores se
utilizan el calor seco, éter, alcohol etílico, alcohol metílico, alcohol éter, etc.
Generalmente este paso con el anterior se lleva a cabo de manera simultánea.
Frotis desde medio sólido

Es muy similar al procedimiento explicado previamente, sin embargo, en la

extensión necesitamos un portaobjeto limpio y desengrasado donde se deposita en el
centro con el asa bacteriológica una gota de agua destilada o solución fisiológica, luego
se deposita una pequeña muestra proveniente de una colonia bacteriana aislada,
homogenizando la muestra. Con la misma asa con la que se ha transportado el material,
se extiende en una capa delgada y uniforme, de aproximadamente un centímetro
cuadrado.

Placa Petri con cultivo bacteriano

Técnica para la tinción de Gram

• Hacer un frotis
• Colorear con cristal violeta al 1% o violeta genciana durante 60 segundos,
cuidando que el colorante cubra toda la preparación.
• Eliminar el exceso de colorante y lavar rápidamente con un chorro de agua
suave, manteniendo el portaobjeto inclinado.
• Cubrir la preparación con la solución de lugol, dejándola actuar durante 60
segundos. Lavar nuevamente con agua.
• Decolorar la preparación con alcohol etílico al 95% durante 30 segundos, y
lavar con agua.
• Colorear con safranina (colorante de contraste) durante 10 segundos.
• Lavar con agua, secar y observar al microscopio utilizando el objetivo de
inmersión.
 Las bacterias que retienen el colorante (cristal violeta), se denominan Gram+, y se
observan de color azul.
Las bacterias que se decoloran con el alcohol y se tiñen con la safranina,se denominan
Gram-, y se observan de color rojo.
La fase de decoloración con el alcohol constituye la etapa másimportante de la tinción de
Gram y en ella reside su carácter diferencial.

Fundamento:

• La tinción primaria (violeta cristal) se une al peptidoglicano, coloreando las células de

color púrpura. Tanto las células Gram-positivas como las Gram-negativas poseen peptidoglicano
en sus paredes celulares, así que inicialmente todas las bacterias tiñen de violeta.

• El yodo de Gram (yodo y yoduro de potasio) se aplica como mordiente o fijador. Las
células grampositivas forman un complejo cristalino de yodo violeta.
El alcohol o la acetona se utilizan para decolorar las células. Las bacterias gramnegativas
tienen mucho menos peptidoglicano en sus paredes celulares, así que este paso esencialmente
las vuelve incoloras, mientras que sólo parte del color se elimina de las células grampositivas,
que tienen más peptidoglicano (60-90% de la pared celular). La pared celular gruesa de las
células grampositivas es deshidratada por el paso de decoloración, haciendo que se encojan y
atrapando el complejo yodo-mancha en su interior.

• Después del paso de decoloración, se aplica una tinción (generalmente safranina, pero a
veces fucsina) para colorear la bacteria de rosa. Tanto las bacterias grampositivas como las
gramnegativas captan la tinción rosada, pero no es visible sobre la púrpura más oscura de las
bacterias grampositivas. Si el procedimiento de tinción se realiza correctamente, las bacterias
grampositivas serán de color púrpura, mientras que las gramnegativas serán de color rosa.
 Limitaciones de la técnica

I. Algunas bacterias pueden ser Gram-variables o Gram-indeterminadas.

II. La técnica es adecuada para cultivos que tienen menos de 24 horas.
III. La principal limitación de la técnica esque produce resultados erróneos si se realiza
un procedimiento incorrecto, por ejemplo, alterar los tiempos de fijación de cada
colorante que participan en la tinción, por lo tanto, la práctica y la habilidad son
necesarias para producir un resultado fiable.
IV. Los patógenos eucariotas tiñen Gram-negativo, sin embargo, la mayoría de las
células eucariotas, excepto los hongos (incluyendo la levadura), no se adhieren al
portaobjetos durante el proceso.

Video Tinción de Gram

https://drive.google.com/file/d/11_4ZqydYN5RFAeLgHcZTadYiZIeYJrK-/view
Fotografía en microscopio con objetivo 100X y aceite de inmersión

Nomenclatura: Morfología - Afinidad tintorial- disposición

Ej:
Cocaceas Gram + en cadena/ racimo
Bacilos Gram - en cadena/ empalizada

Excepciones: Diplococos, diplobacilos, tétradas, sarcinas/

Gram positivo o negativo.

• Cocáceas Gram positivo en racimo (estafilococo)

• Cocácea Gram positivo en cadena (estreptococo)

• Diplococo Gram positivo

• Tétradas Gram positivo

• Sarcinas

• Bacilos aislados Gram negativo

• Diplobacilos Gram negativo

• Bacilos Gram positivo en cadena

• Bacilos Gram positivo en empalizada