FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES

LABORATORIO BIOQUÍMICA

Alumno: Código:

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Práctica 8: BOMBEO DE PROTONES EN MEMBRANA CELULAR DE LEVADURAS Y SUS

PROCESOS INHIBITORIOS.

OBJETIVOS DE APRENDIZAJE:

• Relacionar el consumo de glucosa con los cambios de pH producidos por las levaduras.

• Explicar los cambios de pH por la generación de protones.

• Interpretar el efecto de los inhibidores y los desacoplantes sobre el bombeo de protones.

1. FUNDAMENTOS TEÓRICOS.

Las levaduras, Saccharomyces cerevisiae, son organismos unicelulares eucariotas (tienen un núcleo
bien definido) que cuentan con mitocondrias donde se lleva a cabo la síntesis de ATP. Todas sus
cepas pueden crecer aeróbicamente sobre sustratos de glucosa, maltosa, trehalosa, sin embargo,
hay ciertos azúcares como la galactosa y la fructosa que generan mejor rendimiento a nivel de
fermentación, es decir, en condiciones anaerobias.

Las células anaerobias mantienen un estado electrónico estacionario mediante la transferencia de

electrones desde los transportadores reducidos a los aceptores electrónicos, como en la reducción
del piruvato a lactato en la glucólisis anaerobia. En cambio, las células y los tejidos aerobios
transfieren los electrones en un proceso escalonado (alrededor de una docena de reacciones de
óxido – reducción ligadas consecutivamente y ejecutadas por complejos multiprotéicos), desde los
transportadores reducidos hasta el oxígeno molecular.

El metabolismo aerobio del piruvato genera muchos más equivalentes reductores que el anaerobio.
En la respiración, estos equivalentes reductores adoptan la forma de NADH y FADH2, que en células
eucariotas se reoxidan mediante las proteínas de transporte electrónico unidas y embebidas en la
membrana mitocondrial interna. Estas proteínas se ensamblan en cinco complejos multiprotéicos
denominados: I (NADH deshidrogenasa), II (succinato-coenzima Q óxidorreductasa), III (coenzima
Q-citocromo c óxidorreductasa), IV (citocromo oxidasa) y V (ATP sintasa) (ver figura 1). Los
complejos I y II reciben electrones del NADH y del FADH2 (estos últimos provenientes del succinato)
y los pasan al único transportador electrónico lipídico, la coenzima Q, que se desplaza libremente a
través de la membrana. El complejo III oxida la forma reducida de la coenzima Q y reduce a su vez
el citocromo c, un transportador electrónico proteico, y por último, el complejo IV acopla la oxidación
del citocromo c con la reducción del O2 a agua.
 El transporte electrónico genera a su vez la formación de un gradiente de protones a través de la
membrana interna mitocondrial. Los protones se bombean desde la matriz de la mitocondria hacia la
cara citosolica de la membrana interna mitocondrial.

Figura 1. Polarización de la membrana interna mitocondrial a consecuencia del bombeo de protones.

A nivel de la membrana plasmática, las levaduras tienen una ATPasa de H+ que acopla la hidrólisis
del ATP con el bombeo de protones hacia afuera de la célula. Esta proteína es semejante desde un
punto de vista estructural y funcional a la ATPasa de Na+/K+ de las células animales. Como
resultado de la actividad de la ATPasa de H+ en la levadura, se genera un gradiente electroquímico
de protones que se utiliza para impulsar el transporte de nutrientes al interior de la célula, proceso
catalizado por sistemas de transporte llamados simportadores o uniportadores. La ATPasa de H+
consume hasta un 25 % del ATP que se sintetiza en la célula.

Al presentarse una relación tan estrecha entre la cadena transportadora de electrones mitocondrial y
la ATPasa de H+ de la membrana celular, se puede medir el efecto que ciertas moléculas pueden
tener sobre la cadena respiratoria. Se sabe que hay ciertos compuestos que al ser suministrados de
forma exógena pueden inhibir la cadena de transporte electrónica, ya que actúan como inhibidores
específicos de los distintos complejos moleculares que integran la cadena. Además, un grupo de
compuestos, entre los que se encuentran el 2,4-dinitrofenol (DNP) y la trifluorocarbonilcianuro
fenilhidrazona (FCCP), se denominan agentes desacoplantes, o desacopladores. Estos agentes,
cuando se añaden a las mitocondrias, bloquean la síntesis de ATP. En el caso específico del DNP el
pKa del grupo fenólico es tal que se encuentra normalmente disociado a pH intracelular (figura 2). Sin
+
embargo, en la membrana interna mitocondrial se protona debido a la alta concentración de H el
compuesto protonado puede atravesar la membrana y al otro lado se desprotona nuevamente. Este
transporte de protones elimina el gradiente generado mediante la cadena electrónica y por ende la
producción efectiva de ATP.

Figura 2. Estructura química del DNP

Durante la práctica comprobaremos que el consumo de glucosa por la levadura deprime

progresivamente su concentración en el medio de cultivo con el paso del tiempo, y trae como
consecuencia cambios de pH a nivel extracelular, afectando la relación entre la ATP sintasa
mitocondrial y la ATPasa H+ de la membrana celular.
 2. SEGURIDAD DURANTE LA PRÁCTICA

2.1 Normas de seguridad

El estudiante debe referirse al manual de normas de seguridad.

2.2. Manejo de reactivos peligrosos:

La azida de sodio y el DNP son altamente toxicos y deben manejarse con cuidado
usando siempre guantes

2.3 Equipos de protección personal

Usar durante todo el desarrollo de la práctica los siguientes elementos de seguridad:

Bata de laboratorio
Guantes de nitrilo
Gafas de seguridad
Mantener los elementos personales de seguridad identificados y en buen estado. Está prohibido su
intercambio con los demás compañeros de laboratorio.

2.4 Manejo de Residuos químicos

Tanto por razones de seguridad como por respeto al medio ambiente, es importante disponer los
residuos generados en las prácticas del laboratorio de química en forma adecuada. Por ello el
estudiante debe:

1. Emplear los recipientes destinados para eliminar los residuos o desechos de laboratorio, los
cuales están debidamente identificados según el tipo de sustancia a desechar.

2. Verter únicamente los residuos en el recipiente correspondiente para evitar reacciones no

controladas y potencialmente peligrosas.

3. METODOLOGIA

3.1 MATERIALES

Tabla 1. Listado de materiales necesarios para el desarrollo de la práctica por pareja.

Item Cantidad
Vaso de precipitados de 50mL 3
Vaso de precipitados de 100mL 1
Vaso de precipitados de 250mL 1
Pipeta graduada de 1mL 2
Pipeta graduada de 10mL 1
Propipeta 1
Frasco lavador 1
Probeta 50 ml 1
Barra agitadora 1
Beaker 500 ml 1
Varilla de vidrio 3
 3.2 REACTIVOS

Tabla 2. Listado de reactivos necesarios para el desarrollo de la práctica por pareja.

Reactivos Cantidad
Levadura 3g
Solución de 2,4-dinitrofenol 80 mM 200 µl
Solución de Azida de sodio 800 mM 500 µl
Solución de glucosa al 10% 15 ml
Solución para calibrar pH-metro, pH 4 y pH 7 30 ml para todo el grupo

3.3 EQUIPOS

Tabla 3. Listado de Equipos necesarios para el desarrollo de la práctica por pareja.

Equipos Cantidad
PH-metro 1

3.4 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Procedimiento.

1. Prepare 15 mL de una solución al 20 % de levadura.

2. Tome 3 vasos de precipitados de 50 mL limpios y secos y rotule con los números: 1, 2 y 3. Coloque
las sustancias y soluciones en el orden y las cantidades señaladas en la siguiente tabla: (Con la
ayuda de un potenciómetro determine el valor de pH y registre por escrito los respectivos valores).

Tabla 4. pH
Vaso No.
Reactivo 1 control (ml) 2 (DNP) (ml) 3 Azida (ml)

Suspensión de levadura al 5 5 5
20%

Agua destilada 40 40 40

Solución de DNP 80 mM 0.2

Solución de azida de sodio 0.5

800 mM

Agite bien con la varilla y determine el pH en cada uno de los recipientes en

los tiempos indicados con el fin de obtener la línea basal.
pH a los 0 minutos
pH después de 5 minutos
pH después de 10 minutos
Deje en reposo los tres recipientes durante 5 minutos y luego adicione:
 Solución de glucosa al 10% 5 5 5
Agite bien con la varilla y determine el pH en cada uno de los recipientes en
los tiempos indicados.

pH a los 5 minutos
pH a los 10 minutos
pH a los 20 minutos
pH a los 30 minutos
pH a los 40 minutos

4. RESULTADOS.

1. Elabore en un mismo plano cartesiano las gráficas de pH en función del tiempo correspondiente a
cada uno de los vasos de precipitados.

5. ANÁLISIS DE RESULTADOS.

1. Según el modo de acción del DNP (lea la introducción e investigue). Es el comportamiento

observado para el pH en el vaso 2 lo esperado? Sustente su respuesta.

2. Explique basándose en el mecanismo de acción de la azida de sodio (investigue) la diferencia en

el comportamiento en el pH del vaso 3 comparado con el del vaso 2.

3. De haber obtenido resultados iguales entre el pH del vaso 2 y el 3, discuta teóricamente qué
debió observar, porqué y de una posible explicación de lo sucedido para no observar diferencia.

4. Además de los desacoplantes existen diversas moléculas que actúan como inhibidores de la
cadena de transporte electrónico. Investigue de dónde provienen y dónde actúan los siguientes
inhibidores: Rotenona, amital, antimicina A, cianuro y monóxido de carbono.

6. REFERENCIAS.

- Struyf, Nore (28 July 2017). "Bread Dough and Baker's Yeast: An Uplifting Synergy".
Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 16 (5): 850–867. doi:10.1111/1541-
4337.12282.
- Stryer L. Bioquímica, 7ª Edición.