Técnicas de F e r n a n do Y

af e
Castillo Ne rth
g re t e

microscopía

de luz.
Contenidos

1 Preparación de muestras.

2 Técnicas de microscopía.
 Preparación de
muestras.
Problemas a la hora de usar tejidos y
células.

• Células incoloras y traslucidas. • Las secciones se pueden teñir con

• Tejidos muy gruesos, suaves y frágiles tintes órganicos e inorgánicos que
• Las muestras gruesas porvocan que cueste tienen afinidad con componentes
enfocar las partes que queremos ver y que se celulares.
vea borroso. • Usando marcadores.
 Estudio en
fresco
• No se necesita de tinción o fijado.
• Contraste de fase e interferencial.
• No se matan las células (debido a
la fijación o inclusión).
• Requiere de máxima limpieza.
 Microscopía de
contraste fase
Fuera de fase. Cuando las ondas
son contrarias entre sí.

En fase. Si las ondas van en

misma oscilación.
Campo oscuro y campo claro
 Obtención de
muestra

• Se tiene que fijar la muestra, Para la tinción:

sumergiendo en formaldehído (por
descomposición).
• Sacar.
• Se pone en ceras, resinas liquidas o
congelamiento.
• Dejar secar en caso de ceras y resinas.
• Utilizar maquinas para seccionar
(microstato, mocrótomo,
ultramicrótomo).
Las tinciones son en soluciones acuosas y la
muestra es inmiscible en agua, así que se
tiene que hidratar haciendo el paso
contrario al de la deshidratación.
• Para quitar la cera se utiliza el xilol
(orgánico) que es un diluyente de ceras.
• Colocar cubreobjetos.
 Deshidratar (ceras inmiscibles en el agua).
Sumergir en soluciones progresivas de etanol hasta que sea 100% (es gradual
por que si no se así, el agua que quitamos también puede modificar a la
muestra)
 Métodos de
Congelación rápida (físico)
fijación
Los fijadores químicos pueden alterar la estructura del
tejido y las características físicas.
Fijación rápida.
Entre más rápido mejor (crea cristales).
Piezas menores a 2mm.
• Muestra en isopentano, enfriado con nitrógeno líquido
• Muestra de metal sumergido en nitrógeno líquido
parcialmente.
Embeber en crioprotectores (dimetilsulfóxido, glicerol,
sacarosa, etc.)
Se va a descongelar después de seccionarse y se derretirá,
así que debe fijarse.
 La criodesecación: posteriormente a la
congelación, se le sublima el hielo. Al eliminar el
agua se impide que se den reacciones químicas, por
lo que, además de la fijación, este método preserva
el tejido en el tiempo.

Criosustitución: se produce una sustitución lenta del

hielo por una solución fijadora. Con ello se posibilita
una fijación química sobre un material que no ha
sufrido deterioro puesto que está congelado.

Fijación por
calor
Inmersión (químico).

Precauciones
Se sumergen en la
solución fijadora.
• Las piezas de tejido no deberían superar los 0.5
cm debido a la velocidad de penetración.
• Tipo de tejido.
• Volumen.
• pH .
• Velocidad de difusión y velocidad de fijación.
 TEM

Fijación química de muestras (cacodilato, tetróxido

de osmio, etc) y inclusión en resinas.
Capacidad
 Estereoscopico
• Permite hacer estudios de objetos pequeños, pero
demasiado grandes para el microscopio compuesto.
• Magnificación entre los 5x a 60x.
• Utiliza la luz reflejada sobre sobre la superficie del objeto
bajo estudio.
• También se le conoce como microscopio de disección.
• Se utiliza para vizualizar muestras enteras, no piezas.
• Por lo general se utiliza en la paleontología, entomología,
investigación biológica, botánic, etc.
 Microscipía confocal.

• Permite ver los procesos de la

célula viva.
• No nos dice mucho acerca de
sus moléculas.
• Permite ver muestras en 3d.
Con imagenes sacadas de la miscroscopía
se pueden hacer imagens 3d en
programas.
 Microscopía de fluorescencia

• Permite ver los compuestos químicos

de la muestra.
• Depende de un marcador o tinte
puesto en la célula.
• Se pueden utilizar anticuepos para
detectar moléculas específicas.
• Utilizan tintes tanto órganicos como
inorganicos (quantum dots).
 STORM(stochastic optical reconstruction microscopy) y
PALM (photoactivated localization microscopy)

• Se pueden activar moléculas en específico con moléculas

etiquetadas. Se utiliza luz ultravioleta cercana que modifica
un pequeño subconjunto de moléculas para que emitan
fluorescia cuando se expone a un haz de exitación.
• Se toman imagénes antes de que el blanquemaineto apague
su fluorescencia y se active un nuevo subconjunto
AFM (atomic force
microscopy)
• Manipulación de moléculas.
• Es un dispositivo pequeño de punta
afilada (hecho de silicona)
• Puede encontrar información de fuerzas
electrostáticas, van der waals y
mecánicas que se sienten en la punta
cuando se acerca o toca la superficie.
• Pueden agarrar y mover moléculas que
pueden absorber fuertemente la punta.
• Hecho para medir características a
escala molecular en una superficie.
[1]A.J.L.M.R.R.W. (2014). Molecular Biology of The Cell (Sixth edition). Garland Science.

[2]Megías, M. P. M. (2022). Técnicas Hitológicas. 2. Métodos de fijación. Atlas de

Histología Vegetal y Animal. Atlas de histología vegetal y animal.
https://mmegias.webs.uvigo.es/6-tecnicas/2-metodos-fijacion.php

[3]MICROSCOPIA Y PREPARACIÓN DE MUESTRAS DE MICROBIOLOGÍA PARA

MICROSCOPIA. (2017).
http://www.fcn.unp.edu.ar/sitio/microgeneral/wp-content/uploads/2017/02/02-
MICROSCOPIA.pdf