REACTIVIDAD CRUZADA DE LAS PROTEÍNAS DE Mycobacterium smegmatis CON

SUEROS POSITIVOS A TUBERCULOSIS BOVINA

M.C. Quevedo Rocha Gilberto

Docente-Investigador del Centro de Bachillerato Tecnológico Agropecuario Núm. 261 de Villa Juárez, Navolato, Sinaloa

1
Noviembre del 2022

Mycobacterium tuberculosis
(Mehrotra et al., 2014; Álvarez et al., 2009; OMS, 2017)
INTRODUCCIÓN
GENERALIDADES
• Bacteria aerobia.
• Sobrevive en un ambiente hostil dentro de los
macrófagos.
• Se transmite por vía aérea.
• Basta inhalar una pequeña cantidad de bacilos
para contraer la infección.
• Fácil adaptación al medio intracelular de los
macrófagos.
• Pasa décadas en el hospedero, antes de
expresarse.
• Enfermedad aguda o reemergente.
• Es una de las principales causas de muerte 2
entre las enfermedades infecciosas.
 La tuberculosis es una enfermedades infecciosas
que causan grave daño a la salud pública.

 10 millones de personas enfermaron y 1.6 murieron

por esta causa. Además, un millón de niños
enfermaron de los cuales 230 000 murieron (OMS,
2019).

3
 Lista de 7 países con mayor mortalidad por M. tuberculosis

1 2 3 4 5

India Indonesia China Pakistán

Filipinas
6 7

Nigeria Sudáfrica
64 % de
mortalidad
(OMS, 2017).
Mycobacterium tuberculosis

80 - 90
muertos al año.

4
2600 - 2700 4

muertos por Tb.

(Viñuelas et al., 2017; OMS 2019) (OMS, 2015; CENAPRECE, 2015)
 Tuberculosis bovina: Enfermedad infectocontagiosa causada
por Mycobacterium bovis.  Es transmisible al hombre (enfermedad
zoonótica), a través del consumo de productos lácteos contaminados, no
pasteurizados o por el contacto con animales infectados (SENASICA,
2019).

Hay disminución en la producción tanto de leche como en producción de carne, de igual forma,
debido a la presencia de lesiones causadas por esta enfermedad, el decomiso de carne por pieza o
en canal (SENASICA, 2019).

5
 Manifestaciones Clínicas en Bovinos

 Principales síntomas.
 Debilidad progresiva.
 Pérdida de apetito.
Como se transmite?
 Pérdida de peso.
 La vía respiratoria.
 Fiebre fluctuante.
 Otra vía de infección es la vía digestiva.
 Tos seca intermitente y dolorosa.  Los animales ingieren saliva u otras
 Aceleración de la respiración secreciones del animal infectado
(taquipneas), dificultad de respirar (comederos o bebederos infectados) algo
(disnea). muy importante es que un solo animal
 Sonidos anormales en la auscultación y enfermo puede transmitir la enfermedad a
percusión. muchos otros antes de manifestar los
 Diarrea. primeros signos clínicos.

(SENASICA, 2019)
6

M. smegmatis:
 Saprófita excepcionalmente
causa daños en el cuerpo
humano.
 Comparte con Mt mas de
2000 genes homólogos mas
de un 90%.
 Proteína esat-6.
  3 a 5 µm de longitud   Ácido-alcohol resistentes
 Ácido-alcohol resistentes
 Forman colonias visibles en
un medio sólido a partir de
un inóculo diluido en un
período de 5-7 días.
 Crecimiento rápido.
 Tinción de Ziehl-Neelsen.
(Urribarren, 2016; Aznar, 2016; OMS, 2017)
Homología
M. tuberculosis:
 Patógena.
 2-3 um de longitud y
diámetro de .3 a .6 µm
 Lípido componen el 60% de
la pared celular.
 Crecimiento lento 2 a 6 sem.
 No fotocromógena.
 Resistentes a los ácidos,
álcalis y desinfectantes.
 Resisten la desecación y la
congelación.
 Luz ultravioleta y el calor
(>65º C durante 30 min) las
inactiva.
 Proteína ESAT 6.
 Tinción de Ziehl-Neelsen.
M. bovis:
 Tamaño promedio de 0,2-0,7
micras de ancho por 1-10 micras
de largo. 
 Sus células no presentan una
cápsula protectora ni producen
esporas.
 Más del 60% de la membrana
compuesta por lípidos.
 Genoma similar al de M.
tuberculosis.
 Comparte con Mt mas de 2000
genes homólogos mas de un 90%.
 Ácido-alcohol resistentes.
 Forman colonias visibles en medio
sólido a partir de un inóculo diluido
en un período de 5-7 días.
 Crecimiento rápido
 Tinción de Ziehl-Neelsen.
7
7
 Tb depende de ciertos minerales para crecer la Tb incrementa su patogenicidad,
los genes que codifican la proteína ESAT6, están presentes en el genoma de M.
tuberculosis, H37RV, M. bovis, M. leprae, M. avium y en la cepa avirulenta de M. smegmatis
y esta requiere de ciertas condiciones de cultivo durante su crecimiento (Pang et al., 2013).

Existen diferencias muy marcadas donde se han probado que los cambios conformacionales
dependientes del pH de MtbESAT-6 y MsESAT-6, en condiciones de pH ácido, MtbESAT-6
experimenta un cambio conformacional significativo, mientras que MsESAT-6 muestra poco cambio
conformacional en respuesta a la acidificación (De león et al., 2012).

8
 ANTECEDENTES DIRECTOS

Autor Mycobacteria Lugar Resultado

Reyrat y Kahn, 2001 M tuberculosis USA Actividad metabólica

y M smegmatis similar

Rifat et al., 2009 M smegmatis USA Secreción de

Proteínas patógenas

Ganguly et al., 2007 M tuberculosis Australia Expresión de

proteínas ESAT6,
CFP10
López et al., 2016 M smegmatis México, Expresa el mensajero
Sinaloa esat-6.

9
 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

La TBB enfermedad infecto contagiosa del ganado vacuno causada Mycobacterium bovis (M.
bovis), de categoría III y de notificación obligatoria por su alto contagio hacia los humanos (OIE, 2012). Afecta
los pulmones (TBC pulmonar), otras partes del cuerpo, por ejemplo, ganglios linfáticos, riñones, huesos,
articulaciones, etc. Además, puede afectar a personas de cualquier edad, de igual manera a los animales sin
embargo las de mayor riesgo son aquellas que están inmunosuprimidas.
A nivel mundial se encuentra dentro de las enfermedades bacterianas causantes del 90% de las defunciones
en el mundo según la Organización Mundial de la Salud. Los mecanismos de patogenicidad del complejo
Mycobacterium tuberculosis se relacionan con su capacidad de sobrevivir en un ambiente hostil dentro de los
macrófagos. Al estar atrapadas en el interior de las células del hospedero M. tuberculosis debe responder a las
condiciones de carencia de nutrientes.

 ¿Cuál es la reactividad cruzada de las proteínas de Mycobacterium smegmatis

bajo condiciones de limitación con fosforo en sueros de Tuberculosis10 Bovina?
10
80 y 90 de muertos al año
registrados por defunción de

JUSTIFICACIÓN
esta enfermedad (OMS, 2015)

40 millones de dólares por desechos, 17%

Producción de leche, 15% ganancia de peso y la
tasa de conversión alimenticia y fertilidad en un
6%, se afecta la movilización del ganado
causando efecto en la economía por alrededor de
los 450 millones de dólares anuales (SENASICA,
2019)
• 775 CASOS
BOVINOS Y 775
SACRIFICADO
(OIE, 2017)

 Enfermedad degenerativa silenciosa.

2600 - 2700  Afecta a animales enfermos y sanos.
muertos por Tb  Los signos aparecen hasta que el animal infectado presenta su estado terminal
con lesiones tuberculosas en pulmones, ganglios linfáticos y otras partes del
cuerpo de acuerdo a la vía de contagio.
 Afecta principalmente a los hatos ganaderos con explotación Intensiva.
 Puede ser confundida con otras enfermedades frecuentes causando cuantiosas
pérdidas económicas en producción de leche y carne.
(Pulgar, 2010). 11
 Situación actual de Tuberculosis Bovina

Al 17 de enero de 2019 se ha reconocido el 85.77% del territorio nacional

en fase de erradicación (Prevalencia menor al 0.5%).

12
SENASICA 2019
ACCIONES DEGOBIERNO

 Trazan ruta Agricultura, Gobierno y

ganaderos de Sinaloa para elevar
estatus sanitario

13
 HIPÓTESIS

La limitación de fósforo en el medio de cultivo genera cambios  en M.

smegmatis que provocan la expresión antigénica con los sueros de
bovinos positivos a tuberculosis.
 

14
 OBJETIVOS
Objetivo General
• Determinar los grupos de proteínas antigénicas de M. smegmatis que presentan
reactividad cruzada bajo condiciones de limitaciones con fósforo con sueros de
bovino positivos a tuberculosis.

Objetivos Específicos:

• Expresar proteínas de M. smegmatis bajo restricción de fósforo.

• Obtener proteínas de sobrenadante y totales de M. smegmatis restringidas en
fósforo.
• Detectar proteínas antigénicas de M. smegmatis con sueros de bovinos
positivos a tuberculosis.

15
 MATERIAL Y MÉTODOS
Tipo de estudio: observacional: descriptivo

• El presente trabajo se realiza en el Laboratorio de Parasitología de la Facultad de

Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Autónoma de Sinaloa. La cepa
de M. smegmatis que se utiliza es la mc2 155

MEDIOS DE CULTIVO

Tinción de Z Tinción de Ziehl-
iehl-Neelsen Neelsen
Tinción de Ziehl-
Neelsen

Cultivo de M. Cultivo de M.
HDB
smegmatis en 7h9 smegmatis en 7H9
CON P Y -P
Sólido Líquido

16
 OBTENCIÓN DE PROTEÍNAS SOBRENADANTE Y TOTALES

Las proteínas
totales
centrifugación
a 4000
rpm/10 min

Se precipitaron Posteriormente
en alcohol se centrifugó a
absoluto 1:1, por Sonicado se
20000 rpm 90 centrifugó a
24 h a -70°C. Proteínas
min a 4º C 12000 rpm
totales por
sonicación. por 30 min

17
 Cuantificación de proteína (calibración con BSA)

La absorbancia en un
espectrofotómetro, a
630 nm.

La concentración por método de Bradford (1976), y

curva de calibración con BSA.
18
CURVA PATRÓN

19
 INMUNODOT (dot-blot)

Goteo 1,2 Y 3 µg de Incubación por 2 h

muestra de proteínas con a peroxidasa
de sobrenadante y
Revelado con
precipitado de M. Bloqueo de
incubación por 24 h a diaminobencidina
smegmatis en membranas con leche
37°C con sueros de y sol. NICO
membranas de descremada
nitrocelulosa bovinos positivos a
incubación por 2 h a
tuberculosis
37°C

20
 (dot-blot)

Fig. 1.- 1µg Fig. 2.- 2µg Fig. 1.- 3µg

21
 Gel de Poliacrilamida al 12%

Para detectar las proteínas antigénicas se

realizó por inmunodetección por Western
Blots, las proteínas se separaron por
electroforesis en geles de SDS-PAGE al
12.%. Utilizando como marcador molecular
Precisión Plus Protein Dual Color
Stándards de BIO-RAD

22
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Las proteínas del sobrenadante de M. smegmatis expresadas en limitación de
fósforo que son reconocidas por sueros de bovinos positivos a tuberculosis es un
complejo que van de 6 a 45 kDa aproximadamente. Coincidiendo con Chan donde
encontró en filtrados de M. bovis el antígeno 38 kDa que es una proteína
antigénica y se encuentra en los filtrados de los cultivos de este estudio tanto en
proteínas totales como en sobrenadante de los cultivos de M. smegmatis (chan et
al., 1992) así mismo concordando con Peng encontramos la proteína esat6 que
es una proteína de 6 kDa secretada que juega varios papeles, modulando la
respuesta inmune del huésped a la infección, además de ser responsable del
escape bacteriano al citoplasma del huésped (Peng et al., 2016). Actúa como un
antígeno de células t y que también es encontrada en los sobrenadantes de los
cultivos de M. smegmatis. 
 

23
 CONCLUSIONES
Contamos con un complejo de proteínas en sobrenadante de los
cultivos de M. smegmatis que reaccionan antigénicamente, lo
cual es esencial para el diagnóstico de Tuberculosis bovina.

24
 P O R
A S ,
A CI L A
GR S O
N A D
U L U
S A Diciembre del 2019
25
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