Transformaci

ón Bacteriana

Biol 3101
Creado por: Rosalba Velázquez Roig
Modificado por: Eliel Rivera Rosario y
Saely Rosado Ortiz
Objetivos
• Correlacionar la función del DNA y el fenotipo del
organismo
• Identificar y explicar las aplicaciones de la
transformación de bacterias en la medicina,
agricultura y otras industrias
• Definir: vectores, plasmidios, enzimas de restricción,
sitios de restricción, ligasa de DNA, transformación,
biotecnología
• Practicar la técnica aséptica, de estriado, manejo de
microorganismos y utilización de micropipetas
• Realizar la transformación de bacterias utilizando un
plasmidio
• Determinar la eficiencia de la transformación.
DNA es el material Genético
G
5 end
C
C G Hydrogen bond
3 end
G C
G C T A

3.4 nm
T A

G C G C
C G

A T

1 nm C G
T A
C G
G C
C G A T

A T 3 end
A T
0.34 nm
T A 5 end

(a) Key features of (b) Partial chemical structure (c) Space-filling

DNA structure model

Figure 16.7
Dogma central de Biología Nuclear
envelope

TRANSCRIPTION DNA

Pre-mRNA
RNA PROCESSING

mRNA
DNA
TRANSCRIPTION

mRNA
Ribosome TRANSLATION Ribosome
TRANSLATION

Polypeptide Polypeptide

(a) Bacterial cell (b) Eukaryotic cell

Figure 17.3
Bacterias

• Organismos procariota que carecen de

núcleo.
• Su DNA está localizado en una región
que se conoce como nucleoide.
• Muchas bacterias contienen un DNA
circular y además contienen plásmidos
• Plásmidos- material genético
extracromosomal que pueden contener
genes de resistencia.
• Vector- moléculas que sirven para
cargar un DNA recombinado.
 • En eucariotas, se da en los
procesos sexuales de
fertilización
• Los procariotas tiene tres
mecanismos:
transformación,
transducción y conjugación.
• Transferencia horizontal de
genes: transferencia de
genes entre diferentes
especies.

Recombinación genéti ca
 Recombinación
genéti ca
• Transformación: adquisición de
ADN directamente del
ambiente
• Transducción: adquisición de
ADN por medio de vectores
virales
• Conjugación: adquisición de
ADN entre bacterias
Transformación

La célula puede incorporar ADN foráneo del ambiente circundante

(otra bacteria que se haya muerto y liberado ADN).
Transducción/Transfección

Movimiento de genes entre bacterias por medio de bacteriófagos

(virus que infectan bacterias).
Conjugación

Pasan plásmidos de una bacteria a otra por medio de un puente de

apareamiento (o “pili”)
DNA es el material genético
Principio de Transformación
• 1928- Experimentos de Frederick Griffith
• Sentaron las bases para la identificación del DNA
como material genético
• Bacteria: Streptococcus pneumoniae
• Observación: cepas no virulentas se tornaban
virulentas cuando se mezclaban con cepas
virulentas de S. pneumoniae que habían sido
calentadas.
• Ocurría una transformación de cepas No virulentas
a virulentas.
Principio de Transformación (2 cepas de Streptococcus pneumoniae)

Rugosa (R)
No virulenta

Lisa (S)
Virulenta
 • Proceso mediante el cual un organismo
¿Qué es la huésped puede tomar DNA de su entorno.
Transforma- • Células pueden ser tratadas con químicos
ción? para convertirlas en células competentes.
• Células competentes- células capaces de
capturar DNA.
• El cambio de genes y fenotipo de una bacteria
por la captura de un DNA nuevo o foráneo.
 Muchos métodos para clonar
Clonación fragmentos de ADN en el
del ADN y laboratorio utilizan bacterias y sus
aplicaciones plásmidos.

Plásmidos- moléculas de ADN

circular extracromosómico de doble
cadena, que se replican de forma
separada del cromosoma
bacteriano.
Animation: Cloning a Gene
Figure 20.2a

Bacterium
1 Gene inserted into
Cell containing
plasmid
gene of interest

Bacterial Plasmid
chromosome Gene of
Recombinant interest DNA of
DNA (plasmid) chromosome
2 Plasmid put into
bacterial cell (“foreign” DNA)

Recombinant
bacterium
 • Enzimas de restricción- Enzimas que cortan el ADN.
Reconoce una o un número determinado de
Enzimas de secuencias blanco en el ADN y cortan esa región o
cerca de ella. Cortan enlaces fosfodiester.
Restricción y • Se conocen también como nucleasas.
DNA Ligasa • Las moléculas específicas que cortan las bacterias se
conocen como sitios de restricción.
• Estas enzimas pueden realizar dos variaciones de
cortes:
• Truncado o abrupto (“Blunt ends”)- cortan en un
solo punto. Corta sobre los dos ejes de simetría.
• Cohesivos o pegajosos (“Sticky ends”)- cortes de
manera escalonada en dos puntos diferentes.
Enzimas de Restricción y DNA Ligasa

(Brooker et al., 2017)

Cortes: truncados (“blunt ends”) vs pegajosos
(“sticky ends”)
Corte truncado Corte pegajoso
 DNA Ligasa

• Liga fragmentos del DNA

que pareen
• Une dos piezas de DNA
• Forma enlaces
covalentes, cataliza
enlaces fosfodiester
entre el extremo 5’ de
una cadena de
nucleotidos y el extremo
3’ de otra cadena.
Figure 20.3-1
Restriction site
5 3
GAATTC
DNA CTTAAG
3 5
1 Restriction enzyme
cuts sugar-phosphate
backbones.
3 5
5 AATTC 3
G
CTTAA G
5 Sticky 3
3 5
end
Figure 20.3-2
Restriction site
5 3
GAATTC
DNA CTTAAG
3 5
1 Restriction enzyme
cuts sugar-phosphate
backbones.
3 5
5 AATTC 3
G
CTTAA G
5 Sticky 3
3 5
end
5
AATTC 3
G G
CTTAA
2 DNA fragment added 3
from another molecule 5
cut by same enzyme.
Base pairing occurs.

5 3 5 3 5 3
G AATT C G AATT C
C TTAA G C TTAA G
3 53 5 3 5
One possible combination
Figure 20.3-3
Restriction site
5 3
GAATTC
DNA CTTAAG
3 5
1 Restriction enzyme
cuts sugar-phosphate
backbones.
3 5
5 AATTC 3
G
CTTAA G
5 Sticky 3
3 5
end
5
AATTC 3
G G
CTTAA
2 DNA fragment added 3
from another molecule 5
cut by same enzyme.
Base pairing occurs.

5 3 5 3 5 3
G AATT C G AATT C
C TTAA G C TTAA G
3 53 5 3 5
One possible combination
3 DNA ligase
seals strands
5 3

3 Recombinant DNA molecule 5

Figure 12.2-5

Every restriction enzyme recognizes one

specific nucleotide sequence (its restriction site).
Restriction
DNA site
GAATTC
CTTAAG

A restriction enzyme always cuts

Restriction
DNA sequences at its restriction
enzyme
site in an identical manner.

G A AT T C
C T TA A G

Sticky
A piece of DNA from another
end Gene of interest
source (the gene of interest) is cut
A AT T C
by the same restriction enzyme. G G
C T TA A

Sticky end
The DNA fragments from the
two sources stick together G AATT C G AATT C
by hydrogen bonding of C TTAA G C TTAA G

base pairs.

The enzyme DNA ligase creates DNA ligase

new covalent bonds that join
the backbones of the DNA
strands. The result is a piece
of recombinant DNA. Recombinant DNA
DNA
Recombinante
Métodos para obtener
células competentes
• Electroporación
(electrotransformación)
• Más fácil, más eficiente
• Transformación química
• CaCl2 = facilita la unión del ADN
a las paredes de las células
Electroporación
• Aplicación de voltaje a células
durante un periodo de tiempo muy
corto.
• Las membranas se depolarizan y se
forman pequeños orificios por los que
penetran las moléculas (proteínas,
DNA,...)
• Ventaja: se aplica a millones de
células a la vez; se obtienen
eficiencias de entrada de las
moléculas del 100% de las células que
sobreviven (centenares de miles a
millones).
 Reacción de Transformación
usando Electroporacion

http://www.dnalc.org/view/15916-DNA-transformation.html
Transformación química
• Competent Cells CSHL DNA Learning Center.
• Mandel & Higa (1970)
• CaCl2
Reacción de Transformación por Método
Químico (CaCl2)

http://www.dnalc.org/view/15916-DNA-transformation.html
Plásmido
• Los plásmidos que se utilizan como
vectores tienen una región que
contiene múltiples sitios de
restricción (“polylinker”) para
facilitar la inserción del gen de
interés
• La identificación de bacterias
transformadas con plásmidos se
facilita porque sus genes confieren
resistencia a antibióticos
(ampicilina, en el caso del
experimento).
 Plásmido
• El plásmido a utilizarse es el pUC19.
• Contiene el gen lacZ, el cual
codifica para la enzima β-
galactosidasa. Esta enzima cataliza
la degradación de lactosa y sus
análogos (ej. X-gal) en presencia
de un inductor.
• Las bacterias transformadas con el
plásmido se pueden identificar por la
formación de colonias color azul que
se produce por la degradación de X-
gal.