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Histología
Tejido Estudio

Microscopia y Técnicas Histológicas

TP1
● Histología: Es el estudio de los tejidos y órganos a nivel → Microscopio Óptico Monocular:
microscópico
● Microscopio: Instrumento utilizado por la histología para analizar
las estructuras menores al límite de resolución del ojo humano.
Hay dos tipos de microscopio el compuesto y el simple
▪Simple: Solo una lente (ej: Lupa)
▪Compuesto: Hay 2 tipos :

 Fotónicos :
→ Microscopio Óptico
→ Microscopio Óptico Binonocular:
Utiliza de fotones → Microscopio de campo oscuro
de luz solar o
artificial(luz visible) → Microscopio de Fluorenscencia
como fuente de
energía. Para la → Microscopio de polarización
formación de → Microscopio de contraste de fase
imagen
→ Microscopio de interferencia
→ Microscópio de luz ultravioleta

 Microscópio Eletrónico (M.E):

Utiliza bombeo de
M.E de Trasmisión
eléctrones para M.E de Barrido
formar imagenes

Conceptos de microscopía:
▪ Abertura Numérica (A.N): Es la cantidad de rayos
lumínicos que emergen de un preparado y son captados
N= índice de refracción:
por el objetivo para formar el imagen. Aire = 1
Vidrio = 1,52
A.N= n.senα H2O = 1,33
Aceite = 1,51
▪ Limite de Resolución (L.R): Es la mínima distancia que hay
que tener entre dos puntos para que se pueda distiguirlos entre ▪ Características de la imagen (M.O): Mayor, virtual y invertida
si L.R= λ.0,61/A.N ▪ Características de la imagen (M.E): Mayor, Real, derecha o invertida

▪ Poder de Resolución (P.R): Es la capacidad del objeto de El L.R. se puede disminuir:

dar mayor detalle y claresa sobre el objecto de estudio.
P.R= A.N/λ
Aumento no implica en el Poder Resolutivo
▪Disminuyendo : Utilizando luz ultravioleta.
▪Aumentando la A.N: Cambiando el medio interpuesto entre la lente
L.R < P.R frontal del objetivo y el preparado. Por ejemplo, transformando el
objetivo seco en objetivo de inmersión, colocando una gota de aceite de
cedro

Técnicas Histológicas:
▪ Métodos de examen: Es el conjunto de procedimientos
especiales a los que se somete el material en estudio para
posibilitar la visualización microscópica.
Métodos Inmediatos: Métodos Mediatos (Técnica de Rutina):
Transcurre poco tiempo 1) Obtención de la muestra
2) Fijación 5) Montaje Preliminar
entre la obtención y la 3) Inclusión 6) Coloración
visualización. 4) Corte 7) Montaje final
▪ Sin coloración: Basado en los distintos índices de refracción del
espécimen (m. de campo oscuro, m. de luz polarizada, m. de
contraste de fase). Los Lípidos y Hidratos de Carbono no se tiñen
▪ Con coloración: Utiliza colorantes vitales que no poseen efecto
mortal sobre las células vivas. Por ejemplo: Verde Jano (mitocondrias)
- Azul de metileno - Rojo neutro (macrófagos) - Tinta china
(macrófagos)
→Supravital: Se aplica el colorante sobre un cultivo de células.
IN VITRO .
→Intravital: Se introduce el colorante al organismo por via
nasogástrica o por sangre, el cual es fagocitado por
células (Macrófagos). IN VIVO (Ej: Tinta china)
1) Obtención de la Muestra: La pieza puede obtenerse por
medio de distintos instrumentos como el bisturí. Si se obtiene
de un organismo vivo se denomina BIÓPSIA y si se
obtiene de uno muerto NECRÓPSIA.
Autópsia: Una muestra del cuerpo utilizada para saber la
causa de la muerte
2) Fijación: El objetivo es producir la muerte celular
conservando su morfología. Para evitar la autolisis debe ser
inmediata. Un buen fijador debe:
→ Actuar rápidamente.
→ Conservar la morfología que presentaba in vivo.
→ Evitar aparición de estructuras no deseadas
→ Tener alto poder de penetración.
→ Facilitar la coloración.
→ Ser económico.
Física:  Calor: Se da al pasar repetidas veces el
machero sobre el portaobjetos (ej: frotis de sangre)
Frio: Se mantienen la muestra a bajas
temperaturas para evitar que se reanude los procesos de
autolisis (ej : carne en la heladera)
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Congelación: Se utiliza nitrógeno líquido o por medio de
mezclas refrigerantes con hielo seco y acetona. La
congelación no desnaturaliza las proteínas y muchas de sus
propiedades reaparecen al hidratarse el tejido (temperatura
de -50°) (ej: tejido adiposo)
Desecación
Química:
● Simples :
- Formol al 4% P/V (1 parte de formol y 9 partes
de agua). Es la técnica de rutina. Conserva grasas
e hidrátos de carbono (macro moléculas) (alto
PM).
- Tetróxido de osmio (además de fijador, tiñe
grasa, fibras y mielina).
- Alcohol metílico (gelifica proteínas).
- Bicromato de potasio (tejido nervioso).
● Compuestos : (mezcla de fijadores)
- Líquido de Zenker (utilidado para núcleos)
- Líquido de Bouin (utilizado para proteínas)
- Líquido de Helly (formol + Zenker)
- Carnoy.
3) Inclusión: Es la penetración del material por agentes inclusores
que le confieren firmeza y elasticidad para su corte. El agente
inclusor más importante es la parafina.
1. Deshidratación: para extraer completamente el agua, se pasa el
tejido por cantidades crecientes de alcohol (50%, 70%, 80%,
95% y 100%) para evitar la retracción del tejido.
2. Aclaración: se reemplaza el alcohol un solvente orgánico: xilol
o toluol (solubles en alcohol y en parafina). Durante este proceso
el tejido se vuelve translúcido.
3. Penetración: se coloca la pieza en un recipiente con parafina
derretida a 56º C.
4. Inclusión definitiva: Tiene como objetivo endurecer la muestra
para permitir su corte posterior en el M.O se usa la parafina y en
M.E se utiliza resinas de epoxi. Formación del taco
4) Corte: Con micrótomo: se obtienen cortes delgados
(5 µm aproximadamente) que pueden ser atravesados
por la luz.
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→Tipos de micrótomo: cargas +) uniéndose por diferencia de cargas a

▪ Rotatorio: cuchilla fija y platina móvil.
▪ Deslizamiento: pieza fija y cuchilla móvil.
▪ Congelación (criostato): permite cortar piezas
sin fijación, ni inclusión previa. La cuchilla es móvil.
Posee aparato incorporado a la platina que libera
un gas refrigerante que congela la pieza en
forma rápida. Es utilizado en anatomo-patología,
en intervenciones quirúrgicas (biopsia por
congelación).
5) Montaje Preliminar: los cortes quedan flotando
en agua. Se los pesca con aguja de disección y
se los pone en portaobjetos.
6) Coloración: Se utilizan colorantes hidrosolubles.
▪ Colorante: Son sustancias capaces de dar
color a otras. Posee:
colorantes ácidos (carga -) y por lo tanto se
verá acidófila.
 Los ácidos nucleicos presentan un P.I muy
bajo, por lo que el PH del medio a pesar de ser
ácido será alcalino para ellos. Se comportarán
como ácido y se unirán a colorantes básicos.
● Proceso de coloración:
Directa: se sumerge el tejido directamente en el
colorante.
Indirecta: se utilizan sustancias denominadas
mordientes(sustancia que fija el colorante al
tejido acelerando el proceso de coloración,
ejemplo: alumbre de potasio). Laca: mezcla de
colorante + mordiente.

 Grupo cromóforo: es el que da color.

 Grupo auxócrono: se combina con el tejido

transmitiendo el color.
→ Los colorantes se clasifican de acuerdo al PH
en el que actúan en:

 Básicos: actúan a alto PH, son colorantes

catiónicos (carga +). Colorean núcleos, REG,
ribosomas. Ejemplos: “hematoxilina”, azul de
metileno, alcian blue, crecyl violeta.

 Ácidos: actúan a bajo PH, son colorantes

aniónicos (carga -). Colorean citoplasma y proteínas.
Ejemplos: Eosina, fucsina ácida, naranja G.
→ Coloraciones:

 Simples: un solo colorante.

 Combinadas: H&E o tricrómicos (Masson,

Mallory, Van Gieson).
Las proteínas pueden comportarse como
ácidas o básicas dependiendo del punto
isoeléctrico (P.I = PH en el que el número de
cargas (+) es igual al número de cargas de
cargas -), el PH normal del medio = 7,38 – 7,42.
Si la proteína está a un PH del medio por debajo
de su P.I (ej: P.I = 8) dicho medio será ácido para
esta proteína. Entonces la proteína se
comportará como básica (mayor cantidad de

Una vez secos los cortes adheridos al portaobjetos
se los colorea: técnica con H&E (de rutina)
1. Desparafinización: se coloca portaobjetos en
recipiente con xilol.
2. Hidratación/Rehidratación: se reemplaza xilol por
cantidades decrecientes de alcohol y luego se lava
con agua (para favorecer la acción del colorante
hidrosoluble).
3. Coloración propiamente dicha: se agrega el
colorante.
4. Viraje: se lava con agua (vira de color rojo al azul).
5. Deshidratación: se sumerge en alcohol para
extraer exceso de colorante.
7) Montaje Final: Cubrir la muestra para el análisis:
1. Deshidratación: para preparar los preparados por
tiempo prolongado. Se sumerge el preparado en
soluciones de etanol de graduación crecientes (70%,
80%, 96%, 100%).
2. Aclaración: (con xilol o benzol) para diluir la resina
adhesiva utilizada para pegar el cubreobjeto
3. Se agrega bálsamo de Canadá o resinas
sintéticas y se cubre con portaobjeto que se sella
con betún de Judea. Una vez que el medio de
montaje se solidifica, el preparado está listo para su
observación al microscopio sin riesgos de que se
mueva el cubreobjeto.
→ Ortocromasia: propiedad por la cual el
tejido/célula teñido presenta una coloración
semejante a la del colorante.
→ Metacromasia: Ciertos colorantes básicos
reaccionan con los componentes del tejido que
cambian su color normal de azul a rojo o púrpura;
este cambio de la absorbancia/color se llama
metacromásia. Se utiliza para los POLIANIONES.
PROTEOGLICANOS (Grupo sulfato)
Matriz Celular Cartilaginosa
Tejidos metacromáticos:
 Cartílago(por poseer condroitin sulfato en su
matriz)
 Célula caliciforme
 Mastocito(por poseer gránulos de heparina)
 Basófilo de la sangre(por poseer gránulos de
heparina)
Sustratos metacromáticos Colorantes metacromáticos
• Matriz amorfa del cartílago • Azul de toluidina
hialino
• Azul de metileno
• Gránulos de los mastocitos y
basófilos • Metil violeta
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1) Obtención de la pieza
2.) Fijación con glutaraldehído y tetróxido de osmio.
3)Inclusión:
 Deshidratación (con solución creciente de
alcohol).
 Aclaración (con óxido de propileno).
 Inclusión propiamente dicha (se utilizan acrílicos o
resinas sintéticas de tipo epoxi).
4. Corte: ultramicrótomo (con cuchilla de
diamante).
5. Montaje: sobre grillas metálicas, no se colorea,
pero puede contrastarse con metales pesados
como plomo, uranilo, hierro, INMUNOFERRITINA,
etc.
▪ Técnica de Glúcidos: Ácido periódico de Schiff
(PAS)
La utilidad de la reacción de PAS consiste en que
permite visualizar glúcidos de todo tipo,
polisacárido simple (glucógeno) y glucoproteínas
en los tejidos a los que tiñe de color magenta. El
Acido Peryódico rompe a los hidratos de carbono
y libera grupos Aldehido, que se unen al reactivo
de Schiff
Se visualizan:
• Membranas basales de los tejidos epiteliales.
• La mucina de las células caliciformes.
• El glucocáliz de las células epiteliales.
• Las inclusiones de glucógeno de los hepatocitos.
• Vesículas de mucinógeno
▪ Técnica de ADN: Feulgen:
La reacción de Feulgen permite la demostración
de ADN en el núcleo de las células.
Se visualizan:
• Tiñe los núcleos de color magenta.
• Tiñen o visualizan los núcleos de las células en
interfase.
• Tiñe los cromosomas de las células en división.
▪Técnica de Lípidos: Sudán:
→ Sirve para lípidos
→ Utiliza colorantes liposolubles
→ La fijación es hecha por congelación/desecación
→ Aclarantes es el tuluol (Sudan+HyE)
Las técnicas de sudán permiten la demostración
de lípidos (triglicéridos, colesterol, fosfolípidos y
todo tipo de esteroides) en los tejidos.
Tipos de sudán:
• Sudán Black B (negro).
• Sudán III (rojo escarlata).
Se visualiza:
• Inclusiones de lípidos en células de la corteza
suprarrenal.
• Tejido adiposo uni o multilocular.
Pasos:
1) En la fijación pueden ser necesarios fijadores
especiales (mezclas para fijar lípidos) o hacer los
cortes por congelación, debido a que se pierden
los lípidos de la realización de la técnica de rutina.
2) El principio por el cual tiñen a los lípidos es un
principio físico. El colorante se solubiliza en los
medios que contiene lípidos, así logran diluirse y
colorear específicamente a estos.
▪ Tricrómico de Mallory
Esta es una técnica que emplea tres
colorantes: fucsina ácida, azul de anilina y Naranja
G; para visualización de várias estructura de una
sola vez.
Tiñe:
• Fibras colágenas, reticulares, la matriz
extracelular del cartílago y el hueso de color azul.
• Citoplasmas, núcleos y músculos, en distintas
tonalidades de rojo.
• Fibras elásticas y hematíes, de color amarillo.
▪ Tricrómico de Masson
El tricrómico de Masson emplea hematoxilina de
Mayer, fucsina Ponceau y azul de anilina.
Tiñe:
Tricrómico de Masson
• Núcleos de color azul.
• Citoplasmas rojos.
• Fibras colágenas de color celeste.
•Glóbulos rojos y el músculo de color fucsia.
▪ Técnica de InmunoHistoquímica:
Técnica altamente selectiva, uso de anticuerpos
marcados con fluorescencia(con peroxidasa o
ferritina) o con una enzima para evidenciar una
molécula específica para identificar sustancias
celulares o tisulares
Directo: Usa solo uno anticuerpo que estén en
gran cantidad
Indirecto: Uso de dos anticuerpos que estén en
gran cantidad
Antígeno(Ag): Es cualquier molécula que en
contacto con el organismo pueda activar una
respuesta del sistema inmune.
Anticuerpo(Ac): Es una proteína plasmática
específica, producida por células plasmáticas
(Plasmocitos) que reconoce a un antígeno en
particular.
Fluorocromo: Elemento que reluce ante la
exposición a la luz fluorecente.
Anticuerpo Primário: Monoclonal
Anticuerpo Secundário: Policlonal
▪ Técnica de inmunoperoxidasa:
En estas técnicas se utilizan anticuerpos que
son de animales para identificar moléculas próprias
especificamente. (Hay dos formas directa y
indirecta)
▪Radioautografía:
Revela el destino metabólico celular o tisular de
sustancias que forman parte de las células o
tejidos. Consiste en administrar esas sustancias
marcadas con isótopos radioactivos (que poseen
igual característica y destino final que la no
marcada). Se obtienen los cortes, se los monta y
se los coloca en un cuarto oscuro cubriéndolos
con una fina capa de emulsión fotográfica
(cristales de bromuro de plata emulsionada con
gelatina). Las sustancias marcadas más utilizadas
son hidrógeno tritiado, timidita tritiada (específica
para el ADN).