Universidad Nacional Experimental Politécnica

“Antonio José de Sucre”

Vicerrectorado Barquisimeto
Departamento de Ingeniería Química

ESPECTROFOTOMETRÍA DE ABSORCIÓN
ULTRAVIOLETA VISIBLE UV-VIS
 ESPECTROFOTOMETRÍA DE
ABSORCIÓN UV-VISIBLE
Es una espectroscopia de emisión de fotones . Utiliza
radiación electromagnética de las regiones visibles ,
ultravioleta cercanas e inflarroja cercanas Del espectro
electromagnético es decir una longitud de onda entre
190 nm y 780 nm , la radiación absorbida por las
moléculas provoca transiciones electrónica que pueden
ser cuantificadas.
USO DE LA
ESPECTROFOTOMETRÍA
 Es usada para identificar algunos grupos funcionales de moléculas , y además , para determinar el
contenido y fuerza de una sustancia.
componentes de soluciones de iones de metales de transición y
 En la determinación cuantitativa de los
compuestos orgánicos altamente conjugados.
 También Tiene uso en laboratorios de química y bioquímica para determinar pequeñas cantidades de
sustancias.
PRINCIPIO DE LA
ESPECTROFOTOMETRÍA

 Involucra la absorción de la radiación ultravioleta visible por una molécula , causando la promoción de un
electrón de un estado basal a un exitado liberando el exceso de energía en forma de calor . La longitud de
onda comprende entre 190nm y 800nm
 Cuando un haz de radiación UV-VIS atraviesa una disolución conteniendo un analito absorbente , la intensidad
es atenuada . Esta fracción de radiación que ha logrado traspasar la muestra es denominada transmitancia
 Fórmula : T= I/ I Sub 0

 Por aspectos prácticos se usa la absorbancia (A)

 Fórmula : A= -Log T
  Una expresión para la ecuación de Beber –

LEY DE
Lambert es la siguiente
 ( I subt / I Sub0 ) = e^ -KLC ; Donde :

BEBER –  I sub t : rango de luz captado por el tubo de

fotocolorimetria

LAMBERT  I sub 0 : rango de luz que sale del tubo de

fotocolorimetria
 K : capa idas de captación del haz del campo
electromagnético
 L : longitud del tubo de fotocolorimetria
 C : concentración de la muestra

 La ley de Beer-Lambert Permite cuantificar la concentración de una muestra por UV , también puede
ser expresada como :
 A=€CL ; Donde
 A : absorbancia
 € : coeficiente de extensión ( característico de cada sustancia )
 L : longitud del Paso de la cuba (cm)
 C : Concentración ( M )
CARACTERÍSTICAS DEL
SISTEMA
 Las muestras se colocan en una pequeña celda de silicio

 Se usan 2 lámparas , una de H para la UV y una de W halógeno para la visible

 Se usa una celda de referencia que contiene solo solvente

 La luz pasa simultáneamente por la celda de la muestra y la celda de referencia

 El espectrómetro compara la luz que pasa por la muestra y por la de referencia

 La radiación transmitida es detectada y el espectrómetro obtiene el espectro de absorción al barrer la longitud de

onda de la luz
 ESPECTRO DE ABSORCIÓN UV-VIS

 Es una representación gráfica que indica cantidad de luz Absorbida a diferentes valores de
longitud de onda
 A partir de una solución diluida de un compuesto , cuya absorbancia máxima entra dentro del
rango de medida del espectrofotómetro , se verá el valor de absorbancia a diferentes
longitudes de una onda frente a un blanco que contenga el disolvente de la solución de la
muestra a caracterizar . A partir del espectro de absorción se obtendrá el valor de longitud de
onda al que el compuesto presenta mayor absorbancia . Dicha longitud de onda se utilizará a
la hora de hacer determinaciones cualitativas y cuantitativas
 El espectro de absorción de un cromóforo depende , fundamentalmente de la estructura
química de la molécula
 Hay una gran cantidad de factores que originan variaciones en los valores de la absorbancia
máxima , entre ellos el pH
NIVELES DE ENERGÍA EN UNA
MOLÉCULA
Las moléculas, al igual que los átomos, tienen niveles de energía
electrónica cuantizados. Además, las moléculas tienen niveles de
energía asociados con los movimientos relativos de los átomos, unos
en relación con otros. Estos modos de movimiento relativo o interno
generalmente pueden ser divididos en dos grupos: movimientos
vibracionales asociados con el estiramiento y con la flexión de los
enlaces (niveles de energía cuantizados asociados a enlaces
intramoleculares) y movimientos rotacionales en los que la molécula da
giros en el espacio.

Como una buena aproximación inicial, la energía total de una molécula (a parte de su energía
traslacional) se puede escribir como:

E = Eelectrónica + Evibracional + Erotacional. 

 Traslacional Vibracional

energía cinética y potencial

energía cinética debido a su movimiento de un debido al movimiento vibracional.
lugar a otro.

La energía de un átomo o molécula esta descrita por

su energía traslacional, rotacional, vibracional y
electrónica.

Rotacional
Electrónica

Energía cinética debido a la Resultado de la interacción electrónica y otros

rotación en torno al eje. electrones
TRANSICIONES
ELECTRÓNICAS EN EL UV-VIS
En la configuración electrónica del estado fundamental de una molécula, todos los electrones se
encuentran en orbitales moleculares de energía mínima. Cuando una molécula absorbe luz con la energía
necesaria para promover a un electrón a un orbital molecular de mayor energía, esto es, cuando sufre una
transición electrónica, la molécula queda en un estado excitado. La energía relativa de los orbitales
moleculares de enlace, de no enlace y de antienlace.

Por otra parte las transiciones electrónicas que

involucran a los electrones de las capas
internas son muy energéticas y se presentan en
la región de los rayos X del espectro
electromagnético. Nuestro análisis se reducirá
a las transiciones electrónicas en la capa de
valencia. A estos efectos resulta conveniente
recordar la clasificación convencional de los
orbitales moleculares en la capa de valencia
TRANSICIONES ELECTRÓNICAS
EN EL UV-VIS
Transiciones θθ*. Se presentan en todos los compuestos orgánicos. Son en
general de gran energía (UV de vacío) e intensidad.

Transiciones θπ y πθ. Son posibles solo en compuestos insaturados. Son

transiciones de baja intensidad (regiones de definición de los orbitales
involucrados diferentes) en el UV lejano. Carecen de interés práctico.

Transiciones nθ*. Se presentan en compuestos con heteroátomos (O, N, S, Hal),

generalmente en la región cercana a los 200 nm. La intensidad es variable
dependiendo de la naturaleza del orbital n.

Transiciones ππ* . Presentes solo en compuestos insaturados. En ausencia de

conjugación estas transiciones se presentan en UV de vacío. Dan lugar a bandas
intensas que pueden aparecer en UV cercano si está presente insaturación
conjugada.

Transiciones nπ*. Presentes en compuestos insaturados con heteroátomos

(grupos carbonilo, nitro, azo, tiocarbonilo). Dan lugar a bandas débiles
usualmente en la región UV cercana (baja energía de transición).
 CROMÓFOR
OS
Harris, C. (2016). Análisis químico cuantitativo.

Es la parte de una molécula responsable de la

absorción de la luz. E

Toda sustancia que absorbe luz visible aparece

coloreada cuando transmite o refleja la luz.
E los colores del espectro
(La luz blanca contiene todos
visible) . de
El azul
bromofenol tiene
un
La sustancia absorbe ciertas longitudes de onda de la luz blanca, y de
E de onda que no se absorben. máximo
nuestros ojos detectan las longitudes
absorción a 591
nm y aparece de
color azul.
 AUXOCROMO

Skoog, D. (2008). Principios de análisis

instrumental

Es un grupo funcional que no absorbe por sí No

mismo en la región ultravioleta, pero que produce
el efecto de desplazar los picos de los cromóforos
absorbe
hacia longitudes de onda más largas, así como de
incrementar sus intensidades.

Este desplazamiento hacia

longitudes de onda más
largas se llama
desplazamiento
batocrómico o hacia el rojo.
 EL ESPECTROFOTÓMETRO DE
ABSORCIÓN MOLECULAR EN EL UV-
VIS
Es un instrumento con el que se apoya la
espectrometría para medir la cantidad de intensidad de
luz absorbida después de pasar a través de una
solución problema.

Es usado en los análisis químicos para medir en

función de la longitud de onda, la relación entre los
valores de una misma magnitud fotométrica relativos a
dos haces de radiaciones y la concentración o
reacciones químicas que se miden en una muestra.
 Partes de un
Espectrofotómetro

Espectrómetro Fotómetro

Es un dispositivo que Se usan filtros para

produce, dispersa y mide aislar la longitud de
la luz, es decir, produce onda
el rango deseado de Posee un detector
longitud de onda de luz. fotoeléctrico que mide la
Usa monocromador intensidad de la luz.
 COMPONENTES DE UN ESPECTROFOTÓMETRO

 Fuente de radiación: Es una fuente de luz que

ilumina la muestra y debe cumplir con condiciones
de estabilidad, direccionalidad, distribución de
energía espectral y larga vida. Por ejemplo las
lámparas de wolframio, de arco de xenón, de
deuterio o LED.
 Detectores: Es el encargado de captar la radiación,
y dependiendo del tipo de detector producen una
señal eléctrica. Existen dos tipos:
- Los que responden a fotones.
- Los que responden al calor.
 Monocromator
 Compartimiento de muestra
 Fotodetectores
 celdas
 APLICACIONES DE LAS MEDIDAS DE ABSORCIÓN
Análisis Cualitativo y Cuantitativo

Análisis Cualitativo
Puesto que grandes partes hasta de las moléculas orgánicas más complejas son
transparentes a la radiación por arriba de 180 nm, la aparición de uno o más picos en la
región de 200 a 400 nm es un indicio claro de la presencia de grupos insaturados o de
átomos como el azufre o los halógenos

Por consiguiente, los datos cualitativos ultravioleta

se tienen que complementar con otra evidencia
• Solventes
física o química, como los espectros infrarrojos, de
resonancia magnética nuclear y de masas, así • Efecto de la anchura de la rendija
como información sobre las temperaturas de
solubilidad y los puntos de fusión y de ebullición • Detección de grupos funcionales
 Los espectros en la región ultravioleta para el análisis cualitativo se miden usando
• Solventes casi siempre soluciones de un analito diluido. En el caso de compuestos volátiles, los
espectros de fase gaseosa son más útiles a menudo que los espectros de fase
líquida o de soluciones.

Al elegir un solvente no sólo se tiene que tener en cuenta su transparencia,

sino también sus posibles efectos sobre el sistema absorbente

Entre los solventes habituales se incluyen agua, etanol de 95%,

ciclohexano y 1,4-dioxano, cualquier solvente incoloro es útil

• Efecto de la anchura Para resolver espectros complejos se requieren

de la rendija anchuras de rendija angostas

En general, es aconsejable no estrechar la rendija más de lo

que sería necesario para la resolución del espectro
 En las alturas de los picos y la
separación están distorsionadas en
anchos de banda más amplios. Por esta
razón, los espectros para aplicaciones
cualitativas se deben medir con
anchuras de rendija mínimas.

Aunque esta técnica no puede proporcionar la identificación

• Detección de inequívoca de un compuesto orgánico, el espectro de absorción en
grupos funcionales las regiones ultravioleta y visible es útil para detectar la presencia
de ciertos grupos funcionales que actúan como cromóforos.
 Análisis Cuantitativo
La espectroscopía de absorción basada en la radiación ultravioleta y
visible es una de las herramientas más útiles con las que cuenta el
científico para el análisis cuantitativo

Características Importantes
• Gran aplicabilidad tanto para sistemas orgánicos como inorgánicos
• Límites de detección de 10 -4 a 10 -5 M
• Selectividad de moderada a alta
• Buena exactitud (por lo regular, se encuentran incertidumbres relativas de 1 a 3%,
aunque con precauciones especiales los errores se pueden reducir a algunas
décimas de porcentaje)
• Adquisición de datos fácil y adecuada.
 Campo de Aplicación
Las aplicaciones de los métodos cuantitativos de absorción ultravioleta-visible no
sólo son numerosas, sino que abarcan todos los campos en los que se requiere
información química cuantitativa.

Por ejemplo, el lector puede hacerse una idea del campo de aplicación de la
espectrofotometría consultando la serie de artículos publicados periódicamente en
Analytical Chemistry así como las monografías que tratan este tema.

Detalles del procedimiento

El primer paso de cualquier análisis fotométrico o espectrofotométrico es el establecimiento

de condiciones de trabajo que originen una relación reproducible, de preferencia lineal, entre
la absorbancia y la concentración del analito.
 Pequeñas incertidumbres que surgen por no reproducir
• Selección de la longitud con precisión los parámetros de longitud de onda del
de onda instrumento tienen menos influencia a una absorción
máxima.

Entre las variables comunes que influyen en el espectro

• Variables que influyen de absorción de una sustancia, están la naturaleza del
en la absorbancia solvente, el pH de la solución, la temperatura, las altas
concentraciones de electrolito y la presencia de
sustancias que interfieren.

• Limpieza y manipulación Para que el análisis sea exacto es necesario el uso de

de las celdas cubetas ajustadas de buena calidad. Es igualmente
importante usar técnicas apropiadas de limpieza y
secado de las celdas.
 • Determinación de la Después de decidir las condiciones para el análisis, se
relación entre absorbancia prepara la curva de calibración a partir de una serie de
y concentración soluciones patrón que abarquen el intervalo de
concentración esperado en las muestras.

Los resultados de un análisis nunca

se deben basar en los valores de
absortividad molar encontrados en
las publicaciones especializadas.
• Método de adición La que se selecciona con mayor frecuencia para los análisis
estándar fotométricos y espectrofotométricos, y que se trata con detalle

Si se quiere ahorrar tiempo o muestra, es posible efectuar

un análisis de adición estándar

Este procedimiento se basa en la ecuación

 Aplicación de la Espectrometría de
Absorción Molecular en El UV-VIS
Análisis de ADN y ARN
La verificación rápida de la pureza y concentración de
ARN y ADN es una aplicación particularmente
extendida. En la Tabla 1 se ofrece un resumen de las
longitudes de onda utilizadas en su análisis y lo que
indican. Al preparar muestras de ADN o ARN, por
ejemplo, para aplicaciones posteriores como
secuenciación, a menudo es importante verificar que no
haya contaminación de uno con el otro, o con proteínas
o sustancias químicas arrastradas desde el proceso de
aislamiento.
 ANÁLISIS FARMACÉUTICO

Uno de los usos más comunes de la espectroscopia UV-

Vis es en la industria farmacéutica. En particular, el
procesamiento de espectros UV-Vis utilizando derivados
matemáticos permite que los picos de absorbancia
superpuestos en los espectros originales se resuelvan
para identificar compuestos farmacéuticos individuales

Por ejemplo, benzocaína, un anestésico local, y clortetraciclina, un antibiótico

Cultivo Bacteriano
La espectroscopia UV-Vis se usa a menudo en cultivo bacteriano .
Las mediciones de DO se toman de forma rápida y rutinaria
utilizando una longitud de onda de 600 nm para estimar la
concentración celular y realizar un seguimiento del crecimiento
 ANÁLISIS DE BEBIDAS

La identificación de compuestos particulares en bebidas es otra

aplicación común de la espectroscopia UV Vis. El contenido de cafeína
debe estar dentro de ciertos límites legales, para los cuales la luz
ultravioleta puede facilitar la cuantificación. Ciertas clases de
sustancias coloreadas, como la antocianina que se encuentra en los
arándanos, frambuesas, moras y cerezas, se identifican fácilmente al
hacer coincidir sus longitudes de onda de absorbancia máxima
conocidas en el vino para el control de calidad utilizando la
absorbancia UV Vis.

OTRAS APLICACIONES

 La medición de la absorbancia de la  En el tratamiento de aguas residuales, la espectroscopia UV-

hemoglobina para determinar las Vis se puede utilizar en estudios cinéticos y de seguimiento
concentraciones de hemoglobina en la para garantizar que ciertos tintes o subproductos de tintes se
puede usarse en la investigación del hayan eliminado correctamente mediante la comparación de
cáncer sus espectros a lo largo del tiempo