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INSTITUTO TECNOLGICO DEL VALLE DE

MORELIA
CARRERA: INGENIERIA EN AGRONOMA
ASIGNATURA: MICROBIOLOGA
TEMA: PREPARACIONES PARA
MICROSCOPIA, TIPOS, TECNICAS Y
PRESERVACIN.

2.2 Preparaciones para


microscopa.
En todos los microscopios, la calidad de imagen depende de tres
factores.
El aumento es la amplificacin de un objeto.
El contraste es diferencia de la intensidad luminosa.
Una buena resolucin significa ser capaz de percibir dos
puntos adyacentes de una imagen como separados uno del
otro.
El poder de resolucin de un microscopio se puede aumentar
usando lentes de aumento de mayor tamao, iluminando el
espcimen con una luz de menor longitud de onda, o usando
aceite de inmersin.

PREPARACION Y TINCION DE LA
MUESTRA
Aumentar la resolucin
Acentuar caractersticas morfolgicas
Conservar la muestra
PREPARACION (FIJACION)
En este proceso se fijan en su
posicin las estructuras internas y
externas de la clula.
Mata al microorganismo y se fija al
portaobjetos
Por
calor:
Preservar
morfologa
general pero no las estructuras
internas.
Qumica: Proteger la sub-estructura
fina
y
la
morfologa
de
los
microorganismos delicados.

Las
preparaciones
microorganismos vivos.

en

fresco

se

utilizan

para

observar

La forma ms simple de preparar un microorganismo para un


examen microscpico es hacer una preparacin en fresco o in
vivo.
Una preparacin en fresco simple (entre porta y cubre) consiste en
colocar una gota de lquido con los microorganismos, despus
colocar el portaobjetos y el cubreobjetos.
El inconveniente de la observacin en fresco es que no permite
aumentar el contraste de la preparacin.

Preparacin en gota pendiente:


Se utiliza para la observacin in
vivo .
Consiste en depositar una gota de la
suspensin
microbiana
en
el
cubreobjetos
aprovechando
la
tensin superficial del agua, se gira
el cubreobjetos cuidadosamente y
se coloca sobre un portaobjetos
excavado.
La ventaja de esta ltima tcnica,
es que la preparacin no se evapora
y puede ser observada durante un
tiempo ms largo.
Si se desea, puede usarse parafina
o vaselina en el cubreobjetos para
hacer la muestra mas hermtica.

Los frotis.
En ocasiones, la concentracin de clulas en una
muestra puede ser muy elevada, o por su
naturaleza encontrarse muy aglutinadas.
Para extenderlas sobre un portaobjetos
poderlas observar bien se preparan los frotis.
Para realizar un frotis, ya sea
suspensin celular, suspensin
bacteriano, etc.

de
de

sangre,
cultivo

Tcnica de la tincin de Gram.


Gracias a esta tincin, veremos a las bacterias divididas en dos grupos,
las Gram +, que aparecen con un intenso color morado debido al
colorante violeta de genciana, y las Gram -, que parecen teidas de un
dbil tono rosado debido al colorante safranina.
Esta diferenciacin es debida a que las Gram + quedan teidas por el
violeta de genciana, sin perder el colorante en la decoloracin
alcohlica.
Por el contrario, las Gram no han quedado teidas por el violeta de
genciana y lo pierden en la decoloracin.

2.2.1 Tipos
Un microscopio optico utiliza la luz visible como fuente de
iluminacin. Posee dos sistemas de lentes; lente ocular y lente
objetivo.
Los microscopios pticos compuestos estn provistos de varios
objetivos:

Dbil seco: 10x


Fuerte seco: 40x
Objetivo de inmersin: 100x
Un microscopio ptico ordinario produce un campo de iluminacin
claro que pasa a travs del espcimen y se observa de forma
brillante.

Un microscopio electrnico posee un poder de


resolucin mayor al ptico.
El microscopio electrnico de transmisin
(MET) utiliza un chorro de electrones en lugar de
luz visible para definir el objeto.
Produce aumentos de 200 000x en comparacin
con los 1000x para un microscopio ptico.

El microscopio electrnico de barrido (MEB)


bombardea la superficie del espcimen con un rayo
de electrones de tal manera que produce imgenes
tridimensionales.
Las muestras para el MEB deben ser congeladas y
desecadas al vaco y despus recubiertas con un
metal pesado.
El MEB se utiliza generalmente para visualizar
clulas enteras, pero la criofractura y el criograbado
tambin permiten observar estructuras internas.

Comparativa de la composicin bsica de un


microscopio
ptico
(izquierda),
electrnico
de
transmisin (centro) y electrnico de barrido (derecha)

Tipos de microscopa
Microscopa ptica normal: El
material a observar se colorea
con colorantes especficos que
aumentan el contraste y revelan
detalles.
Microscopa
de
campo
brillante:
Se
observa
sin
coloracin.
La
luz
pasa
directamente y se aprecian
detalles naturalmente coloreados
Microscopa
de
campo
oscuro: Produce una imagen
iluminada del objeto sobre un
fondo oscuro. Se emplea para
observar organismos vivos en
preparaciones sin teir.

Microscopia de fluorescencia:
El contraste se aumenta por medio de la fluorescencia.
El microscopio debe modificarse con filtros especiales para
iluminar la preparacin con luz ultravioleta de longitud de
onda corta.
(Esta es la propiedad que tienen algunos materiales de
absorber luz de una determinada longitud de onda y
devolverla con una longitud de onda mayor).

Microscopa en contraste de fase: El contraste se debe


a que los diferentes materiales absorben diferentes
cantidades de luz.
Se usa principalmente para aumentar el contraste entre
las partes claras y oscuras de las clulas sin colorear.
Puede utilizarse con clulas vivas sin teir, es una buena
tcnica para observar detalles pequeos y estudiar el
movimiento celular.

Microscopa
de
Nomarsky;
[microscopa
diferencial de contraste de interferencia
(DIC) ] :
Proporciona contraste por interferencia, como lo
hace el contrate de fases, pero produce una imagen
semejante a las tridimensionales, con ms detalle.
Se usa cuando el espcimen es muy grueso para
usar contraste de fases.
Utiliza dos rayos de luz polarizada, fue diseado para
observar relieves de especmenes muy difciles de
manejar, es muy utilizado en los tratamientos de
fertilizacin in-vitro.

2.2.2 Tcnicas
TINCIONES
Los colorantes son compuestos
qumicos utilizados para aumentar
el contraste. La mayora slo son
efectivos si los microorganismos
han sido fijados.
Un mordiente es un compuesto
que recubre la estructura para
hacerla mas visible.
Colorantes
bsicos:
cargados positivamente

iones

Colorantes
cidos:
cargador negativamente

iones

Una tincin simple utiliza un solo colorante. Una tincin


diferencial consta de dos etapas, una tincin primaria y una de
contraste.
La tincin de Gram es diferencial y distingue entre bacterias
Gram positivas y Gram negativas, debido a distintas superficies
externas.
La tincin de acido-alcohol resistencia- o de Ziehl Neelsenes diferencial y tie las micobacterias de rojo, mientras que las
otras bacterias son teidas de azul por el colorante de contraste.
La tincin de Wirtz- Conklin tie las endosporas, estructuras de
reposo de algunas bacterias.
La tincin de Leifson utiliza colorantes u mordientes para teir
los flagelos, apndices filamentosos por la motilidad.
La tincin negativa se utiliza para observar la cpsula, una
estructura protectora de algunas bacterias.

2.2.3 Preservacin
Mantenimiento bajo capa de aceite
Simple y efectiva
Consiste en cubrir el cultivo (medio slido) con
una capa de aceite mineral o vaselina.
Pueden conservarse por periodos de tiempo
largos (varios aos) a temperatura ambiente.
Pueden ocurrir mutaciones, luego de los 3 aos
de mantenimiento.

Desecacin:
La eliminacin del agua (deshidratacin) es un
mtodo de conservacin que reduce drsticamente
el metabolismo.
No todos los microorganismos sobreviven a estos
mtodos de secado, por lo que se hace necesario
aadir agentes protectores (leche descremada,
glutamato sdico al 10%).
Es importante mantener el producto sellado (tapn
de rosca o ampolla) para evitar el contacto con el
aire ya que son higroscpicos.

Soportes, se suelen utilizar:

Arena
Suelo
Gel de slica
Discos o tiras de papel
Agar
Discos de gelatina
Estos deben ser previamente secados y
esterilizados por calentamiento con aire caliente
seco.

Congelacin:
Bajar la temperatura hasta el punto de congelacin o por debajo de ste se reduce el
metabolismo drsticamente hasta el caso de prcticamente anularlo con nitrgeno lquido (196C).

La formacin de cristales de hielo (pueden romper las clulas), para evitar esto se deben
utilizar:
Suspensiones que contengan el mnimo de sales posibles
Agentes protectores como el glicerol (25%) o dimetilsulfxido (DMSO al 10%) que neutralizan
el efecto de las sales.
Algunos recomiendan una bajada gradual de temperatura (1C/min) hasta -20C para luego
enfriar rpidamente. La descongelacin debe ser rpida.

Esquema de los eventos fsicos ocurridos en el


congelamiento. (hexgonos representan cristales
de hielo de diferente tamao segn la velocidad
de enfriamiento). Adaptado de Ciba, 1977.

Crioprotectores:

Glicerol 10%
Dimetilsulfxido
Glucosa
Dextranos
Sacarosa
Lactosa
Extracto de malta

Liofilizacin:
Es el mtodo ms utilizado por las colecciones internacionales
de cultivos de microorganismos.
Consiste en congelar rpidamente una suspensin de
microorganismos y eliminar el agua como vapor de agua
directamente del hielo sin pasar por el estado lquido.
El sistema requiere tres componentes:
Mecanismo de congelacin
Bomba de vaco
Una trampa de agua.
Los microorganismos lifilizados se conservan entre 0y 5C
durante muchos aos.
Para su recuperacin se resuspenden los organismos en el
medio de cultivo adecuado y se incuban a la temperatura
adecuada.

Algas y cianobacterias
La mayor parte de los cultivos se han mantenido
como subcultivos seriados a temperaturas entre
10y 15C.
Para crecer estos cultivos se necesita luz, ya que
son fotosintticos.
Las algas no toleran bien la liofilizacin ni la
desecacin.
Con relacin a la congelacin los mejores
resultados se obtienen con nitrgeno lquido.

Bacterias
Prcticamente se han usado todos los mtodos
conocidos con buenos y malos resultados, aunque
en lneas generales el mejor mtodo es la
liofilizacin debido a su facilidad de transporte.

Virus
Se han utilizado todos los mtodos, pero
obteniendo en lneas generales baja estabilidad.
Se recomienda para su conservacin durante
largos perodos de tiempo el nitrgeno lquido.

Hongos
La mayora de los hongos pueden conservarse
por desecacin en suelo.

Bibliografa
INGRAHAM, John L y Catherine, Introduccin a la Microbiologa, Editorial Revert, S.A.
Barcelona, Espaa, 1998.
http://
depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Practica_preparaciones_microbiologicas_18855.pdf
http://
ssyf.ua.es/es/formacion/documentos/cursos-programados/2011/especifica/microscopia-optica
/microscopia-optica-y-laser-confocal-2a-ed/tema-4.pdf
http://
pagina.jccm.es/museociencias/otras%20actividades%20web/material%20cnr%20web/manu
al%20de%20microscopia.pdf
http://
www.ipb.csic.es/servicios/Microscopia/uploads/3/6/2/2/3622788/microscopia_a_grandes_rasg
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http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Practica2PreparacionesYtinciones_20836.pdf
http://
facultad.bayamon.inter.edu/yserrano/microbiologia%20industrial/Metodospreservacionmicr
oorganismos2.pdf
http://iespoetaclaudio.centros.educa.jcyl.es/sitio/upload/manual_microscopio.pdf