PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATLICA DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS BIOLOGIA DE LOS MICROORGANISMOS

INFORME 2 GENETICA BACTERIANA Y ANALISIS DE LEVADURAS Y HONGOS FILAMENTOSOS

Nombre:

Angelo Calvo Alfaro

PROFESORA: Dra. Susan Bueno INSTRUCTORA: BQ. Natacha Marini FECHA DE ENTREGA: 5/11/2011

Introduccin Dentro de la naturaleza existen mltiples entidades biolgicas a los cuales llamados virus. Estos tienen la capacidad de invadir clulas y modificar sus mecanismos metablicos a fin de dirigir la maquinaria dentro de esta y provocar la replicacin de estas entidades, lo cual en la mayora de los casos termina con la lisis celular. As, existen mltiples virus que tiene especificidad sobre bacterias, y solo son capaces de afectar a estas. Son a estos a los que llamamos bacterifagos y tienen mltiples aplicaciones a nivel de gentica para la transformacin de microorganismos y obtencin de resultados con aplicaciones biomdicas e industriales (Douglas, 1978). Si bien los bacterifagos tiene un alto impacto a nivel mdico debido a que tiene la capacidad de transducir genes en bacterias de de inters patolgico, lo cual transforma sus mecanismos de patogenicidad y puede provocar enfermedades de una gravedad mayor; Tambin estos son altamente cotizados por su capacidad de provocar un efecto antibitico especifico en bacterias a travs de la lisis de estas en lo que se denomina, ciclo ltico. Esta capacidad se ha vuelto una caracterstica altamente cotizada en nuestros tiempos donde los microorganismos adquieren resistencias constantes a todos los antibiticos farmacolgicos conocidos. (Shors, 2009). Adems de los virus lticos existen variados mecanismos y mtodos utilizados actualmente en biologa molecular para la modificacin gentica bacteriana entre los que podemos mencionar la conjugacin de plsmidos, la transduccin generalizada, mutaciones por fagos lisognicos y las mutaciones por genes transposones entre otras. Estas herramientas son frecuentemente utilizadas en ingeniera gentica con el fin de obtener mutantes con fines biomdicos e industriales en la generacin de productos alimenticios y farmacolgicos. (Luque, 2006) Tambin dentro de los microorganismos de inters para el ser humano se encuentran los hongos, los cuales han estado junto al desarrollo del hombre desde el principio de los tiempos. Ya desde temprana edad la humanidad los utilizaba para elaborar cerveza y fabricar pan. Es por esto que los hongos tienen un elevado impacto en nuestra sociedad ya que gracias a estos se forman variados productos de inters industrial y biomdicos a travs de la modificacin transductiva de estos para la formacin de productos alimenticios y farmacolgicos. Ejemplos de estos lo constituyen Aspergillus niger y Saccharomyce cerevisiae que generan acido ctrico y cerveza respectivamente. (Herrera, 2008)

As tambin, existen hongos patgenos para seres humanos para los cuales existen mtodos para su correcta identificacin y caracterizacin que permiten acelerar el proceso de tratamiento y de recuperacin en paciente afectados por estas patologas. Esto es de especial inters en pacientes inmunodeprimidos debido a la capacidad oportunista que tienen los hongos en sus mecanismos de patogenicidad, los cuales si no son tratados a tiempo pueden provocar enfermedades muy graves y con serias complicaciones como lo es el caso de la Meningitis Cryptococa, provocada por el hongo Cryptococcus Neoformant. Algunos ejemplos de hongos patgenos los representan Mucoral, Cryptococcus y Aspergillus. Por lo expuesto anteriormente es que el presente trabajo tiene por finalidad instruir al alumno en diferentes tcnicas y herramientas para la manipulacin en gentica bacteriana, as como mecanismos de identificacin y caracterizacin de levaduras y hongos filamentosos utilizados frecuentemente en el laboratorio para dicha funcin.

Objetivos 1- Gentica Bacteriana Reconocer y caracterizar fagos lticos y temperados, as como alteraciones en una bacteria producidas por la lisognia de un fago. Obtener fagos desde muestras ambientales. Evaluar la especificidad de hospedero de distintos fagos Transducir plsmidos y mutaciones cromosomales y movilizar plsmidos por conjugacin. Generar mutaciones usando un fago transposon 2- Levaduras y Hongos Filamentosos Conocer y caracterizar la morfologa microscpica y macroscpica de las colonias de hongos unicelulares (levaduras) y pluricelulares (filamentosos)

Materiales y mtodos

1. Materiales Generales a. Placas petri con Agar blando con placas de lisis de los fagos H5 y P22 b. Placas verdes y de medio Agar Luria c. Cultivos estacionarios de las bacterias Escherichia Coli, Salmonella Typhimurium y Klebsiella pneumoniae d. Muestra de ambiental de agua e. Cloroformo f. Tubos de Agar blando licuado g. Pipetas Pasteur, rastrillo, micropipetas, azas, mechero, microscopio h. Caldo LB i. Cepas de S.Typhi resistente a Ampicilina y E.colli resistente a Kanamicina j. Agar Corriente enriquecido con antibiticos ampicilina (100mg/ml) y kanamicina (50mg/ml) k. Agar McConkey enriquecido con kanamicina (50mg/ml) l. Fago tramposon p22 (Resistente Kanamicina) mudJ (gen transpson betagalactosidasa) + mudI (transposasa) m. Lisado L3: Fago transductor p22 + PKKGFP (Resistencia Ampicilina y fluorescencia) n. Tincin gram, Tinta china, Azul de lactofenol o. Cultivos de levaduras Cryptococus neoformant, Candida glabrata y Rhodotorula p. Cultivo de hongos filamentosos Mucoral, Penicillum y Aspergillus

2. Mtodos I. Reconocer y caracterizar fagos lticos y temperados a. Se realiz el mtodo de reconocimiento y caracterizacin presentado en la gua de trabajos prcticos. Reconocer en una bacteria las alteraciones producidas por la lisognia de un fago a. Se realiz el mtodo presentado en la gua de trabajos prcticos.

II.

III.

Obtener fagos desde muestras ambientales a. Se realiz el mtodo presentado en la gua de trabajos prcticos. Evaluar la especificidad de hospedero a. Se realiz el mtodo de evaluacin presentado en la gua de trabajos prcticos. Movilizacin de plsmidos por conjugacin a. Se mezcl 20 l de Salmonella (Resistencia a Ampicilina) 20 l de E. Coli (Resistencia a kanamicina) y 50 l de LB. b. Se sembr en Agar Corriente enriquecido con antibiticos ampicilina y kanamicina, se incubo durante 30 min. a 37C. c. Con un mondadientes, se efectu una aislacin en el resto de la placa. d. Se realizaron los siguientes controles: Siembra de E.Coli y Salmonella en Agar Corriente enriquecido con antibiticos ampicilina y kanamicina Transduccin de plsmidos y de mutaciones cromosomales a. Se mezclo 20 l de Salmonella, 20 l de L3 y 50 l de LB. b. Luego de 10 min. se sembr en agar Corriente con rastrillo. c. Se realizaron los siguientes controles: Siembra de Salmonella y L3 en agar corriente enriquecido con kanamicina. Mutagnesis usando un fago transposn a. Se mezclo 20 l de Salmonella T, 20 l de lisado P22, 50 l de LB. b. Se incubo una hora, a 37 C. c. Se sembr en Agar Mc. Conkey. d. Se realizaron los siguientes controles: Siembra de Salmonella y lisado P22 en agar Mc.Conkey. Observacin y descripcin de cultivos de levadura a. Se realiz el mtodo de observacin y descripcin en la gua de trabajos prcticos. Observacin y descripcin de cultivos de hongos filamentosos a. Se realiz el mtodo de observacin y descripcin en la gua de trabajos prcticos.

IV.

V.

VI.

VII.

VIII.

IX.

1- Resultados Gentica bacteriana Los resultados expuestos a continuacin corresponden a experimentos efectuados con el objetivo de comprender y corroborar de forma prctica los mecanismos involucrados en los aspectos de la gentica bacteriana que van desde infecciones virales con respectivos ciclos lticos y lisognicos, as como la conjugacin, integracin y transduccin de genes en microorganismos. Estos mecanismos son de alto inters cientfico debido a la amplia gama de posibilidades que nos entregan estas herramientas en el estudio de microorganismos y que van desde la formacin de antibiticos virales especficos hasta su transformacin gentica, para una posterior aplicacin industrial o biomdica (Forbes, 2007).

Tabla 1. Reconocimiento de fagos lticos y temperados Placa Tamao p22 Medianas y variado tamao H5 Medianas y variado tamao Tabla 2. Resultados lisognia del fago p22 Transparencia Elevada en placa de lisis Elevada en placa de lisis

Procedencia Placa de lisis p22 Placa con fago p22 (Sin placa) Tabla 3. Resultados lisogenia del fago H5

Resultado en placa verde Se observa una mezcla de bacterias claras y oscuras, sin placa de lisis, cambios leves en color. La placa verde se ve uniforme, sin placa de lisis, ni cambios en el color

Procedencia Placa de lisis H5 Placa con fago H5

Resultado en placa verde La placa se ve verde, no hubo crecimiento y tampoco placa de lisis, ni cambios en el color La placa se ve verde, no hubo crecimiento y tampoco placa de lisis, ni cambios en el color

Tabla 1 - 3. En las tablas presentadas anteriormente se exponen los resultados obtenidos para la caracterizacin ltica de los fagos p22 y H5, as como los resultados de sus correspondientes experimentos de lisognia, expuestos a una semana de cultivo. Se advierte que probablemente los resultados de la lisognia del fago p22 estn al revs, por mala rotulacin debido al crecimiento anormal de las bacterias y color de la placa.

Tabla 3. Resultados fagos de muestra ambiental Resultados generales Se observan 10 colonias bacterianas, sin placa de lisis Colonias bacterianas Tipo Color Forma Tipo 1 Naranjas Puntiforme Tipo 2 Blancas Puntiforme

Altura Convexa Elevada

Tabla 4. Especificidad de hospedero fago p22 Bacteria Escheriachia coli Antes de cruce con fago Despus de cruce con fago Observaciones Crecimiento (+) Crecimiento (+) En ambos lados el crecimiento es igual No se logra apreciar si hay lisis Salmonella typhimurium Crecimiento (+) Crecimiento (+) En ambos lados el crecimiento es igual No se logra apreciar si hay lisis Klebsiella pneumoniae Crecimiento (+) Crecimiento (+) En ambos lados el crecimiento es igual No se logra apreciar si hay lisis

Tabla 5. Especificidad de hospedero fago H5 Bacteria Escheriachia coli Antes de cruce con fago Crecimiento (+) Despus de cruce con fago Crecimiento (+) Crecimiento (+) Crecimiento (+) Observaciones En ambos lados el crecimiento es igual No se logra apreciar si hay lisis En ambos lados el crecimiento es igual No se logra apreciar si hay lisis En ambos lados el crecimiento es igual No se logra apreciar si hay lisis

Salmonella typhimurium Crecimiento (+) Klebsiella pneumoniae Crecimiento (+)

Tabla 3 - 5. En las tablas anteriormente expuestas se aprecian los resultados para la muestra ambiental de fagos extradas de la laguna de cisnes del parque bicentenario, as como los resultados de especificidad del hospedero de los fagos p22 y H5. En las muestras ambientales se observa crecimiento bacteriano de 2 tipos distintos, pero no se logra apreciar placas de lisis en el cultivo, lo que indica la ausencia de un fago de tipo ltico, no se descarta la presencia de un fago lisognico debido a las caractersticas distintas de las bacterias cultivadas. En los experimentos de especificidad no se logran apreciar resultados relevantes debido al alto tiempo de espera entre la realizacin del experimento y la obtencin de resultados, ya que crecieron bacterias de forma tumultosa en ambos lados de la placa, ya sea antes como despus de la exposicin del fago, en ambos casos.

Tabla 6. Movilizacin de plsmidos por conjugacin Placa Control 1. Salmonella (Resistencia Ampicilina) Control 2. E.coli (Resistencia Kanamicina) Salmonella + E.coli (Supuesta conjugacion) Agar Crecimiento LB (Ampicilina + Kanamicina) (-) LB (Ampicilina + Kanamicina) (-) LB (Ampicilina + Kanamicina) (-)

Tabla 7. Mutagnesis por transposon Placa Control 1. Salmonella (Resistencia Kanamicina) Control 2. Lisado fago p22 Salmonella + lisado fago p22 Agar McConkey (Kanamicina) McConkey (Kanamicina) McConkey (Kanamicina) Crecimiento (+) Colonias rosadas (+) Colonias rosadas (+) Colonias rosadas

Tabla 8. Transduccin de plsmidos y mutaciones cromosomales Placa Control 1. Salmonella (Resistencia Kanamicina) Control 2. L3 Salmonella + L3 Agar Crecimiento Luminiscencia Corriente (Kanamicina) (+) Normal Corriente (Kanamicina) (+) Normal Corriente (Kanamicina) (+) Normal

Tabla 5 - 8. En los resultados expuestos anteriormente se aprecian los resultados para la movilizacin de plsmidos, mutaciones por transposon, as como la transduccin de plsmidos y mutaciones. Notamos que en la conjugacin de plsmidos no se logro efectuar la conjugacin o no exista la presencia del gen debido a la ausencia de crecimiento en el Agar Corriente enriquecido con Ampicilina y Kanamicina. En los resultados para la mutagnesis por transposon se logra apreciar resultados evidentes debido a que se dieron los mismos resultados tanto para los controles efectuados como para la placa que debi haber expresado la presencia del gen transposon. Finalmente en los resultados de transduccin del gen PkkGFP en cepas de Salmonella notamos que no existe cambio en la luminiscencia como producto de su exposicin al transluminador, con respecto a las muestras control, por lo cual se infiere que la transduccin del gen PkkGFP que otorga luminiscencia a travs del fago p22 no tuvo efecto.

2- Resultados de Levaduras y Hongos Filamentosos Los resultados que sern expuestos a continuacin corresponden a experimentos efectuados con el fin de caracterizar tanto a nivel microscpico como macroscpico distintas levaduras y hongos filamentosos, a modo de conocer los mtodos utilizados para su identificacin y descripcin. Estos microorganismos son de un alto impacto debido a la capacidad de estos de formar productos de inters industrial, como lo es el caso de Aspergillus niger, el cual es utilizado para la formacin de acido ctrico y Saccharomyce cerevisiae que es utilizado industrialmente en la elaboracin de cerveza (Tefilo Herrera, 1990). Tambin son de inters medico los mtodos de identificacin en especies patgenas como Mucoral y Cryptococus Neoformant debido a su capacidad de infectar pacientes inmunodeprimidos, para otorgar de una forma un tratamiento temprano para estas patologas. (Murray, 2009)
Tabla 9. Observacin y descripcin de cultivos de levadura Levadura Cryptococcus Neoformant Candida Glabrata Rhodotorula Forma Color Superficie Elevacin Circular Blanco crema Lisa Elevada Circular Amarilla Lisa Convexa Circular Salmon Oscuro Lisa Convexa Borde Liso Liso Liso Brillo Sin brillo Sin brillo Brillante

Tabla 10. Tincin Gram levaduras Levadura Cryptococcus Neoformant Rhodotorula Candida Glabrata Forma Circular Ovalada Circular Color Morado oscuro Morado oscuro Morado oscuro Agregacin Racimo Racimo Racimo

Tabla 11. Examen al fresco y Capsula Levadura Forma Cryptococcus Neoformant Circular Rhodotorula Ovalada, tamao Crytococcus Candida Glabrata Mas ovalada y chica Color Agregacin Azul Independientes Celeste Independientes Morado oscuro Independientes Capsula Si, color blanca -----

Tabla 9 -11. Los resultados expuestos presentan los resultados para la caracterizacin macroscpica de levaduras y los correspondientes resultados para la tincin de gram y al fresco de los mismos microorganismos. Se describen las caractersticas observadas tanto macroscpicas al ojo humano, como las microscpicas observadas en el microscopio ptico a un aumento de 40x.

Tabla 12. Descripcin macroscpica hongos filamentosos Hongo Mucoral Penicillum Aspergillus Superficie Algodonosa Elevada y Terciopelada Polvorienta Color fondo Gris Verde azulada Negro Color superficie Gris oscuro Blanco Negro Reverso Liso Amarillo rugoso Estras

Tabla 13. Examen al fresco Hongos Filamentosos Hongo Mucoral Penicillum Aspergillus Observaciones Se observa un esporangioforo y endosporas libres Ovalo alargado, Se aprecia conidiforo y conidios libres Se logra apreciar conidiforo y conidios libres

Tabla 12 13. En las tablas expuestas anteriormente se aprecian los resultados de la caracterizacin macroscpica y microscpica para los hongos filamentosos utilizados durante el prctico, observadas al microscopio ptico a un aumento de 40x. Tambin se muestran los resultados de la tincin al fresco efectuada en los mismos.

Discusiones 1- En los resultados obtenidos para la caracterizacin y reconocimiento de fagos lticos y temperados, notamos que tanto el fago p22 como el H5 muestran resultados similares de tamao y transparencia mostrando ambos en general un comportamiento ltico. Si bien segn literatura el fago p22 es temperado (Interciencia, 1989) y debiera presentar un comportamiento dual entre la va ltica y lisognica en las muestras observadas. Es posible debido a las condiciones en que se encontraba el cultivo que hayan forzado a seguir exclusivamente la va ltica. Adems notamos segn imgenes de referencia que el tamao de las placas de lisis del fago p22 son pequeas y circulares (BioOne), pero la razn de esta caracterstica macroscpica puede deberse al tiempo al que fueron expuestas las muestras que hizo que los virus afectaran por ms tiempo las cepa de Salmonella o como mencionamos anteriormente, factores que forzaron la expresin nica del ciclo ltico. Respecto al fago H5 se aprecia que sigui el ciclo ltico y si bien podramos inferir que se comporta como uno en la realidad, es difcil hacer afirmaciones certeras al respecto debido a la poca informacin de referencia respecto este fago. A pesar de esto notamos que el bacterifago H5 es una derivacin del fago p22 que tiene mutado el gen c2, lo cual produce que las placas de lisis tengan una transparencia ms clara (Tesis doctorales en red, 2011), lo cual concuerda con los resultados y demuestra al menos la presencia de dicho fago. 2- Con respecto a la lisognia de los fagos p22 y H5 notamos que en el caso del fago p22 los resultados estn claramente invertidos lo que demuestra una mala rotulacin de las muestras. Notamos que existen leves cambios en el color de la placa verde por lo que demostrara la presencia de lisognia, pero aun as estos resultados estn difusos. A pesar de esto probablemente las muestras estn contaminadas debido a la presencia de dos cepas con caractersticas distintas presentes en el cultivo con placa de lisis. La razn de que los resultados sean difusos puede deberse al tiempo durante el cual estuvieron expuestas las muestras, el cual supero las dos semanas, lo cual puede haber provocado comportamientos anormales. Ahora bien, la contaminacin puede deberse a la aplicacin errnea de los procedimientos durante la siembra, por lo que lo reducimos a netamente un error humano. En la lisognia del fago H5 no se observa cambios en el color en la placa verde, por lo que demuestra la ausencia de lisognia en este, lo cual tendra sentido debido a la mutacin del gen c2 (Tesis doctorales en red, 2011), involucrada en este que probablemente lo empuja hacia la va ltica. Dentro de esto, es extrao que no se aprecien placas de lisis en el fago H5 y esto probablemente podra atribuirse a las caractersticas propias de la placa verde.

3- Con respecto a las muestras ambientales notamos la no existencia de placas de lisis en los cultivos con fagos ambientales, probablemente demostrara la inexistencia de fagos en la muestra ambiental o la inespecificidad de estos para las bacterias en cultivo. Ahora bien como posibilidad se plantea una mala ejecucin del mtodo de extraccin de los fagos en cloroformo lo que llevara a resultados errneos y probablemente contaminados. Esta hiptesis se refuerza debido a la existencia de 2 tipos de cepas involucradas. Sin embargo podra darse la posibilidad de transduccin de genes por parte de los fagos ambientales en los microorganismos en cultivo, que podra gatillar la expresin de patrones distintos y genere estas diferencias entre los dos tipos existentes. 4- Con respecto a los resultados de especificidad de los bacterifagos p22 y H5 notamos que no existe diferencia en las placas, ya sea antes como despus del fago y el crecimiento bacteriano se encuentra muy desarrollado, lo cual nos impide obtener conclusiones al respecto. El factor involucrado para que los resultados obtenidos hayan no generen conclusiones es el tiempo entre la preparacin de las muestras y el anlisis de los resultados, lo que puede haber provocado si bien un experimento exitoso, un sobre crecimiento bacteriano que imposibilito la observacin cualitativa de la especificidad del hospedero y la presencia de profagos en ambos casos. 5- En los experimentos de conjugacin entre S.typhi y E.coli notamos la inexistencia de conjugacin de plsmidos entre estas cepas debido al no crecimiento de estas en el Agar selectivo enriquecido con los antibiticos Ampicilina y Kanamicina que debieron haber sido provedos por los plsmidos conjugados. Las causas de esto puede deberse a la ausencia del gen de resistencia a Ampicilina en E.coli o de Resistencia a Kanamicina en S.typhi, lo que puedo haber provocado que no existieran plsmidos para conjugacin, debido a que las bacterias los eliminan si no existe una presin selectiva sobre estas (Gerard J. Tortora, 2007). Esto hubiera provocado que ninguna muestra creciera, lo cual es reforzado por los resultados obtenidos. Por esto a modo de comprobacin hubiera planteado la posibilidad de efectuar un cultivo de cada cepa en su respectivo antibitico al cual tiene resistencia para corroborar la presencia del plsmidos en estas. 6- Con respecto a la mutagnesis por transposon notamos que en todas las muestras se observa el mismo resultado, por lo cual no podemos obtener conclusiones a partir de estos. La presencia uniforme de cepas rosadas en medios selectivos nos indica dos posibilidades. La primera es una contaminacin de microorganismos en las muestras de origen, lo que puede haber ocasionado que todo el experimento tenga resultados

iguales. Otra posibilidad radica en que todas las muestras utilizadas ya posean el gen de metabolismo de lactosa y resistencia a Kanamicina, lo que significara como consecuencia el crecimiento demostrado en los resultados. 7- En el experimento realizado para transducir el gen de luminiscencia PkkGFP en salmonella, notamos que no existi la transduccin de dicho gen debido a la ausencia de luminiscencia anormal, durante la exposicin al transluminador. La razn involucrada puede deberse a que se intento transducir dos caractersticas Fluorescencia y resistencia a Ampicilina. Segn literatura existe la imposibilidad por parte de los fagos p22 de transducir 2 genes (Bachmann, 1979), por solo les es posible transducir una caracterstica en Salmonella, quienes frente al medio selectivo de Ampicilina y el tiempo de exposicin que ascendi a dos semanas, solo pudieron sobrevivir aquellas resistentes a ampicilina, y no aquellas que transdujeron el gen de fluorescencia 8- Los resultados obtenidos para las caracterizaciones macroscpicas y microscpicas de las levaduras y hongos filamentosos concuerdan con lo presentado en el manual de prcticas de laboratorio (Susan Bueno, SEGUNDO SEMESTRE 2010). Los resultados obtenidos nos permiten afirmar que los hongos utilizados durante la prctica corresponden a lo que se pretenda. En las caracterizaciones de hongos filamentosos, si bien en algunas ocasiones fue difcil la identificacin de las estructuras, a travs de repetir los mtodos, se observaban las caractersticas descritas en el manual.

Conclusiones 1- Se conocen mtodos utilizados en gentica bacteriana, los cuales son fundamentales para la caracterizacin de bacterifagos lticos y lisognicos, aislamiento de esto, as como para la conjugacin y expresin de plsmidos entre bacterias y la transduccin de genes y mutaciones a travs de virus como el fago p22, las cuales son herramientas fundamentales en aplicaciones biotecnolgicas a nivel industrial y biomdico. 2- Se comprende el uso de herramientas de laboratorio como las placas verdes y reactivos como el cloroformo en la separacin y caracterizacin de bacterifagos, sobre las cuales es necesaria una correcta compresin de uso a fin de obtener resultados acorde con lo esperado en los experimentos de laboratorio. 3- Existen multitudes de variados fagos presentes en la biota ambiental, lo cual tiene capacidades especficas sobre ciertos tipos de bacterias. 4- Se conocen mtodos de identificacin y caracterizacin de levaduras y hongos filamentosos, los cuales son importantes a nivel medico para la identificacin de patologas en las cuales participan hongos, as como a nivel industrial donde hongos como Aspergillus niger y Saccharomyce cerevisiae tiene una gran importancia debido a los productos que estos generan, los cuales son beneficiosos para el ser humano.

Bibliografa

Bachmann, K. (1979). Biologa para mdicos: conceptos bsicos para las facultades de medicina. Reverte. BioOne, E. R. (s.f.). BioOne Research Evolved. Recuperado el 5 de 12 de 2011, de http://www.bioone.org/na101/home/literatum/publisher/bioone/journals/content/avdi/2005/00 052086-49.1/7286-100404r/production/images/small/i0005-2086-49-1-118-f01.gif Douglas, J. (1978). Bacterifagos. Champman & Hall LTDA. Forbes, S. W. (2007). Diagnostico Microbiologico. Editorial medica panamericana. Gerard J. Tortora, B. R. (2007). Introduccin a la microbiologa. Editorial medica panamerica. Herrera, J. R. (2008). Viaje al Asombroso Mundo de los Hongos. Ciencia para todos. Interciencia, A. (1989). Interciencia (Vol. 14). Interciencia. Luque, J. L. (2006). Biologa molecular e ingeniera gentica: conceptos, tcnicas y aplicaciones en ciencias de la salud. Elsevier. (2009). Microbiologa mdica. En P. Murray. Elsevier Mosby. Shors, T. (2009). Virus: Estudio Molecular Con Orientacion Clinica. Editorial medica Panamericana. Susan Bueno, L. L. (SEGUNDO SEMESTRE 2010). GUA DE TRABAJOS PRCTICOS, BIOLOGIA DE LOS MICROORGANISMOS (BIO151E). Tefilo Herrera, M. U. (1990). El reino de los hongos: micologa bsica y aplicada. Universidad Nacional Autnoma de Mxico. Tesis doctorales en red. (2011). Tesis doctorales en red. Recuperado el 5 de 11 de 2011, de Materiales y metodos: http://tdx.cat/bitstream/handle/10803/2397/02.RCB_MATERIAL_METODOS.pdf?sequence=3