ANTICUERPOS MONOCLONALES

La tcnica est basada en el hecho que un LB produce un Ac. con una nica especificidad. Dado que los LB no pueden crecer indefinidamente, es necesario inmortalizar la clula B que produce un Ac dado.

Ello se logra fusionando la clula productora de anticuerpos con una clula que posea ilimitada capacidad de divisin lograndose as la obtencin de una fuente inmortal de inmunoglobulinas quimicamente homogneas.
La clula inmortalizada luego de la fusin se denomina HIBRIDOMA y los Ac producido son MONOCLONALES

ANTICUERPOS MONOCLONALES

Premio Nobel en Fisiologa y de 1984 por el desarrollo de la tcnica de hibridoma para la produccin de anticuerpos monoclonales
Nature, Vol. 256 August 7 1975

POLICLONALES VS. MONOCLONALES

Policlonales: Monoclonales: Todas las molculas producidas son idnticas, poseen la misma clase y alotipo de Ig, la misma regin variable, estructura, idiotipo, afinidad y especificidad para un epitope dado. Provee un nico material estndar para todos los laboratorios. Tienen aplicacin no solo en el diagnostico sino tambin teraputico.

Un antisuero es una mezcla heterognea de Ac capaces de reaccionar con uno a ms Ags. Las diferentes recombinaciones, aun en animales genticamente idnticos hace que un antisuero sea irreproducible. En un buen antisuero ms del 90% de las Igs poseen poca o ninguna afinidad para el Ag, y los Ac especficos representan un amplio espectro de molculas con diferente grado de afinidad.

Tcnica para la produccin de Anticuerpos Monoclonales de especies animales

OBTENCIN DEL HIBRIDOMA SELECCIN- AISLAMIENTO MANTENIMIENTO DEL HIBRIDOMA PURIFICACION DE LOS ANTICUERPOS MONOCLONALES

OBTENCION DEL HIBRIDOMA

1. INMUNIZACION 2. SELECCIN DE CELULAS DE MIELOMA

No crecen indefinidamente y mueren al poco tiempo

Capaces de proliferar in vitro No secretoras de Ac. Deficientes en HGPRT (HipoxantilGuanil-Fosforibosil- Transferasa

Que problema tiene la utilizacion de que Que caractersticas seria deseable presenten las esplenocitos??clulas del mieloma??

3. FUSION

SELECCIN- AISLAMIENTO
1. Seleccin: en medio HAT VIA DE NOVO
FOSFORIBOSIL PIROFOSFATO + URIDALATO TIMIDINA Timidin cinasa TK

VIA DE RESCATE
HIPOXANTINA

HGPRT

Aminopterina

Enzimas ausentes en las lineas de mieloma mutantes utilizadas para las fusiones

NUCLETIDOS

2. Aislamiento
Por dilucin se aislan los diferentes hibridomas, obtenindose los clones adecuados, los cuales se cultivan, para producir el Ac. Monoclonal ms adecuado.

Cultivo de clulas individuales en pequeo volumen

Produccin de Ac

+
-

Crecimiento continuo

+ +

MANTENIMIENTO DEL HIBRIDOMA

Cultivo in vitro:
- Cultivo estacionario: baja escala. - Cultivo Bioreactores automatizados: mediana-gran escala.

Tumor en animales. Criopreservacin en N2 lquido.

PURIFICACIN
Depende:
1.- Caractersticas del Ac. 2.- Uso que se le va a dar: Purificacin Ag - S. Diagnstico in vitro: 50- 75% Preparacin conjugados- usos in vivo ( terapia, diagnstico e inmunizacin pasiva): 95-99%

Tcnicas:
Exclusin molecular CROMATOGRFICAS Afinidad Intercambio inico

UTILIDAD
Aplicaciones analticas y diagnsticas
Reconocimiento especfico de molculas como protenas, H de C., lpidos, drogas y hormonas.

Purificacin de sustancias a partir de mezclas complejas, por medio de columnas de afinidad.

Tcnicas de interaccin primaria como inmunofluorescencia, citometra de flujo y ELISA.

Aplicaciones teraputicas
Rechazo de transplantes y Enfermedades autoinmunes: AcMo especficos para el receptor T, para MHC II, CD4 y CD8, y molculas coestimulatorias.

Al ser de origen murino generan una potente Rta. Inmune y son depurados rpidamente.
Actaulmente se producen anticuerpos quimericos mediante tcnicas de ingeniera gentica.

TCNICAS DE INTERACCIN PRIMARIA

EnzimoInmunoEnsayos (EnzimeImmuneAssays, EIAs)

INTERACCIN PRIMARIA
Es la interaccin entre un epitope y un paratope.
Fuerzas que participan: interacciones electrostticas, puentes de hidrgeno, fuerzas de Van der Waals, fuerzas de London, interacciones hidrofbicas, etc. Constante de Afinidad:
Ac + Hp [AcHp] [Ac] + [Hp] El valor de K cuando el 50% de los sitios de unin del anticuerpo se hallan ocupados se define como Ko o Ka y es la Constante de Afinidad
k1
k-1

AcHp

= k1/k-1 = K

INTERACCIN PRIMARIA
Fenmenos biolgicos explotados por las Tcnicas de Interaccin Primaria: 1) Elevada especificidad de los anticuerpos (Ac)

2) Alta sensibilidad de deteccin de la marca del conjugado

Enzima

producto sustrato

Enzimoinmunoensayos (EIEs y/o EIAs)

Tcnicas de interaccin primaria

Radioligando

Inmunoanlisis Radiomtricos (IRs)

Fluorocromo

Inmunoanlisis Fluoromtricos (IFs)

INTERACCIN PRIMARIA

Rango de detectabilidad Interaccin secundaria: mg/ml a g/ml (10-3 a 10-6 g/ml) Interaccin primaria: ng/ml a pg/ml (10-9 a 10-12 g/ml)

Ej: IgE total o especficas (250 ng/ml), hormonas (GCh, T4, hGH), drogas (barbitricos, etc.), Ac especficos (HBS-Ac, marcadores de enfermedades autoimunes, etc.), Ag virales (HIV, HBV)

ENZIMOINMUNOENSAYOS (EIES)

EIE
Homogneos
Competitivos

Heterogneos

No competitivos Competitivos

No competitivo

ENZIMOINMUNOENSAYOS (EIES)
EIE

Homogneos Comp. No comp.

Heterogneos Comp. No comp.

ENZIMOINMUNOENSAYOS (EIES)
EIE
Homogneos Comp. Heterogneos No comp. enzima antgeno suero del paciente
DO

Homogneos no competitivos:

No comp. Comp.

La unin del Ac al Ag conjugado modifica la actividad enzimtica.

antgeno a analizar enzima

ttulo

anticuerpo

DO

La unin del Ag al Ac conjugado modifica la actividad enzimtica.

[Ag]

ENZIMOINMUNOENSAYOS (EIES)
EIE
Homogneos Comp. No comp. Heterogneos Comp. No comp.

Homogneos no competitivos

Homogneos competitivos:
antgeno a analizar suero enzima antgeno
DO

[Ag]

La unin del Ag al Ac conjugado modifica la actividad enzimtica. Ej: cuantificacin de T4, drogas, etc. (HAPTEN

ENZIMOINMUNOENSAYOS (EIES)
EIE
Homogneos Comp. No comp.

Homogneos no competitivos
Heterogneos

Homogneos competitivos
Heterogneos no competitivos:

Comp.

No comp.

Ac conjugado
suero a titular

Ac conjugado

Ag a analizar Ac de captura

Ag sensibilizante

ENZIMOINMUNOENSAYOS (EIES)
EIE
Homogneos

Homogneos no competitivos
Heterogneos

Homogneos competitivos
Heterogneos no competitivos

Comp.

No comp.

Comp.

No comp.

Heterogneos competitivos:

Ag conjugado
Ac conjugado suero a titular

Ag a analizar

Ag sensibilizante

Ac de captur

ETAPAS BSICAS
1) Inmovilizacin del inmunoreactante (Ag o Ac) a la FASE SLIDA 2) Bloqueo

3) Incubacin con la muestra (reacciona con el inmunoreactante inmovilizado)

4) Revelado por la utilizacin de un conjugado enzimtico.

EnzimoInmunoEnsayos (EIEs)
1) SENSIBILIZACIN Inmovilizacin del inmunoreactante (Ag o Ac) a la fase slida

FASE SLIDA

Placas de 96 pocillos

Poliestireno
Cloruro de polivinilo (PVC) Caractersticas: Alta capacidad de unin Mnima desorcin

Desnaturalizacin desprecia

EnzimoInmunoEnsayos (EIEs) Qu sucede si sensibilizamos con un exceso de Ag?

Y con un defecto de Ag?

EnzimoInmunoEnsayos (EIEs) Titulacin del sensibilizante

Cc Sensibilizante (Ag o Ac) H2O2 + OPD Peroxidasa Pocillo
%DO

Monocapa de sensibilizante (mnima intensidad de color)

Cc sensibilizante ptima

EnzimoInmunoEnsayos (EIEs)

*LAVADOS*
Se eliminan componentes libres o unidos de manera no especfica al inmunoreactante unido en la placa

Se utilizan soluciones salinas isotnicas (PBS) suplementadas con detergentes (Tween 20)

EnzimoInmunoEnsayos (EIEs)
2) BLOQUEO
Se realiza para tapar los sitios de unin al plstico libres que persisten luego de la etapa de sensibilizacin.

Se utilizan protenas ajenas al sistema diluidas en solucin salina (PBS).

Leche descremada 3% Suero de animales BSA

Qu sucede si no bloqueamos?

EnzimoInmunoEnsayos (EIEs) 3) Incubar con la muestra problema

Se diluyen las muestras en la solucin de bloqueo.

EnzimoInmunoEnsayos (EIEs)
4) REVELADO a. Incubacin con el conjugado enzimtico
Enzimas usadas

Peroxidasa

Fosfatasa alcalina Ureasa Caractersticas de una enzima a ser empleada como sistema de deteccin: Estable durante el almacenamiento Alta actividad enzimtica Actividad enzimtica fcilmente detectable Fcilmente conjugable

EnzimoInmunoEnsayos (EIEs) Titulacin del conjugado

Ag constante Ac constante Dil. conjugado
%DO 100

50

Dil. ptima

Dilucin del conjugado

EnzimoInmunoEnsayos (EIEs)
b. Incubacin con el sustrato de la enzima
Ej. Para peroxidasa se usa H2O2 como sustrato de la enzima y ortofenilendiamina (OPD) como cromgeno H2O2 + 2OPD

Peroxidasa
pH 5

OPDox + 2H2O

c. Frenar la reaccin
La reaccin se frena por el agregado de H2SO4

d. Leer la DO (densidad ptica)

EnzimoInmunoEnsayos (EIEs)

Pocillo 1 Pocillo 2 Pocillo 3 Pocillo 4

Ag(sensib) Bloqueo Muestra PBS Control -

Control +
Conjugado Desarrollo de color

+ + + + ?

+ + + + -

+ + + + -

+ + + + +

EnzimoInmunoEnsayos (EIEs)

PROBLEMAS
Diseo de un elisa para: deteccin de Ac anti toxoide tetnico IgM-anti rubeola IL-2 en suero de animales IgG2a anti-lumacina de Brucella

ENZIMOINMUNOENSAYOS (EIES)
Aplicaciones: Cuantitativas: Cuantificar un Ag determinado

Semicuantitativas:
Titular Acs especficos en un suero/plasma Cualitativas:

Determinar la presencia de Ags en una muestra

Determinar la presencia de Acs especficos en suero/plasma

ENZIMOINMUNOENSAYOS (EIES)
Cuantificacin de antgenos:
Curva de calibracin

DO

Muestra

log [Ag]

ENZIMOINMUNOENSAYOS (EIES)
Titulacin de Ac:
Titulacin a punto final:
DO

1/2DO max.

Log dil.

Titulacin a Dilucin Simple:

Se toma como titulo la abs del suero a una dil. Elegida previamente

ENZIMOINMUNOENSAYOS (EIES)
Anlisis cualitativo de anticuerpos en suero:
Suero positivo: DO suero (dilucin nica) > cut off

Cut off : X (sueros normales) + 2 o 3 DS

N de muestras

2DS 3DS

DO

Especificidad = Negativos / (FP + Negativos) Sensibilidad = Positivos / (FN + Positivos)

ENZIMOINMUNOENSAYOS (EIES)
Variantes:
Antgenos pequeos que pierden epitopes al adherirse al pocillo: Biotinilacin del Ag y pegado de avidina a la placa Uso de Ac de captura Anticuerpos en baja concentracin, se desea que queden todos los paratopes orientados hacia arriba: Uso de protena A o protena G

Ag-biotina

Avidina

Ac sens.

Avidina-HRP

Amplificacin de la seal: Uso de un segundo Ac unido a biotina, y como conjugado avidina-HRP

Ac-biotina

suero a titular

ENZIMOINMUNOENSAYOS (EIES)