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Las enzimas son biocatalizadores pero tambin pueden considerarse como aditivos altamente especficos para aplicaciones en alimentos.
EL MICROORGANISMO
Seleccin del microorganismo adecuado para el desarrollo de un sistema de produccin de enzimas. 1. El microorganismo no debe ser patgeno, ni estar asociado con la produccin de toxinas.
Salmonella
Escherichia coli
Staphylococcus aureus
EL MICROORGANISMO
2.
EL MICROORGANISMO
3.
EL MICROORGANISMO
4.
EL MICROORGANISMO
5.
La seleccin del microorganismo puede hacerse igualmente en trminos de las caractersticas deseadas para la enzima.
MECANISMOS DE BIOSNTESIS
Para el control de sntesis de enzimas, las clulas microbianas disponen de los mecanismos de induccin y represin.
1.
Enzimas inducibles.
Requieren de una sustancia, generalmente el sustrato de la enzima, como inductor.
MECANISMOS DE BIOSNTESIS
ENZIMA
Sacarosa Dextranas Dipalmitato de isomaltosa Almidn Maltosa Naringina Maltosa Monopalmitato de sacarosa Xilosa
Pectinasa
Tirosinasa
Aspergillus niger
Neurospora crassa
Pectina
D-tirosina, L-tirosina
MECANISMOS DE BIOSNTESIS
2.
Mecanismos de represin.
Represin catablica. Inhibe la sntesis de enzimas (inducibles) por intermediarios producidos en el rpido catabolismo de la fuente de carbono.
Neurospora crassa Eschericchia coli Leuconostoc mesenteroides Tricodema viride Streptomyces phaechromogenes Bacillus subtilis Rhodotorula mucilaginosa Bacillus stearothermophilus
MECANISMOS DE BIOSNTESIS
3.
Mejoramiento gentico.
Una vez conocidos los mecanismos para la produccin de una enzima, se podr mejorar la productividad a travs de procesos de mutacin y seleccin o bien mediante el adecuado manejo del medio ambiente.
MECANISMOS DE BIOSNTESIS
Estrategias en la sobreproduccin de enzimas microbianas. ENZIMAS INDUCIBLES
Obtencin de mutantes con necesidades reducidas o nulas de inductor
Eliminacin de los productos finales (dilisis, ultrafiltracin) Obtencin de mutantes no sujetos a represin por productos finales.
MECANISMOS DE BIOSNTESIS
4.
Actividad enzimtica.
Cuando el producto de la fermentacin es una enzima, la produccin se cuantifica en trminos de la actividad cataltica
disponible.
ENZIMAS METODOLOGIA
Proteasas Capacidad para coagular la leche. Liberacin de algn aminocido especfico soluble en cido tricloroactico (tirosina) Accin sobre pelculas fotogrficas (cualitativas).
Prdida de la capacidad de formacin de complejos coloridos entre yodo y amilosa. Disminucin de la viscosidad inicial. Incremento del poder reductor. Capacidad de clarificar jugo de manzana. Disminucin de la viscosidad inicial. Incremento en el poder reductor. Disminucin del precipitado alcohlico del medio de reaccin. Disminucin de la viscosidad inicial. Incremento en el poder reductor. Solubilizacin de papel.
-amilasas
Pectinasas
Celulasas
En trminos generales las fermentaciones pueden llevarse a cabo de dos formas: en cultivo semislido o en cultivo sumergido.
1.
Ventajas.
Resulta en altas productividades por unidad de volumen de fermentacin. Menores consumos energticos. Baja contaminacin por aguas residuales.
CARACTERSTICAS GENERALES DE LOS PROCESOS DE FERMENTACIN PARA LA PRODUCCIN DE ENZIMAS MICROBIANAS. Desventajas: Difcil control en las condiciones ambientales que influyen en la produccin (gradientes y variaciones de pH,
temperatura, humedad, etc.)
Dificultades
para
la
esterilizacin,
ser
NOTA:
El salvado de trigo, es el sustrato mas utilizado por su alto contenido de nutrimentos, as como su estructura fsica.
CARACTERSTICAS GENERALES DE LOS PROCESOS DE FERMENTACIN PARA LA PRODUCCIN DE ENZIMAS MICROBIANAS. Algunos ejemplos de enzimas producidas por cultivos semislidos. ENZIMA MICROORGANISMO SUSTRATO
Amiloglucsidas -amilasa
Celulasas Proteasas Pectinasas
Rhizopus sp. Aspergillus oryzae Aspergillus niger Trichoderma viride Aspergillus niger Aspergillus oryzae Aspergillus soyae
El cultivo sumergido.
Los procesos de fermentacin en cultivo sumergido, son aquellos en los que nutrimento y microorganismo se encuentran en fase acuosa.
Ventajas:
es
posible
Temperatura y pH de fermentacin.
Generalmente, la T y pH de ptimo crecimiento del m.o. productor, coinciden con los de produccin de la enzima (sin
embargo, la T de mximo crecimiento puede no ser la adecuada dada la estabilidad de una cierta enzima).
1.
2. 3. 4.
En trminos de pH es necesario distinguir entre 4 valores, que no necesariamente coinciden: El pH de mximo crecimiento del microorganismo productor. El pH de mxima produccin de la enzima. El pH de mxima estabilidad de la enzima. El pH de mxima actividad de la enzima.
El medio de cultivo.
Necesidad de inductores, seleccin de la fuente de carbono tomando en cuenta los mecanismos de represin catablica, formulacin de un medio con importante poder amortiguador, etc. En el caso de algunas enzimas, se requiere de ciertos iones en el medio de fermentacin para una eficiente produccin. En algunos casos estos iones juegan un papel importante en la actividad (metaloenzimas) y en otros en la estabilidad.
ENZIMA
-amilasa
Celulasas Dextranasa Glucoamilasa Dextransacarasa Naringinasa Lactasa
FUENTE DE CARBONO
Almidn
Celulosa Dextrana Almidn Sacarosa Naringina Lactosa
MICROORGANISMO
Bacillus subtilis
Trichoderma viride Penicillium funiculosum Aspergillus niger Leuconostoc mesenteroides Aspergillus niger Kluyveromyces lactis
Levansacarasa
Glucosa oxidasa
Sacarosa
Glucosa
Bacillus subtilis
Aspergillus niger
Se prefieren como fuente de carbono los almidones y desde luego las protenas como fuente de nitrgeno.
Principales fuentes de nitrgeno empleadas en medios de cultivo para la produccin de enzimas microbianas.
Fuentes inorgnicas
Sulfato de Amonio Nitratos (potasio, calcio)
Pasta de algodn
Salvado de trigo Salvado de arroz Agua de cocimiento de maz Diversos hidrolizados Malta (cebada)
Peptonas
Hidrolizado de pescado Hidrolizado de carne
La adicin de agentes surfactantes, especficamente el Tween 80 o el Triton, aumenta la produccin de un gran nmero de enzimas extracelulares.
Efecto de la adicin de tensoactivos al medio de cultivo (Tween 80 al o.1%) en la produccin de enzimas microbianas.
Enzima Microorganismo
Relacin de produccin Medio + tensoactivo Medio solo
Thricoderma viride Pullularia pullulans Penicillium funiculosum Leuconostoc mesenteroides Aerobacter aerogenes
20 16 2 2 1.5
La aireacin.
1.
2.
3. 4.
Los procesos fermentativos pueden dividirse en trminos de requerimiento de oxgeno en: Aerobios Microaerobios Anaerobios Anaerobios estrictos El KLa (coeficiente de transferencia de masa en la fase liquida) es el criterio con que se caracteriza y se escala una fermentacin, debido a la baja solubilidad del O2 en el medio de fermentacin.
dP
dt
dX
dt
+ X
Donde se plantea que la velocidad de sntesis de producto es proporcional al crecimiento del microorganismo (primer trmino) y a la cantidad de clulas presentes en el medio (segundo trmino).
OPERACIONES DE RECUPERACIN
Dentro de las operaciones de recuperacin uno de los principales objetivos es eliminar agua al menor costo posible. El grado de purificacin depende del rea de aplicacin final del producto enzimtico: alimentos, farmacia, industria textil, industria curtidora, industria papelera, etc., y de la forma en que va a ser aplicado (por ejemplo, diagnstico, aditivo en alimentos, medicamento, catalizador en la industria, etc.).
OPERACIONES DE RECUPERACIN
1.
2.
3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.
Extraccin Ruptura celular Separacin de slidos Ultrafiltracin Precipitacin Extraccin lquido-lquido Cromatografa Estabilizacin, secado y formulacin Evaluacin del proceso de purificacin
OPERACIONES DE RECUPERACIN
1.
Extraccin.
En ciertos casos es posible extraer la enzima que se encuentra ligada a la pared celular o a alguna membrana, mediante:
lisozima, lipasas, fosfolipasas, proteasas, quitinasas o glucanasas pueden ser agregadas para degradar parcial o totalmente la pared celular.
OPERACIONES DE RECUPERACIN
2.
Ruptura celular.
Existen diversas tcnicas a nivel laboratorio pero solo 2 mtodos mecnicos son empleados a gran escala:
En ambos casos el fluido debe pasar varias veces por el equipo, dependiendo de la dureza de la clula, y de la ubicacin de la enzima (periplasmticas, citoplasmticas, etc.).
OPERACIONES DE RECUPERACIN
Ruptura celular La optimizacin para obtener la mxima extraccin, sin que la enzima pierda actividad por calentamiento y sin reducir demasiado el tamao de clulas (dificulta la separacin), consiste en :
I. II. III.
Determinar el nmero mnimo de pasos por el equipo, Determinar la mxima concentracin de alimentacin, y Determinar las condiciones de ruptura (tiempo de molido o presin).
OPERACIONES DE RECUPERACIN
3.
Separacin de slidos.
La eliminacin de clulas al final de la fermentacin, la eliminacin de residuos celulares despus de la ruptura y la recuperacin o eliminacin de precipitados se efecta por centrifugacin o por filtracin.
I.
El tamao de partcula, II. La diferencia de densidades entre las fases a separar III. La viscosidad del medio IV. La aglomeracin y caractersticas pegajosas del precipitado.
OPERACIONES DE RECUPERACIN
4.
Ultrafiltracin.
Separacin de molculas
peso molecular inferior a 200 Uso de membranas sujetas a presiones de hasta 2000 psi.
Tcnica
smosis inversa
Ultrafiltracin
peso molecular entre 400 y Uso de membranas y 50000. fibras porosas sujetas a presiones no mayores a 25 psi Micropartculas que van desde virus hasta levaduras
Microfiltracin
Filtracin tradicional
OPERACIONES DE RECUPERACIN
Ultrafiltracin. Se basa en el diseo de membranas o fibras con una estructura de poros pequeos (50 a 500nm) por lo que molculas pequeas podrn atravesar, mientras que las grandes sern retenidas. El sistema permite: Concentrar al eliminar agua, Dializar (las sales atraviesan las membranas
continua o intermitentemente el agua filtrada)
y es posible sustituir
Purificar parcialmente
(las protenas de peso molecular inferior al peso molecular de corte del sistema tambin sern eliminadas).
OPERACIONES DE RECUPERACIN
Ultrafiltracin.
Ventajas: I. No cambia la fase de la enzima, II. Puede operarse a bajas temperaturas, III. No se agregan sustancias ajenas al sistema, IV. Tiene bajos requerimientos energticos, V. Es fcilmente operada. Desventajas: I. Mantenimiento y cuidado de las fibras o membranas.
OPERACIONES DE RECUPERACIN
5.
Precipitacin.
Los mtodos para precipitar enzimas consisten en causar una reduccin de la solubilidad, y son:
I. II.
III.
OPERACIONES DE RECUPERACIN
6.
Extraccin lquido-lquido.
La formacin de dos fases lquidas puede ser inducida en funcin de la incompatibilidad de dos polmeros, que termodinmicamente no son estables disueltos en una misma fase. La enzima migra a una de las fases logrndose una concentracin-purificacin. Los polmeros usados son: polietilenglicol y dextranas o fosfatos.
OPERACIONES DE RECUPERACIN
7.
Cromatografa.
Es la tcnica ms potente de que se dispone para purificar enzimas y protenas en general. Clasificacin de los mtodos de acuerdo a la caracterstica de la enzima.
Tcnica
Cromatografa de intercambio inico HPLC Cromatografa de permeacin en gel Cromatografa de adsorcin Cromatografa hidrofbica Cromatografa de apareamiento de iones Cromatografa de intercambio de ligandos Cromatografa de afinidad
Caract. bioqumicas
OPERACIONES DE RECUPERACIN
9.
OPERACIONES DE RECUPERACIN
Generalmente las preparaciones lquidas contienen: I. Agentes estabilizantes (glicerol, sorbitol, polietilenglicol, etc.) II. Agentes de preservacin (benzoatos, sorbatos, etc.)
El material inerte consiste de: I. Azcar (glucosa, lactosa, etc.) II. Slidos de almidn (adicionados antes del secado tienen un efecto protector sobre la enzima), III. Sal (preparaciones de papana para ablandamiento de carnes) IV. Talco
OPERACIONES DE RECUPERACIN
I.
Y=
OPERACIONES DE RECUPERACIN
I.
Ae =
P
=
mg de protena
P = Protena
Ae = Actividad especfica
OPERACIONES DE RECUPERACIN
III.
III.
Amilasas
Microorganismo
bacterias del gnero Bacillus
Amilasa
-amilasa.
Usos o actividad
licuefaccin o sacarificacin Son metaloenzimas que requieren calcio.
-amilasa. Amiloglucosidasa .
Produccin de maltosa a partir de almidn Produccin de glucosa a partir del extremo no reductor de amilosa y amilopectina Hidrolizan pululano
Pululanasa.
Cepas Aerobacteraerogenes
Proteasas.
Tipos: Endoproteasas y exopeptidasas.
Glucosa isomerasa.
Microorganismos:
Bacillus coagulans, Streptomyces phaechromogenes, S. olivaceus, S. olivochomogenes, S. wedmerensis, S. albus, Arthobacter, Actinoplants misseuriensis.
Celulasas y -glucanasas.
Tipos: Endoglucanasas, celobiohidrolasas y -glucosidasa o
celobiasa.
Microorganismos:
Thricoderma reesei, Chaetomium thermophile, Sporotrichum thermophilicum (alta temperatura de operacin), A. awamori, A. niger, A. phoemicis (alta actividad -glucosidasa).
Pectinasas.
Se denomina a un complejo de enzimas que se clasifican de acuerdo con el sustrato (pectina o cido pctico), del tipo de reaccin (hidrlisis o transeliminacin) y del mecanismo (endo, exo), incluyndose adems a la pectinesterasa.
Lipasas.
Se reprime en presencia de mono y disacridos en el medio as como glicerol.
La produccin se incrementa al adicionar al medio lpidos (aceite de oliva, aceite de almidn) cidos grasos (oleico) o lecitina.
Microorganismos:
Mucor mihei, A. niger, Geotricum candidum, Candida cilindraceae, Pseudomons sp., Rhizopus oryzae y R. niveus.
Dextranasa.
Microorganismos: Penicillium funicilosum, P. lilaceum y
Chaetonium gracilae.
Inductor: Dextranas.
Invertasa.
-fructofuranosidasas o -glucosidasas.
Lactasa.
Tambin conocida como -galactosidasa, hidroliza la lactosa en glucosa y galactosa. Microorganismos: Hongos y levaduras. A. oryzae y A. niger,
kluyveromyces lactis, K. fragilis y Cndida pseudotropicallis. Hongos. Producen enzimas extracelulares, con alta estabilidad trmica y pH de actividad (2.5-4.5), se utilizan sustratos como maltosa o salvado. Levaduras. Producen enzimas Intracelulares, con baja estabilidad trmica, pH de actividad (6.0-7.0), se utiliza como inductor la lactosa.
Glucosa oxidasa.
Microorganismos: A. niger, Penicillium amagaskiense, P.
vitae.