1 1

1 Reactividad Cruzada de las Proteínas de Mycobacterium smegmatis con Sueros Positivos a

2 Tuberculosis bovina

4 Cross Reactivity of Mycobacterium smegmatis Proteins with Positive Serums for Bovine

5 Tuberculosis

10

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4

25 Resumen:

26 Con la finalidad de determinar los grupos de proteínas de M. smegmatis que presentan

27 reactividad cruzada bajo condiciones de limitaciones con fósforo con sueros de bovino

28 positivos a tuberculosis, se utilizó para el presente estudio la cepa de M. smegmatis mc2

29 155, esta se cultivó en medio sólido 7H9 (Difco BD®), para la expresión de las proteínas se

30 suplementó con 0.5% de glicerol y 0.05% de Tween 80 y con restricción de fósforo,

31 reducido 100 veces de tal manera que quede una concentración de fósforo total de 0.16

32 mM. Los cultivos se crecieron hasta la fase estacionaria. Después, se llevó a cabo los

33 experimentos para extraer las proteínas del sobrenadante, las proteínas se obtuvieron por

34 centrifugación a 4000 rpm/10 min, se precipitaron en alcohol absoluto 1:1, por 24 h a -70°

35 C. Después se centrifugó a 22000 rpm 1 h a 4° C, el concentrado de proteínas, para después

36 suspender en PBS y la concentración se estimó mediante el método de Bradford (1976).

37 Para detectar las proteínas antigénicas se realizó por inmunodetección por Western Blots,

38 las proteínas se separaron por electroforesis en geles de SDS-PAGE al 12.5%. El gel se

39 transfirió a membrana de nitrocelulosa, se incubó en leche descremada al 5% (Difco BD ®)

40 en 0.05% de PBS-Tween 20 (PBS-T), por 1 h a temperatura ambiente, se enjuagó con PBS-

41 T 3 veces x 10 min y se incubó con 30 sueros de bovinos positivos a tuberculosis durante la

42 noche a 4° C. Las membranas se lavaron 3 veces por 10 min en PBS-T. Posteriormente, las

43 membranas se incubaron con proteína A conjugada a la peroxidasa durante 2 h y se lavaron

44 3 veces, por 10 min, con PBS-T. La reacción antígeno-anticuerpo será reveló por la

45 reacción del peróxido de hidrógeno. Existen estudios donde M. smegmatis expresa la

46 proteína en medio Sauton en membrana pero en 7H9 no, sin embargo en condiciones de
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6

47 limitación de nutrientes específicamente el fosforo si expresa el gen esat-6 (López et al.,

48 2016).

49

50 Palabras clave:

51 BCG, M. tuberculosis, M. smegmatis, M. bovis, Reactividad Cruzada

52 Abstract:

53 Key Word:

54 Introducción

55 La tuberculosis es una enfermedad zoonótica, un grave problema mundial de salud humana,

56 con 10,4 millones de nuevos casos de enfermedad activa y alrededor de 1,8 millones de

57 muertes (roperto 2017), la Organización Mundial de la Salud (OMS) estima que dos mil millones

58 de humanos están infectados con tuberculosis latente, con una probabilidad del 5% al 10%

59 de desarrollar TB activa (Wanzala 2019)

de GIL PORQUÉ PONES LAS CITAS ASI??
lo NO ENTIENDO

60 PORQUÉ SE ESCRIBE ASÍ , COMO UN RESULTADO DE LA INFECCIÓN EN

61 HUMANOS PARA EL EFECTO EN LA GANADERÍA?? cual resulta en considerables

62 dificultades económicas para la industria ganadera por sus impacto en la salud animal,

63 reducción en la productividad, restricciones de movilización, detección sacrifico de

64 animales afectados y restricciones comerciales (Mohamed 2020) )

la tuberculosis bovina es el

65 resultado de la infección por Mycobacterium bovis principalmente y forma parte del

66 complejo Mycobacterium tuberculosis Waters 2015-melo 2014) una amenaza para la salud pública en

67 el mundo, (McGill 2014)

una situación crítica en la prevención y el control de la tuberculosis

68 bovina (bTB) es el diagnóstico de infecciones subclínicas, los métodos dependen de

69 respuesta inmune por exposición previa a los patógenos sospechosos y a la reactividad

7 4
8

70 cruzada con microbios y enfermedades similares, (Lamont 2014)

para su control requiere

71 identificación y eliminación de animales infectados del rebaño (flores 2012)

se estiman unos 50

72 millones de bovinos infectados a nivel mundial y para el control de la de la enfermedad se

73 invierte alrededor de 3 mil millones de dólares anuales. (Palmer 2019)

su patogenecidad se

74 relaciona por su capacidad de sobrevivir dentro del macrófago y a su respuesta de

75 supervivencia al agotamiento de nutrientes , la apoptosis beneficia a la Micobacteria al

76 eliminar las células de defensa del huésped, permitiendo la penetración de las barreras

77 epiteliales y favoreciendo la propagación de la infección por eferocitosis .(rivera 2019 y Siegele 1992).

78 Mientras que las micobacterias avirulentas de crecimiento rápido(Lü 2014) como M. smegmatis,

79 en un esfuerzo por sobrevivir a las condiciones hostiles, pueden sacar una respuesta similar

80 a M. tuberculosis en los hospederos es una herramienta segura y conveniente para estudiar

81 la respuesta de las bacterias patógenas a los medicamentos (Julistiono 2018)

la herramienta más

82 empleada para el diagnóstico de tuberculosis es la tuberculina esta es una prueba cutánea y

83 el ensayo de liberación de interferón gamma detecta a varios antígenos de Mycobacterium

84 bovis, M.bovis incluye una proteína de 6kDa (ESAT-6) y una de 10 kDa (CFP10), cuyos

85 genes se encuentran dentro de la región de diferencia 1 (RD1,) estas proteínas son

86 esenciales para la virulencia en M. tuberculosis(Scherrer 2019) y se encuentran presentes en la

87 M. smegmatis, (Falcone 1997)

se han detectado proteínas en el rango de 25 a 67 kDa, en

88 sobrenadante de M. smegmatis, las cuales presentan reacción cruzada con M. tuberculosis

89 (rodriguez y col 2011), por otro lado la proteína 27 es un antígeno secretado de

90 glicoproteina expresado en superficie en M. bovis y se conserva en varias especies del

91 género Mycobacterium incluyendo M. smegmatis(Vázquez 2017)

donde existen diferencias

92 conformacionales dependientes del pH de MtbESAT-6 y MsESAT-6 , sin

(De Leon 2012)

93 embargo en condiciones de limitación de nutrientes con fósforo expresa el gen esat-6 (lopez
 9 5
10

94 . El objetivo de este trabajo fue determinar los grupos de proteínas de M. smegmatis que
2016)

95 presentan reactividad cruzada con sueros de bovino positivos a tuberculosis.

96

97

98

99 MATERIALES Y MÉTODOS.

100 Notas: poner coordenadas geográficas,

101 Área de estudio

102 El presente trabajo se realizó en el Laboratorio de Parasitología de la Facultad de Medicina

103 Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Autónoma de Sinaloa.

104 Expresión de proteínas

105 Preparación de los medios de cultivo, la cepa de M. smegmatis que se utilizó es la mc2 155,

106 Cultivo de M. smegmatis:

107 La cepa de M. smegmatis que se utilizó es la mc 2155 tipo campo, se cultivó en un medio

108 sólido 7H9 Middlebrook Broth (Difco TM), y Agar Bacto complementado con Tween 80 al

109 0.05% (v/v) y 0.2% de glicerol. Las placas se incubaron a una temperatura de 37º C por 3

110 días.

111 Preparación de los medios de cultivo para el crecimiento de las micobacterias fue en medio

112 líquido Middlebrook Broth (Difco TM)

113 A partir de este medio se inoculó una sola colonia a un medio de cultivo líquido 7H9

114 Middlebrook Broth (Difco TM), al cual se le agregó 0.05% (v/v) de Tween 80, 0.2% (v/v)

115 de glicerol, por 30 hrs a 37º C con un agitador orbital a (250 rpm) en frascos de 225 ml el

116 cual contenía 150 ml en medio de cultivo líquido por triplicado. El crecimiento se llevó a
 11 6
12

117 media fase logarítmica, con una densidad óptica de 0.6-0.8 (OD 600). (densitómetro Fisher

118 Scientific).

119 De este medio de cultivo se tomó una alícuota de 100 µl la cual las bacterias se transfirió a

120 150 ml de medio de cultivo Hartman’s de Bont (HdeB) con y sin fósforo; se creció y se

121 incubo a 37º C en agitación a 250 rpm en un agitador orbital por un periodo de por 96 hrs.

122 Preparación de los medios de cultivo HdB

123 La preparación de medio de cultivo Hartman’s de Bont (HdeB) se realizó a una

124 concentración mínima de glicerol de 27.4mM (0.2%, vol/vol) 0.05% de tween 80,

125 (Smeulders et al., 1999) para el experimento limitado 100X menor en Pi (HDB<Pi) se

126 adicionó K2HPO4 a una concentración final de 8.90 mM (15.5mg L -1 ) y NaH2PO4 a una

127 concentración de 7.08 mM (85 mg L-1.) para reemplazar la pérdida de capacidad

128 amortiguadora se agregó ácido propanolsulfonico 3-(N-morfolino) (MOPS) 50 mM

129 (Smeulders et al., 1999). Finalmente se agregó 0.05% Tween 80 vol/vol y 10 ml de una

130 fuente de elementos traza que se diluyó previamente por separado y se aforó en un litro de

131 agua destilada. Para la preparación de los elementos traza, las sales se agregaron en el

132 siguiente orden: diluir en 965 mL de H2O destilada: (EDTA [0.01 g], MgCl2•6H2O [0.1

133 g], CaCl2•2H2O [1 mg], NaMoO4•2H2O [0.2 mg], CoCl2•6H2O [0.4 mg], MnCl2•2H2O

134 [1 mg], ZnSO4•7H2O [2 mg], FeSO4•7H2O [5 mg], CuSO4•5H2O [0.2 mg]). El pH del

135 medio de cultivo debe quedar a 7.0. (Smeulders et al 1999).

136 La preparación de medio de cultivo Hartman’s de Bont (HdeB) se hizo a una concentración

137 mínima donde se adiciono 2.0 g de (NH 4)2SO4, por Litro-1 (la concentración final de 15

138 mM); glicerol 27.4 mM (0.2%, vol/vol); K2HPO4 a 8.9 mM (1.55 g por Litro-1) y
 13 7
14

139 NaH2PO47.08 mM (0.85 g Litro-1). Finalmente se agregó 0.05% Tween 80 vol/vol y 10 ml

140 de una fuente de elementos traza se diluyo previamente por separado para posteriormente

141 aforarse en un litro de agua destilada. Para la preparación de los elementos traza, las sales

142 se agregaron en el siguiente orden: diluir en 965 mL de H 2O destilada: (EDTA [0.01 g],

143 MgCl2•6H2O [0.1 g], CaCl2•2H2O [1 mg], NaMoO4•2H2O [0.2 mg], CoCl2•6H2O [0.4 mg],

144 MnCl2•2H2O [1 mg], ZnSO4•7H2O [2 mg], FeSO4•7H2O [5 mg], CuSO4•5H2O [0.2 mg]). El

145 pH 7.0 (Smeulders, et al., 1999).

146 Después se obtuvo el paquete celular por centrifugación a 4000 rpm/10 min, y el

147 sobrenadante se precipito en alcohol absoluto 1:1, por 24 h a -70° C. Después se

148 centrifugaron a 20000 rpm 90 min a 4° C para extraer las proteínas del sobrenadante. El

149 concentrado de proteínas, se suspendió en solución amortiguadora de fosfatos (PBS) a la

150 cual se le agrego EDTA como inhibidor de proteasas. La concentración de proteínas se

151 estimó mediante el método de Bradford (1976).

152

153 Detección de proteínas de reacción cruzada (molecular cloning)

154 Para detectar las proteínas antigénicas se realizó por inmunodetección por Western Blot,

155 las proteínas se separaron por electroforesis en geles de SDS-PAGE al 12.5%. El gel se

156 transfirió a membrana de nitrocelulosa, se incubó en leche descremada al 5% (Difco BD ®)

157 en 0.05% de PBS-Tween 20 (PBS-T), por 1 h a temperatura ambiente, se enjuagaron con

158 PBS-T 3 veces por 10 min y se incubaron con 30 sueros de bovinos positivos a tuberculosis

159 durante la noche a 4° C. Las membranas se lavaron 3 veces por 10 min en PBS-T.

160 Posteriormente, las membranas se incubaron con proteína A conjugada con peroxidasa
 15 8
16

161 durante 2 h y se lavaron 3 veces, por 10 min, con PBS-T. La reacción antígeno-anticuerpo

162 fue revelada por la reacción del peróxido de hidrógeno.

163 PORQUÉ SE DESCRIBEN TAN PORMENORIZADAMENTE LOS

164 PROCEDIMIENTOS??

165

166 Análisis estadístico

167

168

169

170 Resultados

171 Para la detección de las proteínas de reacción cruzada se cuantifico los extractos obtenidos

172 de proteínas de sobrenadantes y proteínas totales, estas se llevaron a una concentración de

173 70 microgramos como se observa en el gel

174

175

176 Estos al ser transferidas y reconocidas por sueros de animales enfermos donde se

177 observan 6 proteínas con tales pesos

178 PRESENTARLOS DE OTRA MANERA

 17 9
18

179 Discusión

180

181 Conclusiones e implicaciones

182

183

184

185

186 LITERATURA CITADA.

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