Produccin de Enzimas

Libres e Inmovilizadas
Docente:
Blgo. Fransk Carrasco Solano

Las enzimas son biocatalizadores, pero tambin

pueden considerarse como aditivos altamente
especficos para aplicaciones en alimentos.
En la actualidad se producen:
Enzimas

para la industria: amilasas, proteasas,

catalasas, isomerasas y penicilina acilasas.

Enzimas

para uso analtico: glucosa oxidasa,

galactosa
oxidasa,
alcohol
deshidrogenasa,
hexoquinasa, muraminidasa y colesterol oxidasa.

Enzimas

para medicina: asparraginasa, proteasas,

lipasas y estreptoquinasa.

 Las

amilasas son un conjunto de enzimas

hidrolticas
(-amilasa,
-amilasa,
glucoamilasa y enzimas desramificadoras) que
catalizan la degradacin del almidn.

Existen

amilasas de uso industrial tanto de

origen bacteriano (especies de Bacillus) como
fngico (Aspergillus nger, Rhizopus oryzae) y
son producidas a gran escala para uso en la
industria de la alimentacin y la produccin
de combustibles.

Hidrlisis parcial del almidn para generar dextrinas que son

utilizadas como espesantes.

Obtencin de jarabe de alta maltosa (Glu-Glu) utilizados en la

fabricacin de la cerveza y confituras (dulces, helados, tortas).

Obtencin de jarabes de alta glucosa utilizados en la

fabricacin de cerveza, panes y repostera, confituras y bebidas
no alcohlicas.

Remocin del almidn utilizado como apresto en la industria

textil.

Hidrlisis parcial del almidn en la industria panadera para la

liberacin de glucosa que es sustrato de fermentacin de las
levaduras para producir el leudamiento de la masa.

Hidrlisis del almidn para ser utilizado como fuente de

carbono en diversas fermentaciones, entre ellas la produccin
de etanol para uso alimenticio y combustible; entre otros usos.

METODOS GENERALES PARA LA OBTENCIN

INDUSTRIAL DE ENZIMAS

Hoy se ha logrado obtener enzimas ms puras, que

tienen las siguientes ventajas sobre los productos de
fermentacin:
accin

ms especifica en su funcin cataltica

actividad
es

predecible y controlable

posible utilizar concentraciones ms elevadas

del substrato.

PRINCIPALES FUENTES DE ENZIMAS

Animal
La renina, pepsina, tripsina y lipasa pancretica son de
origen animal.
Vegetal
Lipasas y pectinoesterasa se elaboran a partir de soya,
ricino y frutas ctricas
Microbiana
Las enzimas de los hongos: Aspergillus flavus y Bacillus
subtilis

ELABORACIN DE ENZIMAS
Elaboracin de enzimas de
origen animal o vegetal.
Elaboracin de enzimas de
origen microbiano

Elaboracin de enzimas de origen animal o vegetal.

Animal
Simple trituracin de algunos tejidos especializados.
Formacin de una papilla.
Extraccin de la enzima con un solvente adecuado como agua,
acetona fra(-20C ), glicerina o una solucin salina.

Vegetal
Previamente sometidos a trituracin o disrupcin (rotura).
Tambin puede partirse de los jugos de expresin de los
respectivos tejidos, cuya estructura celular se destruye por
autolisis, plasmolisis o por congelacin, la cual revienta las
paredes celulares.

Elaboracin de enzimas de origen microbiano

Actualmente la tendencia industrial es el reemplazo de muchas enzimas

provenientes de tejidos por aquellas que resultan de la aplicacin de
cultivos de microorganismos seleccionados.

La produccin de enzimas por microorganismos tiene la ventaja de su

costo, generalmente menor, y por realizarse en un periodo relativamente
breve.

Adems, se puede incrementar el rendimiento de una enzima especifica

por un determinado organismo, recurriendo a modificar sus condiciones
ambientales, o bien, a formar por va gentica cepas mutantes, en las
cuales la produccin de la enzima puede ser varias veces superior que en
la cepa original.

Las enzimas elaboradas industrialmente son por lo general del tipo

degradativo y extracelular.

Etapas
Seleccin

de microorganismos:Se empieza
generalmente por un cultivo de enriquecimiento
de la cepa seleccionada. Cultivos originales
pueden obtenerse de la firma American Tipe
Culture
Collection
(ATCC),
del
Northern
Utilization Research Branch o de otro organismo o
instituto reconocido.

Cultivo: Las materias primas que sean de costo adecuado y que puedan
utilizarse como medio de cultivo varan naturalmente segn la enzima
por elaborar y pueden ser de los siguientes orgenes.

a)Materias azucaradas o amilceas, como melaza, jarabe de glucosa,

almidones y afrechos de trigo, arroz o maz.

b)Materias proteicas, como hidrolizados proteicos, harina de

pescado, casena, gelatina y afrechos de extraccin de semillas
oleaginosas.

c)Componentes nitrogenados, como sales de amonio, nitratos, urea.

d)Sustancias favorecedoras del crecimiento microbiano; como,

extractos y autolizados de levadura, sales minerales con inclusin de
elementos trazas y eventualmente vitaminas.

Terminada la incubacin del proceso fermentativo se

separa la biomasa junto con el resto de las clulas y los
componentes slidos del medio de cultivo por filtracin o
centrifugacin.

El liquido resultante, generalmente an bastante

heterogneo, puede utilizarse directamente como
preparado enzimtico.

Gneralmente, se somete a una purificacin y/o

aislamiento posteriores, que comprenden diferentes
fases y que pueden aplicarse igualmente en las enzimas
de origen vegetal o animal.

PURIFICACIN Y AISLAMIENTO DE ENZIMAS.

Adsorcin selectivacon hidrxidos de hierro o aluminio

coloidales, a cierto pH, pues no todas las protenas son
adsorbidas en iguales condiciones.

Porprecipitacin, en que las enzimas son fraccionadas al

reducirse su solubilidad hasta el punto en que precipitan. Esto
se logra por adicin de sales a cierto pH (sulfato de amonio)y
a elevada concentracin inica o por solventes orgnicos
(alcohol, acetona, isopropanol) a baja temperatura.

Dilisispor gradientes de
membranas semipermeables.

concentracin

travs

de

Ultrafiltracinpor aspiracin o presin a travs de

membranas de porosidad fina como tamiz molecular.

Electroforesissobre soportes de papel, gel de almidn,

agar o dextrano.

Fraccionamiento cromatograficoPico de tipo preparativo,

tanto en cada fina, como en columna con intercambiadores
inicos, geles o tamices moleculares.

ENZIMAS INMOVILIZADAS
El

enorme nmero de reacciones catalizadas por

enzimas y la especificidad de las enzimas individuales
significan que stas son potencialmente de gran valor
industrial.

Su

costo se agudiza al aplicarlas como reactivos en

forma soluble, pues se produce su prdida, una vez
utilizadas.

Aunque

la enzima por regenerarse en el proceso podra

usarse muchas veces, su separacin a partir de la
mezcla de reaccin no es econmicamente factible.

De all que ha significado un avance importante la

posibilidad de inmovilizar las enzimas sobre soportes
inertes, reteniendo as gran parte de su actividad
cataltica original.

Como las reacciones enzimticas se desarrollan en medio

acuoso, la matriz del soporte debe ser insoluble en agua,
pero tan hidrfila que garantice un buen contacto con el
medio de la reaccin.

Su aplicacin se basa en sus interesantes propiedades:

Son trmicamente ms estables que las enzimas nativas y

ms resistentes a la autolisis.

Al final de una reaccin catalizada enzimticamente, la

enzima enlazada puede separarse por simple centrifugacin o
filtracin, sin necesidad de agregar un reactivo de
inactivacin o precipitacin.

Una vez recuperada, la enzima enlazada puede volver a

usarse las veces que se desea, sin prdida sustancial de
actividad despus de un simple lavado con soluciones
tampones acuosas y permitiendo realizar as procesos
enzimticos continuos.

Mtodos para la inmovilizacin de enzimas

a)Poradsorcinde la protena enzimtica por la superficie de una

matriz de soporte como silicagel, carbn, aluminio, vidrio poroso o
poliaminas. La unin es relativamente dbil, pudiendo destruirse
por cambios en el pH, la temperatura o la concentracin inica;
pero puede estabilizarse si la enzima ya adsorbida se somete a un
entramado con glutaraldehdo como lo es un soporte de resina a
base de fenol y formaldehdo luego entramada con aldehdo
glutrico.

b)Porenlace inicoen que la molcula de la enzima, cargada

electrostticamente es de carcter polianinico o policatinico.
Tambin aqu la unin es relativamente dbil, pues la carga de la
protena enzimtica es pequea en relacin a su masa; sin
embargo, puede intensificarse al asociarla a una adsorcin.

c)Por enlace covalente entre la enzima y el soporte insoluble a

travs de los diferentes grupos funcionales, capaces de
reaccionar, de las enzimas, como -COOH, -SH, y -OH. Los
portadores pueden ser sustanciasinorgnicas (aluminio, hierro)
uorgnicos (celulosa, almidn). Este enlace es bastante estable
y puede realizarse a veces en forma directa con el soporte,
despus de una eventual modificacin de grupos funcionales,
capaces de reaccionar con la enzima.

d)Porentramado transversal(cross-linking), una forma

especial de enlace covalente en que las molculas enzimticas
se enlazan entre si mediante reactivos biopolifuncionales,
como el dialdehdo glutrico, di-isotiocianato o cido
disulfnico. Su inconveniente es el difcil contacto del
substrato con la molcula enzimtica, situada en el interior
del polmero macromolecular resultante.

e)Porrecubrimientoen que las enzimas mismas no se

inmovilizan, sino que se limita su espacio de reaccin,
recubrindolas con una membrana polmera, natural o sinttica,
que sea semipermeable. Factores como dimetro de poro del
soporte de adsorcin y carga del soporte y del substrato son
parmetros que influyen, segn el procedimiento elegido, en la
cintica de las enzimas inmovilizadas.

Ventajas

La enzima as inmovilizada presenta las ventajas de un catalizador

slido y es separada fcilmente de la mezcla de reaccin.

Una de las posibilidades ms prometedoras en esta rea es la de

crear sistemas multienzimticos inmovilizados al unir ms de un
tipo de enzima en la matriz, como glucoamilasa y glucosaisomerasa para transformar almidn en fructosa.

Lalactasafngica para desdoblar la lactosa de leche y suero y la

glucosaisomerasapara la obtencin de fructosa, son buenos
ejemplos del empleo actual de enzimas inmovilizadas en tecnologa
de alimentos.

ENZIMAS MICROBIANAS Y SUS APLICACIONES

PROCEDIMIENTOS PARA PRODUCCION DE ENZIMAS

AMILASAS
1. ETAPA PRE FERMENTATIVA

a) Propagacin del inculo de Aspergillus nger:

Aislamiento y Seleccin

Aislar de muestras de suelo agrcola cepas de Aspergillus nger

productor de amilasas en agar almidn 1%

Seleccionar la cepa de Aspergillus nger mejor productora de

amilasas

Propagacin

Reactivar la cepa de Aspergillus nger productora de

amilasas y realizar una suspensin de esporas en 100 ml
de s.s.f. estril.

Estandarizar la suspensin de esporas (inculo) a una

concentracin de 108 esporas / ml. Realizar el recuento
de esporas en una cmara de Neubawer.

Inocular los 100 ml de la suspensin de esporas en el

biorreactor acondicionado para iniciar la fermentacin.

b) Preparacin del Medio de Fermentacin

Obtencin del almidn de yuca

Rayar la yuca y depositar el rayado en un recipiente

Licuar el rayado, colar el licuado y recibirlo en otro recipiente

Dejar sedimentar por un da y eliminar el sobrenadante.

Extender el sedimento en hojas de papel bond

Desecacin completa en horno y remover cada cierto tiempo para que

no se forme una masa.

Triturar los grnulos con mortero y piln hasta ser pulverizado.

El pulverizado constituye el almidn y almacenarlo en frasco estril.

Preparacin del caldo almidn

KH2P04

0.05 g

K2HP04

0.05 g

MgSO4.7H20

0.02 g

(NH4) 2S04

0.02 g

Almidn de yuca

1.00 g

Agua destilada

100 ml

pH = 5.5.

c) Diseo, Construccin y Esterilizacin del Biorreactor Columna de Burbujeo

Diseo y Construccin: segn configuracin y tamao:

Esterilizacin del biorreactor: con flujo de vapor de agua

a 100C durante 15 30 minutos.

2. ETAPA FERMENTATIVA O DE PRODUCCIN

a) Llenado del biorreactor: vaciar 900 ml del caldo de

fermentacin (caldo almidn) al biorreactor en condiciones
estriles

b) Inoculacin del biorreactor: adicionar 100 ml de inculo

(108 esporas/ml.) de Aspergillus nger productor de amilasas
equivalente al 10 % V/V del total de caldo de fermentacin.

c) Funcionamiento del sistema de aireacin y/o agitacin:

conectar la bomba compresora de aire al sistema de
purificacin de aire ( Sol. NaCl 20%)

d) Fermentacin: dejar en fermentacin aerbica por un

periodo de 3 das o ms, hasta consumo total del almidn
(valore con lugol)

3. ETAPA POST FERMENTATIVA

A)

Separacion de la biomasa fungita por filtracin

) Vaciar

el caldo de fermentacin hidrolizado en un matraz estril

para su posterior filtracin.

) Filtrar

con papel Wattman y separar la biomasa fngica del caldo de

fermentacin hidrolizado.

) Pesar

la biomasa obtenida.

B) Evaluacin de la produccin de amilasas por Aspergillus

niger.

El filtrado obtenido se valora con lugol y fehling segn como se

indica a continuacin:

C) Separacin de la glucosa por decantacin:

Dejar decantar en matraz estril. Visualizar un sedimento

blanco y dulce (glucosa.). Pese y determine la concentracin
de glucosa obtenida.