PREPARACIÓN DE EXTENDIDOS

Pedro Fernando Rodríguez Calero (1842520)

pedro.calero@correounivalle.edu.co
María Isabel Perlaza Franco (1842505)
perlaza.maria@correounivalle.edu.co
Angie Natalia Pineda Osorio (1925556)
angie.pineda@correounivalle.edu.co
Andrea Velasco Ríos (2041132)
andrea.velasco@correounivalle.edu.co

Laboratorio De Microbiología (745059M-01)

Ramírez Toro Cristina

Universidad del Valle

Escuela de Ingeniería de Alimentos
Cali
2021
 2

Tabla Contenido

1. RESUMEN 3

2. INTRODUCCIÓN 4

3. MATERIALES Y MÉTODOS 6

4. RESULTADOS 7

5. DISCUSIÓN 10

6. CONCLUSIONES 13

7. ANEXOS 14

8. BIBLIOGRAFÍA 16
 3

1. RESUMEN

La utilización de los colorantes en la microbiología es fundamental para la identificación

de los microorganismos mediante la determinación de su morfología. Así pues, en el

laboratorio se emplearon diferentes métodos de coloración de Gram para apreciar en cada

bacteria su reacción frente a las tinciones. Lo anterior se llevó a cabo mediante materiales

como; cristal violeta, lugol de Gram, alcohol acetona e instrumentos como el mechero y

el asa de siembra. La coloración de Gram se hizo sobre bacterias conocidas como

Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus y Pseudomona aeruginosa. Así

pues, el objetivo principal de esta práctica de laboratorio consistió en la identificación de

las técnicas de coloración más comunes para la observación de la morfología y las

estructuras bacterianas, previo a ello se estudió la preparación del extendido y finalmente

se describieron algunas características bacterianas que se pueden observar mediante la

coloración diferencial, conocida como Coloración de Gram. Como resultado se obtuvo

que el método de la tinción de Gram es efectivo para una clasificación bacteriana (Gram

positivas, Gram negativas), y su diferencia radica en la composición química que tenga

la pared celular. Además, es un método favorable siempre que se tenga los

microorganismos bajo condiciones óptimas; esto principalmente por la sencillez y

economía que maneja.

Palabras clave: Coloración de Gram, Gram positivas, Gram negativas, bacterias,

morfología.
 4

2. INTRODUCCIÓN

Los microorganismos son sistemas biológicos que presentan diversas y complejas

estructuras que pueden emplearse para una clasificación morfológica, es decir, mediante

el uso de las características físicas se puede realizar un estudio taxonómico (Kaur, 2009).

Estos estudios de reconocimiento se efectúan mediante el uso de técnicas como la tinción

o coloración, esta se refiere es al uso de colorantes acuosos que contrastan favorablemente

alguna muestra que contenga algún sistema biológico al intentar observarse en un

microscopio (Rodríguez et al., 2015). Así pues, se han desarrollado técnicas tintoriales

que destacan las características morfológicas de los microorganismos. Existe una gran

variedad de tinciones que pueden ser aplicadas dentro del campo de la microbiología. Un

colorante se define como una sustancia capaz de dar color a células, tejidos, fibras,

etcétera. De acuerdo con su origen, se pueden dividir en: colorantes naturales, los cuales

son extraídos de plantas o animales, y colorantes artificiales, que son aquellos de

minerales procesados y manipulados en el laboratorio. Químicamente, el colorante está

constituido de un componente cromóforo y un auxocromo. El cromóforo es todo grupo

aislado, covalente e insaturado, que tiene una absorción característica en la región

ultravioleta o visible; dicho de otra forma, es la capacidad que tiene la molécula para que

sus electrones absorben energía o luz visible, se excitan y emiten diversos colores de

acuerdo con la longitud de emitida como resultado del cambio en el nivel energético

(Madison, 2001). Las tinciones en microbiología son las primeras herramientas que se

utilizan en el laboratorio para el diagnóstico de las enfermedades infecciosas. Desde hace

más de un siglo han ayudado a resolver problemas de etiología microbiana. Hay una gran

variedad de tinciones, que se han ido desarrollando para la detección de los diferentes

agentes infecciosos en los que se incluyen bacterias, parásitos y hongos. (Keller,2013).

El concepto de Tinción de Gram fue desarrollado por el científico danés Hans Christian
 5

Gram en 1884; hoy en día, sigue siendo una de las tinciones más utilizadas universalmente

debido a lo económico, sencillo y eficaz que resulta. Los principios de la tinción de Gram

están basados en las características de la pared celular de las bacterias, la cual le confiere

propiedades determinantes a cada microorganismo. (Beveridge, 2001).

Este es uno de los métodos de coloración para la clasificación morfológica más comunes,

el cual consiste en teñir una muestra mediante el colorante cristal violeta y así definir si

la muestra es perteneciente al conjunto de las Gram positivas o las Gram negativas. Esta

clasificación se efectúa al ver si la muestra retiene o no el colorante, designando como

Gram positivas a las muestras que logran retenerlo y Gram negativas a aquellas muestras

que pierden la coloración del cristal violeta (Spiegel, n.d). La falta de retención que

presentan las bacterias denominadas como Gram negativas, puede entenderse como la

falta de lípidos en su membrana plasmática lo cual da lugar a una inestabilidad osmótica,

es decir, la diferencia entre las Gram positivas y las Gram negativas se encuentra en la

membrana plasmática y la pared celular (Souza, 2000). De esta forma, La tinción de Gram

es conocida como una tinción diferencial, ya que utiliza dos colorantes y clasifica a las

bacterias en dos grandes grupos: bacterias Gram negativas y bacterias Gram positivas. El

objetivo principal de esta práctica consistió en identificar las técnicas de coloración más

comunes utilizadas para identificar morfología y estructuras de bacterias.

 6

3. MATERIALES Y MÉTODOS

Para la realización de la práctica se utilizaron materiales que varían entre láminas

portaobjetos, bandejas de coloración, Mechero y Asa de siembra. Además, se emplearon

reactivos como Cristal violeta, Lugol de Gram, Alcohol-acetona (actúa como

decolorante). Por otro lado, se trabajó sobre cultivos bacterianos como Escherichia coli,

Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Pseudomona aeruginosa.

En la primera parte del laboratorio se realizó la preparación de las láminas,

acondicionando la muestra y extendiéndola sobre cada una de las láminas portaobjetos,

seguido a esto se cubrieron las láminas con cristal violeta por un minuto, se lavaron y se

cubrieron nuevamente por un minuto esta vez con solución lugol, de nuevo se lavaron y

se dejó escurrir el exceso. Luego de esto las láminas con las muestras se decoloraron con

alcohol a 95° hasta que estas dejaron de soltar color, para finalizar, cubriéndolas con

safranina por 30 seg y lavando y secando nuevamente las láminas. Por último, se agregó

aceite de inmersión en las láminas debidamente teñidas y secas, estando listas se procedió

a observar los microorganismos con ayuda del microscopio.

 7

4. RESULTADOS

En primera instancia, se siguió la metodología estipulada, haciendo uso de la

bacteria Staphylococcus aereus. Posteriormente, en la Figura 1 se observó el

comportamiento de esta, dando como resultado un color violeta oscuro; indicando

de esta forma que es una bacteria Gram positiva.

Fig 1. Staphylococcus aureus.

En la Figura 2 se presenta la bacteria Bacillus cereus, en la cual se observó que

este microorganismo tiene una tendencia a ser Gram positivo por su color intenso

morado.

Fig 2. Bacillus cereus.

 8

En la Figura 3 se observó que la bacteria Escherichia coli, presentó un

comportamiento diferente a las dos anteriores figuras, puesto que se tornó de un

color entre rojo-rosa; indicando de esta forma que es un microorganismo de tipo

Gram negativo.

Fig 3. Escherichia coli.

En la Figura 4 se observó que la bacteria Pseudomona aeruginosa, presentó un

color confuso puesto que se marcaba entre rosa-morado. Finalmente, se concluyó

que el color que prevalece es la tendencia a rosa, lo cual es de tipo Gram negativo.

Fig 4. Pseudomona aeruginosa.

A continuación, se presenta un cuadro en donde se resume la información

adquirida mediante la observación de los anteriores microorganismos.

 9

Bacteria Staphylococcus Bacillus cereus

aureus

Descripción de lo observado Coco (forma redonda) Bacilo (forma

alargada)

Coloración de la bacteria teñida Rosa violáceo Rosa intenso

Reacción a la coloración de Gram positiva Gram Positivo

Gram

Bacteria Pseudomona aeruginosa. Escherichia coli

Bacilos alargados. Bacilos

Descripción de lo observado

Coloración de la bacteria teñida Rosa violáceo Rosa intenso

Reacción a la coloración de Gram Gram negativas Gram negativos

 10

5. DISCUSIÓN

La tinción de Gram basa sus principios en las diferencias entre las paredes celulares de

las bacterias Gram positivas y Gram negativas. La pared celular de las bacterias Gram

positivas posee una gruesa capa de peptidoglicano, además de dos clases de ácidos

teicoicos. Por el contrario, la capa de peptidoglicano de las Gram negativas es delgada, y

se encuentra unida a una segunda membrana plasmática exterior (de composición distinta

a la interna) por medio de lipoproteínas. Por lo tanto, ambos 17 tipos de bacterias se tiñen

diferencialmente debido a estas diferencias constitutivas de su pared. La clave es el

peptidoglicano, ya que es el material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana,

y las Gram positivas lo poseen en mucha mayor proporción que las Gram negativas. (Esaú

et al., 2014).

En la práctica de laboratorio se observó el comportamiento de E. Coli, S. Aureus, B

Cereus, P. Aeruginosa en el proceso de tinción de Gram. Se logró observar en primera

instancia Staphylococcus aureus, que es una bacteria de gran importancia debido a su

participación en diferentes patologías. Este mostró una coloración violeta como resultado

de la tinción se observa en la Figura 1 indicando que se trata de un microorganismo Gram

positivo, lo cual se logró constatar por medio de la teoría, donde se encontró que el

Staphylococcus aureus pertenece al género Staphylococcus que está formado por cocos

Gram positivos, con un diámetro de 0.5 a 1.5 μm, agrupados como células únicas, en

pares, tétradas, cadenas cortas o formando racimos de uvas. (Cervantes, 2014).

Posteriormente se analizó el comportamiento de Bacillus cereu, el cual generó una

coloración rosa debido a la tinción de Gram como se puede observar en la Figura 2,

debido a esto se determinó que se trataba de una bacteria Gram positiva. Esto se pudo
 11

comprobar ya que según la literatura Bacillus cereus es un bacilo Gram positivo,

anaerobio facultativo y móvil debido a la presencia de flagelos perítricos; forma esporas

resistentes a condiciones adversas del medio, como altas temperaturas, deshidratación y

radiación, y produce diversas toxinas que contaminan gran variedad de alimentos.

(Sánchez, 2014).

Para la enterobacteria E. coli y se determinó que esta bacteria es Gram negativa, debido

a que se tiñó de tonalidades de rojo y rosado, como se puede observar en la Figura 3, esto

con respecto a la prueba y para comprobarlo, según la literatura la Escherichia coli es un

bacilo Gram negativo, anaerobio facultativo de la familia Enterobacteriaceae, tribu

Escherichia. Como todas las bacterias Gram -, la cubierta de E. coli consta de tres

elementos: la membrana citoplasmática, la membrana externa y, entre ambas, un espacio

periplásmico constituido por péptido-glucano. Esta última estructura confiere a la bacteria

su forma y rigidez, y le permite resistir presiones osmóticas ambientales relativamente

elevadas (Rodríguez, 2002).

En el microorganismo P. aeruginosa, dentro de la prueba de laboratorio, se obtuvo como

resultado válido para Gram negativa como se muestra en la Figura 4, por presentar una

coloración violeta debido al proceso de tinción de Gram, según la literatura Pseudomonas

aeruginosa pertenece a la familia Pseudomonaceae. Se trata de un bacilo recto o

ligeramente curvado Gram negativo, con un tamaño de 2–4 x 0,5-1 micras, y móvil

gracias a la presencia de un flagelo polar. Para estos microorganismos es común que

generen una tinción rosa esto se debe a que los frotis gruesos son propensos a una

decoloración insuficiente, pueden reducir la especificidad, hacer que los organismos

Gram negativos parecía ser Gram positivos y pueden retener artefactos durante la tinción,
 12

lo que dificulta la lectura (Chandler, 2013). Ciertos organismos no siempre exhiben

características esperadas de tinción de Gram; en ocasiones, los organismos Gram

positivos aparecerán como Gram negativos, y los organismos Gram negativos retendrán

el cristal violeta durante la etapa de destintado y aparecerán como Gram positivos.

 13

6. CONCLUSIONES

• El método de tinción diferencial Gram es efectivo para la clasificación bacteriana,

a través de la observación del comportamiento de la pared celular frente a este

proceso de coloración; por el cual, proporciona una información esencial sobre la

forma, tamaño y agrupación de las células bacterianas. Es decir, es fundamental

para identificar la morfología de los microorganismos. Además, no solo tiene

aplicación para el reconocimiento de bacterias, sino también para otro tipo de

microorganismos, entre ellos, los hongos y algunos parásitos.

• Es preciso mencionar que el método de tinción de Gram sigue siendo una de las

tinciones más utilizadas universalmente debido a lo económico, sencillo y eficaz

que resulta realizarla. Además, ocupan un lugar muy importante en la

microbiología, permiten reconocer y tratar oportunamente diferentes tipos de

agentes y microorganismos peligrosos ya sea para la industria alimenticia, clínica,

y farmacológica.

• Esta diferencia de tinciones se debe a la estructura de las paredes celulares de

ambos tipos de bacterias. Las bacterias Gram positivas tienen una pared gruesa

compuesta de peptidoglucanos y polímeros, e impermeable, que hace que resista

a la decoloración. En cambio, las bacterias Gram negativas tienen una capa

delgada de peptidoglucanos más una bicapa de lipoproteínas que se puede

deshacer con la decoloración.

• Es fundamental tener un control y condiciones óptimas del cultivo para que el

resultado de la tinción mediante el método de Gram, proporcione resultados

apropiados, además de considerar que para realizar el estudio de algún

microorganismo este debe ser joven.

 14

7. ANEXOS

1. ¿Cuál es el propósito de fijación de la muestra?

R// En primera instancia, es importante mencionar que para algunas técnicas tintoriales

(como Gram) requieren antes de su proceso la fijación de las muestras, con la finalidad

de preservar la arquitectura estructural y química de las células. El método físico con

mayor utilización en microbiología es el calor seco, que consiste en exponer directamente

la laminilla a la flama del mechero, con esto se logra detener los procesos vitales de las

células y los microorganismos (López, 2014). Sin embargo, un sobrecalentamiento

repercutirá en la deformación de la morfología de las células bacterianas y asimismo, a

un efecto no deseado. Este método preserva el extendido por poco tiempo, por lo que se

recomienda utilizar un método químico, que precipite proteínas, antes de teñir

(Mollinedo, 2020). Así pues, la fijación de las muestras permite la adherencia de los

microorganismos en el portaobjetos y no permite que estos sean arrastrados durante el

lavado. Por otro lado, se preservan diversas partes de los microorganismos en el estado

natural con la mínima distorsión. La fijación se logra dada a la coagulación de las

proteínas plasmáticas causada por el calor.

2. ¿En la coloración simple que se observa principalmente?

R// “La tinción simple proporciona exclusivamente información acerca de la forma,

tamaño y tipo de agrupación de los microorganismos. Sin embargo, tiene la ventaja de ser

un método muy sencillo y rápido” (Vázquez, 2011). Mediante la coloración simple se

destaca el microorganismo por completo mediante un solo colorante. Esta tinción no sirve

para observar estructuras de los microorganismos, como por ejemplo las esporas.
 15

3. ¿Cuál es el objetivo u ocular con que se observa al microscopio una muestra de

microorganismos tipo bacterias?

R// El objetivo que se emplea para la observación es el de 100X o también conocido como

de inmersión, adicionando una gota de aceite de inmersión el cual no permite la refracción

de la luz mejorando la luminosidad.

4. ¿Qué sucede si el colorante permanece por más tiempo del definido?

R// Si el colorante permanece por más tiempo del estipulado esto puede afectar en los

resultados finales, ya que al tener este error sistemático se obtiene una manifestación no

esperada. Así pues, Rojas (2011) lo confirmó en sus estudios de tinciones simples y

compuestas para bacterias, concluyendo que un causante de cambio en el final puede

deberse a un error en la etapa o proceso de tinción.

5. ¿Cuál es la función del aceite de inmersión?

R// “El objetivo de inmersión, comúnmente de 100X está diseñado para emplearse con

aceite de inmersión para microscopía que se aplica sobre la preparación y se interpone

entre esta y el objetivo” (Dorantes, 2018). Así pues, la función del aceite es evitar la

refracción de la luz aumentando el poder de resolución del objetivo 100X, sella o elimina

el espacio entre el cubreobjetos y el objetivo.

 16

8. BIBLIOGRAFÍA

Beveridge TJ. Use of the Gram stain in microbiology. Biotechnic & Histochemistry.

2001; 76: 111-118.

Esaú López-Jácome, L., Hernández-Durán, M., Colín-Castro, C. A., Ortega-Peña, S.,

Cerón-González, G., & Franco-Cendejas, R. (2014). Las tinciones básicas en el

laboratorio de microbiología. 3.

www.medigraphic.org.mxwww.medigraphic.org.mx

Estrella Cervantes-García, Rafael García-González,Paz María Salazar-Schettino.

Características generales del Staphylococcus aureus. Revista Latinoamericana de

Patología Clínica. (2014)

Kaur, R., & Embi, M. A. (2009). Self-directedness through asynchronous online

interactions: A Malaysian experience. European Journal of Social Sciences, 9(1),

48–60.

Keller PJ. Imaging morphogenesis: technological advances and biological insights.

Science. 2013; 340: 123-168.

Laura Chandler, Chapter 20 - Challenges in Clinical Microbiology Testing, Accurate

Results in the Clinical Laboratory, Elsevier, 2013, Pages 315-326.

López-Jácome, L. E., Hernández-Durán, M., Colín-Castro, C. A., Ortega-Peña, S., Cerón-

González, G., & Franco-Cendejas, R. (2014). Las tinciones básicas en el

laboratorio de microbiología. Investig. en discapacidades, 3(1), 10-18.

 17

Madison BM. Application of stains in clinical microbiology. Biotech Histochem. 2001;

76: 119-125.

Mollinedo Patzi, Marcela Andrea; GONZALES VILLALOBOS, Cynthia. Bacterias

Gram Negativas. Rev. Act. Clin. Med, La Paz, 2020.

Rodríguez-Angeles, Guadalupe. (2002). Principales características y diagnóstico de los

grupos patógenos de Escherichia coli. Salud Pública de México, 44(5), 464-475.

Rodríguez, Y. Y., Arias, L. P., Medina, A. C., Mujica, Y. P., Medina, L. G., Fernández,

K. S., & Mena, A. E. (2015). Alternative stainning technique to determine

mycorrhizal colonization. Cultivos Tropicales, 36(2), 18–21.

https://doi.org/10.13140/RG.2.2.10232.65287

Sánchez J, Correa M, Castañeda-Sandoval LM. Bacillus cereus un patógeno importante

en el control microbiológico de los alimentos. Rev. Fac. Nac. Salud Pública 34(2):

230-242. DOI: 10.17533/udea.rfnsp.v34n2a12

Souza, Claudia Ache Saldanha de, AVANCINI, César Augusto Marchionatti, & WIEST,

José María. (2000). Actividad antimicrobiana de Tagetes minuta L. - Compositae

(Chinchilho) frente a bacterias Gram-positivas e Gram-negativas. Brazilian

Journal of Veterinary Research and Animal Science,

37(6)https://doi.org/10.1590/S1413-95962000000600001

Spiegel CA, Roberts M. Mobiluncus gen. Nov., curtisii sp. Nov., Mobiluncus curtisii

subespecies holmesii subsp.nov. and Mobiluncus mulieris sp.nov., curved rods for

the human vagina. Int J Syst Bacteriol 1984; 34: 177-184.

 18

Vázquez, C., Martín, A., de Silóniz, M. I., & Serrano, S. (2011). Técnicas básicas de

Microbiología. Observación de bacterias. Reduca (Biología), 3(5).