UNIVERSIDAD DE TECNOLOGIA EXPERIMENTAL YACHAY TECH

Kevin Restrepo1

Escuela de Ciencias Biológicas e Ingenierı́a

Biologı́a Molecular
Prof. Mariela Pérez
Actividad de Laboratorio

PCR y Diseño de Primers

27 de Octubre de 2023
 Diseño de Primers

1. A continuación se proporciona la secuencia del gen HBB. Diseñe manualmentelos

primers forward y reverse que amplificarán la parte en negrilla del gen HBB.Longitud de
cada primer para el propósito de este ejercicio: 15 nt

> N G0 59281,1Homosapienshemoglobinsubunitbeta(HBB), Ref SeqGene(LRG1 232)onchromosome11

Secuencia de 5’ a 3’

Secuencia de 3’ a 5’

Primer Forward: ATG AAG TTG GTG GTG

Primer Reverse: CCT TTG TCT GCT TAC

Notar que dentro del ejercicio al tener únicamente la hebra de sentido 5’ a 3’ se debió realizar la
hebra complementaria con el objetivo de diseñar el primer reverse.

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 2. Para cada primer que haya diseñado, use el sitio web oligo Analyzer para determi-
nar si cumplen con los requisitos básicos del cebador. Registre en la siguiente tabla los
siguientes parámetros:

Primer Forward Primer Reverse

Secuencia ATG AAG TTG GTG GTG Secuencia CCT TTG TCT GCT TAC
Longitud (nt): 15 Longitud (nt): 15
Contenido Contenido
46.7 % 46.7 %
GC % GC %
Tm: 45.2 ◦ C Tm: 43.1 ◦ C
Peso Molecular: 4703.1 gr/mol Peso Molecular: 4485 gr/mol

En este caso se analizan las caracterı́sticas y propiedades fı́sicas de los primers elaborados con el
objetivo de analizar y verificar las condiciones que debe cumplir el experimento para que la PCR
sea efectiva. Por tal razón, se usó un estándar de longitud de 15pb para el cebador, presentando un
46 % de concentración en guaninas y citosinas, lo que los asegura su especificidad. Además tiene un
∆T = 2,1◦ C un valor considerable para la estabilidad estructural del primer.

3. Elabore un diagrama utilizando una plantilla de ADN de doble cadena del gen
HBB (pregunta 1) y mostrar al sitio a dónde se unen los primers y en qué dirección se
amplifica el ADN. Indique los extremos de 5’ y 3’ en la secuencia plantilla y en los primers

4. Cuál es el tamaño del fragmento de DNA que se va a amplificar en el gen HBB?

Generalmente, el tamaño amplificado por una PCR es calculado a través de la longitud entre ce-
badores. Para calcular el número de nucleótidos que sintetizan. Si tomamos en cuenta la amplificación
únicamente de la secuencia marcada en negrita en el cual tenemos un total de 495 nucleótidos, se puede
deducir por la eliminación de los primeros 15 nucleótidos por los primers de ambas hebras, entonces
se tendrı́a una amplificación de 480 nucleótidos.

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 5.Encuentre la secuencia FASTA en el NCBI y coloque dos primers de cada herra-
mienta molecular; Primer3plus y NCBI con las caracterı́sticas especı́ficas.
1. NCBI

Primer Forward Primer Reverse

SecuenciaTGAGTCCAAGCTAGGCCCTT Secuencia ATGCACTGACCTCCCACATT
Longitud de PCR 383 pb
Contenido de GC % 55 % Contenido de GC % 52.38 %
Longitud 20pb Longitud 20pb
Tm 60.55◦ C Tm 60.34 ◦ C

Primer Forward Primer Reverse

SecuenciaGAGTCCAAGCTAGGCCCTTT Secuencia ACTGACCTCCCACATTCCCT
Longitud de PCR 378
Contenido de GC % 55 % Contenido de GC % 52.38 %
Longitud 20pb Longitud 20pb
Tm 59.38 ◦ C Tm 60.77 ◦ C

1. Primer3plus

Primer Forward Primer Reverse

Secuencia
TGAGCACCATTTTTGCCATA Secuencia CTGCTGCCAGTCAATTCAAA
Longitud de PCR 250pb
Contenido de GC % 40 % Contenido de GC % 45 %
Longitud 20pb Longitud 20pb
Tm 60.1 ◦ C Tm 60 ◦ C

Primer Forward Primer Reverse

Secuencia
ACATCACCTGGATGGGACAT Secuencia CCACCCTCAACCCTCAAGTA
Longitud de PCR 245pb
Contenido de GC % 50 % Contenido de GC % 55 %
Longitud 20pb Longitud 20pb
Tm 60.1 ◦ C Tm 60 ◦ C

Reacción en cadena de la polimerasa

En esta sección se explicarán los distintos cambios de temperatura con una función especı́fica para
cada uno de los componentes de la PCR.
Temp Tiempo Paso PCR #Ciclos Descripción
Desnaturalización
95 ◦ C ≥ 30seg 1 Es un control de optimización para asegurar la separación o desnaturalización de las dos hebras de ADN.
inicial
95 ◦ C ≥ 30seg Desnaturación 1 Las dos hebras de ADN se separan por debilitamiento de los puentes de hidrógeno
55-65 ◦ C ≥ 30seg Annealing 1 La temperatura se baja gradualmente para facilitar el ingreso de los cebadores en la secuencia especı́fica
72 ◦ C ≥ 30seg Extension 1 Es un control de optimización para asegurar la sı́ntesis completa de la hebra complementaria para las copias de ADN especı́ficas.
La temperatura es elevada para el ingreso de la Taq DNA polimerasa y sintetize la hebra complementaria.
72 ◦ C ≥ 30seg Final Extension 1
Se añade los nucleótidos que se encuentran en el medio hasta llegar a completar la secuencia especı́fica y reanudar un nuevo ciclo.

1. ¿Cuál es la relación entre el tiempo de extension y el tamaño del producto de PCR?

La relación es directamente proporcional es decir a mayor tamaño de la muestra de PCR mayor
tiempo de extensión por la polimerasa tomará. Además, la ADN polimerasa tiene la capacidad
de sintetizar 1000 pb por minuto. Por tanto, el tamaño que se obtendrá dependerá de factores de
longitud de la muestra, concentración de nucleótidos en el medio y la eficacia de la polimerasa.
2. ¿Si queremos amplificar un gen de 750 pb, es suficiente usar un tiempo de extension de 1 min a
72 ◦ C?
Efectivamente, tomando en cuenta que la ADN polimerasa tiene la capacidad de sintetizar 1000
pb por minuto. Además, el tiempo para generar 750 pb seria de 45 segundos y los 15 segundos
extra de extensión será destinado como control de optimización para verificar la calidad de la
sı́ntesis final.

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 3. ¿Qué pasará en una PCR si la temperatura de annealing es muy baja?
Es importante notar que la temperatura es un factor importante para llevar a cabo el anillamiento
o unión de los cebadores para ayudar a la DNA polimerasa, por tal razón tenemos la temperatura
melting, el cual especifica el rango en donde el primer es activado y es funcional. Por tanto, si la
temperatura de annealing es muy baja, lo más probable es que lo se adhieran los cebadores a las
cadenas de DNA.

4. ¿Qué pasará en una PCR si la temperatura de extensión es muy alta?

Al sobrepasar los lı́mites de temperatura en la fase de extensión, el ADN, los cebadores y la
ADN polimerasa sufren de pérdida de especificidad por un cambio en su estructura quı́mica
principal debido al rompimiento de sus enlaces internos provocando efectos negativos como falsas
repeticiones, desnaturalización inadecuada, entre otros.

5. ¿Qué es un PCR master mix y cuáles son las ventajas de usarlo?

El Master Mix es una combinación de todos los elementos primordiales en una PCR. Tales como;
Taq polimerasa, buffer, dntps y MgCL2. Con el objetivo de trabajar únicamente con el menor
número de intentos de pipeteo. De tal forma disminuimos el error sistemático de los volúmenes
y la contaminación externa.

6. ¿Qué es un primer? Cuántos primers se usan en una PCR?

El primer es una secuencia con una longitud aproximada de 15pb que cumple la función de ayudar
a guı́ar e iniciar la sı́ntesis de la hebra complementaria en función de la secuencia especı́fica de
la PCR a través de la ADN polimerasa.
7. ¿De qué organismo se aisla la Taq DNA polimerasa?
El uso de la Taq polimerasa se obtiene a través del aislamiento de una bacteria conocida como
Thermus aquaticus que cumple su funcionalidad a altas temperaturas.
8. ¿Cuál es la importancia de usar Taq DNA polimerasa en una reacción de PCR?
La maquinaria molecular indispensable para llevar a cabo una PCR es sin duda la Taq polimerasa
ya que es la única encargada de sintetizar las cadenas en sentido upstream y downstream para
la replicación de la secuencia especı́fica de ADN.
9. ¿Cuál es la función de MgCl2 en la reacción de PCR?
La función principal del cloruro de magnesio es activar la Taq polimerasa a través de su com-
portamiento de cofactor, debido a que la ADN polimerasa tiene una estructura de apoenzima
por tanto, el cloruro de magnesio ayudará a activar su función holo-enzimática formando una
estructura óptima en su sitio activo para la adquisición de los sustratos requeridos.
10. ¿Qué pasarı́a si se usa una concentración muy alta de MgCl2 en la reacción de PCR?
Es importante recalcar que la concentración de cloruro de magnesio dependerá de forma directa
del tipo de ADN polimerasa se este trabajando en la PCR, por lo general esta información
es proporcionada por el productor de la enzima. Sin embargo, el uso excesivo o escaso en una
práctica de PCR puede causar efectos negativos en los resultados debido a alteraciones en los
factores de especificidad y eficiencia.

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 6. Escriba en la imagen a continuación la secuencia de DNA que esperarı́a obtener en
este ciclo

. Referencias

Rodrı́guez, A., Rodrı́guez, M., Córdoba, J. J., Andrade, M. J. (2015). Design of primers and
probes for quantitative real-time PCR methods. PCR primer design, 31-56.
Dopazo, J., Rodrı́guez, A., Sáiz, J. C., Sobrino, F. (1993). Design of primers for pcr ampiification
of highly variable genomes. Bioinformatics, 9(2), 123-125.

Koressaar, T., Remm, M. (2007). Enhancements and modifications of primer design program
Primer3. Bioinformatics, 23(10), 1289-1291.