GUÍA DE LABORATORIO

ANÁLISIS INSTRUMENTAL
QIM 111
1º semestre 2024

(Prácticas 3 y 4)

Profesor de Laboratorio: Dr. J. Francisco Armijo

Dr. Felipe Angel
Dra. Yo-Ying Chen

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 PRACTICA Nº 3

Determinación de etanol en una bebida alcohólica mediante cromatografía de gases con detector
FID. Identificación de una mezcla de alcoholes.
I. OBJETIVOS:
− Aprender el manejo de un Cromatógrafo de gases (CG)
− Aplicación de la CG en la determinación de alcoholes.

II. PARTE EXPERIMENTAL.

a) Determinación cuantitativa.

Reactivos
− Disolución de etanol (d = 0.79 g/mL, 100% p/p)
− Disolución de etilmetilcetona (d = 0.80 g/mL, 100% p/p)

1. Prepare en matraces de 10,0 mL las siguientes disoluciones, aforando con agua MiliQ.

Disolución Etanol (L) Etilmetilcetona (L)

1 200,0 200,0
2 300,0 200,0
3 400,0 200,0
4 500,0 200,0
Muestra licor 500,0
600,0 200,0
700,0

2. Mida la cantidad de muestra de Licor, Viértala en un matraz de aforo de 10,0 mL. Agregue 200 L de
etilmetilcetona (d = 0.80 g/mL, 100% p/p) y afore a con agua destilada. Homogenice.

3. Una vez encendido el equipo ajustar las condiciones de este para una medición isotérmica según:
T° horno = 55°C (Programa isotérmico)
T° Inyector = 150°C
T° Detector = 250°C
Presión del gas portador (N2) = 8 psi.
Presión de gases entrando al CGo: make-up, H2, air = 75, 50 y 40, respectivamente.

4. Inyecte 1 µL de cada disolución estándar y muestras a fin de obtener sus respectivos

cromatogramas., además inyecte 2 veces la muestra de licor diluida.

b) Determinación cualitativa
Para la identificación de los componentes presentes en los licores, se comparará los tiempos de
retención de los componentes del licor con los tiempos de retención de los estándares que se dispone.
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1. Preparar una disolución patrón que contiene 250 L de n-propanol, n-butanol, isobuanol,
isoamilalcohol y etilmetilcetona en 25 mL de etanol.
En este caso se trabajará con una gradiente de temperatura, para lo cual se debe ajustar las condiciones
del instrumento:

T /ºC t / min v / º min-1

Condición inicial 55 2 3
Etapa 2 100 10 15

2. Inyecte 1 µL de licor concentrado y luego en las mismas condiciones anteriores inyecte 1 µL de una
mezcla de patrones que contiene posibles compuestos que están presentes en los licores.

III. BIBLIOGRAFIA

− Skoog, D. A., Holler, F., & Nieman, T. A. (2008). Principios de análisis instrumental (6a. ed.). Cengage
Learning.

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 PRACTICA Nº 4

Determinación de Cafeína en bebidas Cola mediante HPLC con detector UV-Visible.

I. OBJETIVOS:
− Aprender el manejo de un cromatógrafo HPLC.
− Aplicación de HPLC en la determinación de cafeína.

II. PARTE EXPERIMENTAL

Reactivos
− Disolución patrón de cafeína: Pese 0,02 gramos de Cafeína, transfiera a un matraz de aforo de
10,0 mL y afore con metanol. Homogenice. De esta disolución mida 1,0 mL y transfiera a un
matraz de aforo de 10,0 mL, afore con fase móvil.

− Fase móvil: metanol/agua (50:50)

1. Con esta disolución patrón de 200 ppm prepare en matraces de 10,0 mL las siguientes disoluciones,
aforando con fase móvil

Estándares Cafeína 200 ppm (L)

Disolución 1 250
Disolución 2 500
Disolución 3 750
Disolución 4 1000

2. En un vaso pequeño agregue alrededor de 10 – 20 mL de bebida gaseosa e introdúzcala en el baño

ultrasónico por unos 10 min para eliminar el CO2. Luego mida 1,0 mL, 1,5 mL, 2,0 mL y vierta en un
matraz de aforo de 10,0 mL. Afore con fase móvil. Homogenice.

3. Inyecte 50 µL (el loop es de 20 µL) de cada disolución patrón y luego de la muestra.

4. Contamine la muestra con cafeína y vuelva a inyectar.

III BIBLIOGRAFIA

− Sawyer Donald T, Heineman William and Beebe Janice M. "Chemistry Experiments for Instrumental
Methods" Edit. John Wiley & Sons, 1984, New York.

− Skoog, D. A., Holler, F., & Nieman, T. A. (2008). Principios de análisis instrumental (6a. ed.). Cengage
Learning.

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 Pauta de Informe práctica No 3

Determinación de etanol en una bebida alcohólica mediante cromatografía de gases con detector
FID. Identificación de una mezcla de alcoholes.

1. Haga un pequeño resumen, de no más de 7 líneas, acerca de la práctica que realizó.

Resultados

2. En una tabla indique las concentraciones de etanol (g L -1) de cada disolución y sus correspondientes
areas.

3. Construya las curvas de calibración:

área etanol / área etilmetilcetona vs [etanol]

área etanol vs [etanol]

Trace la mejor recta, calcule el coeficiente de regresión y la concentración de etanol en el licor (g L -1).

4. Considerando las áreas de la etilmetilcetona, calcule la desviación estándar de las áreas y la

desviación estándar de los tiempos de retención.

5. Determinar rango lineal, sensibilidad, límite de detección y el límite de cuantificación para ambas
curvas de calibración.

6. En los cromatogramas de cada estándar, calcule el número de platos teóricos para el etanol y la
resolución, con su desviación estándar.

Discusión

7. Discuta TODOS sus resultados experimentales.

8. ¿Cuáles son las ventajas, desventajas y aplicaciones de esta técnica?

9. Discuta la diferencia y similitudes entre ambas curvas de calibración obtenidas.

10. Discuta como se pudo separar e identificar distintos alcoholes en su muestra problema.

10. Conclusiones

11. Referencias

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 Pauta de Informe práctica No 4

Determinación de Cafeína en bebidas Cola mediante HPLC con detector UV-Visible.

1. Haga un pequeño resumen, de no más de 7 líneas, acerca de la práctica que realizó.

Resultados

2. En una tabla indique las concentraciones de Cafeinal (ppm) de cada disolución y sus
correspondientes áreas.

3. Construya la curva de calibrado Áreacafeína vs Concentración de Cafeína. Trace la mejor recta.

Calcule la concentración de su muestra. Si la muestra es sólida exprese la concentración en % p/p y
sí es una disolución exprese la concentración en mg L-1.

4. Calcule el número de platos teóricos para cada cromatograma estándar.

5. Considerando los tiempos de retención de los estándares de cafeína, calcule la desviación estándar
para el tiempo de retención.

6. Determinar rango lineal, sensibilidad, límite de detección y el límite de cuantificación del método
analítico utilizando HPLC.

Discusión

7. Discuta TODOS sus resultados experimentales.

8. Construya una tabla con las ventajas, desventajas y aplicaciones de la técnica de HPLC.

9. Conclusiones

10. Referencias

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 CROMATOGRAFÍA GASEOSA Y HPLC
Conceptos fundamentales.

La Cromatografía es una técnica de separación en la cual uno ó varios solutos se distribuyen entre una
fase móvil y una fase estacionaria de acuerdo a sus afinidades.
Existen muchas clasificaciones: la más importante es aquella que considera el estado físico de la fase
móvil, dividiéndola en: Cromatografía de Gases, Cromatografía Líquida y Cromatografía de Fluido
Supercrítico. Una segunda clasificación es de acuerdo al estado físico de la fase estacionaria, entonces
decimos: Cromatografía Gas-sólido, Gas-Líquido, Líquido-Líquido, Líquido-Sólido.
Dependiendo del mecanismo de retención, ó el fenómeno por el cual ocurre la separación, se llama
Cromatografía de Adsorción, Reparto, Intercambio Iónico, Exclusión estérica y Permeación en Gel. En
cromatografía líquido-líquido ocurre el fenómeno de reparto ó distribución, mientras que en cromatografía
líquido-sólido ó gas sólido ocurre el fenómeno de adsorción.
De acuerdo a la técnica experimental, hablamos de Cromatografía en columna, en tubo abierto y plana
(papel y capa fina).
Si la muestra se agrega en una pequeña porción hablamos de cromatografía de elución (se obtiene una
curva de elución), en cambio si se agrega continuamente, como en el caso de la desionización del agua
potable, hablamos de cromatografía frontal ó de desplazamiento.
El método más utilizado en análisis cuantitativo es el de elución, en este caso se agregan unos pocos
microlitros de muestra y se hace eluir con la fase móvil.
La eficiencia de la columna se define en términos del número de platos teóricos. Donde tr es el tiempo de
retención, tm es el tiempo muerto y w corresponde al ancho del pico cromatográfico.

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Análisis Cualitativo:
La Cromatografía se utiliza también con fines cualitativos. El parámetro de identidad es el tiempo de
retención (tr). Para identificar algún componente de la muestra, se inyecta la muestra y en las
mismas condiciones se inyecta el estándar puro y se comparan los tiempos de retención. Si hay
duda se cambian las condiciones experimentales y se vuelve a inyectar la muestra y compuesto
puro. También se puede probar con varias columnas. Otra forma consiste en inyectar la muestra
sola, contaminar la muestra con el compuesto puro y volver a inyectar. Todos los picos disminuirán
su área debido a la dilución, pero el que se cree corresponde al compuesto que se está identificando
aumentará. Si se utiliza un detector universal, la identificación no tiene un alto porcentaje de
seguridad, debido a que dos compuestos diferentes podrían tener el mismo tiempo de retención.
Para la identificación de componentes en una muestra se utiliza como detector un espectómetro de
masas (GC-MS).
Análisis Cuantitativo:
Los parámetros para realizar la cuantificación son el área o la altura de los picos, obteniéndose
mejores resultados con el área.
a) Curva de calibrado simple. Se construyen curvas de calibrado midiendo las áreas o alturas de los
picos de los patrones y se calcula la ecuación de la recta señal vs concentración. En esta ecuación
se reemplaza la señal de la muestra y se determina la concentración de ésta.
b) Método del estándar interno. Se introduce en cada patrón y muestra un volumen constante de un
compuesto puro, cuyo tiempo de retención está cercano al de la muestra (pero no se superpone). Se
grafica altura relativa ó área relativa vs concentración del soluto ó vs concentración relativa. Con esto
se compensan errores al inyectar un volumen de muestra tan pequeño. Si se utiliza una columna
capilar es indispensable utilizar este método.
c) Normalización de áreas. Se deja que eluyan todos los componentes de la muestra. Se determinan
todas las áreas. El % de cada compuesto se determina con la relación de su área y el área total. Con
este método también se evitan incertidumbres asociadas con la inyección de la muestra.
La eficiencia de una columna se define en términos del número de platos teóricos (N) y la altura del
plato(H):

L corresponde al largo de la columna y w1/2 es el ancho a media altura.

La Resolución (R)de la columna es la capacidad para separar dos solutos (A y B).

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(Clasifique los tres cromatogramas en cuanto a su resolución)
Los fenómenos que influyen en el pico cromatográfico están relacionados con la siguiente expresión,
la cual es una versión más moderna de la ecuación que Van Deemter estableció en 1950.
B
H = + Cs + Cm
m
m = velocidad lineal de la fase móvil.
B/m = Difusión longitudinal. El soluto tiende a difundir desde una zona de mayor concentración a una
de menor. En este caso la dirección de la difusión es paralela a la velocidad de flujo. A velocidades
altas, este término no es significativo.
Cs y Cm son constantes de transferencia de masa hacia y desde la fase estacionaria y fase móvil
respectivamente. La columna cromatográfica trabaja en condiciones lejos del equilibrio, ya que
debido a la velocidad, no hay tiempo suficiente para que se alcance el equilibrio. La difusión debido a
la transferencia de masa ocurre en forma perpendicular al flujo.
El término Cs depende de diferentes factores, si la fase estacionaria es sólida ó líquida. Sí es líquida
depende directamente del espesor de la película e inversamente de los coeficientes de difusión en la
película. Sí es sólida depende directamente del tiempo de adsorción y desorción.
La constante de transferencia de masa en la fase móvil (Cm) es inversamente proporcional a la
constante de difusión del soluto en la fase móvil y también depende del tamaño de las partículas, del
tamaño de la columna y de la velocidad lineal del flujo. La fase móvil puede seguir una multitud de
caminos y su contribución a H no es lineal con respecto a m.
CROMATOGRAFIA DE GASES:
En esta práctica se realizará una cromatografía gas-líquido. Si la fase estacionaria es polar, orden de
salida depende de la polaridad y del punto de ebullición de los compuestos. Si inyectamos una
mezcla de dos compuestos en una columna polar, podemos decir con certeza que saldrá primero el
compuesto de menor polaridad y a la vez de menor punto de ebullición, si no se cumplen las dos
condiciones para el mismo compuesto, éstos pueden salir juntos ó invertirse el orden. En las
columnas apolares, la elución depende del punto de ebullición de los compuestos.
Las partes fundamentales son:
a) Gas Portador
b) Inyector para la muestra
c) Horno
d) Columna
e) Detector

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 (b) (e)

(a)
(c)

(d)

a) Gas Portador. Debe ser de alta pureza, no contener ni agua ni oxígeno. Los más utilizados son: He,
Ar, N2, CO2, H2. Su elección muchas veces depende del detector utilizado ó del costo. El rango de
presiones oscila entre 10 a 50 psi, lo cual nos proporciona un flujo de 25-150 mL/min en las
columnas empacadas y
1-25 mL/min en las columnas capilares.
b) Inyector. Contiene un septum donde se inyecta la muestra. Este debe cambiarse cada 100
inyecciones por lo menos. Generalmente se recomienda que esté 50 ºsuperior a la temperatura del
componente menos volátil de la muestra.
c) Horno. Para realizar las separaciones se puede aplicar una temperatura fija (isotérmico) ó una
temperatura programada o gradiente de temperatura.
d) Columnas. Hay dos tipos empacadas y capilares.
Las empacadas se fabrican con tubos de vidrio, metal (acero inoxidable, cobre, aluminio), ó de
Teflón, con una longitud característica de 2 a 3 metros y un diámetro interno de 2 a 4 mm. El soporte
sólido consiste de partículas esféricas, pequeñas y uniformes con una buena resistencia mecánica,
inerte y debe soportar temperaturas altas. Su tamaño generalmente es de 60-80 mallas (250-170
mm) o de 80-100 mallas (170-149 mm).
Las capilares o capilares abiertas, son de dos tipos básicos, denominados capilares de pared
recubierta (WCOT) y capilares con soporte recubierto (SCOT). Al principio las columnas WCOT se
construían de acero inoxidable, aluminio, cobre o plástico, posteriormente se utilizó el vidrio. Las
nuevas columnas WCOT, que se introdujeron en 1979, son columnas tubulares abiertas de sílice
fundida (columnas FSOT). Tienen alta resistencia física, una reactividad mucho menor frente a los
componentes de la muestra y flexibilidad. Tienen diámetros internos de 320 y 250 mm. También se
venden columnas de alta resolución, con diámetros de 200 y 150 mm. Estas últimas necesitan
inyección automática y un sistema detector más sensible. Recientemente han aparecido en el

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 mercado columnas capilares de 530 mm, a veces llamadas columnas macrocapilares, las cuales
admiten muestras de tamaño similar a los empleados en las columnas de relleno.
Las características de estas columnas no son tan buenas como las de menor diámetro, pero son
significativamente mejores que las empacadas.
Las fases estacionarias más frecuentes son:

R = -CH3 Polidimetilsiloxano OV-1, SE-30. No polar.

R = -C6H5 Poli(fenilmetil)siloxano. OV-17. No polar.
Polietilenglicol: OH-CH2-CH2-(O-CH2-CH2-)n OH Carbowax 20 M. Polar.
e) Detectores. El detector que se utilizará es el de ionización de llama (FID). La muestra se piroliza en
una llama Hidrogeno-aire y se producen iones y electrones que conducen la corriente. Responde
sensiblemente al numero de átomos de carbono, pero grupos funciónales tales como carbonilos,
alcohol, halógeno y amina originan muy pocos ó ningún ión. Además es insensible a gases no
combustibles como H2O, CO2, SO2 y NOx. En la práctica hemos encontrado que presentan una
pequeñisima señal H2O, CS2, CCl4.

Otros detectores son: Masas, IR, Conductividad térmica (TCD), Termoionico (TID), Captura de
electrones (ECD), Emisión atómica (AED), etc.

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 Cromatografía líquida de alta eficiencia o resolución (CLAE es HPLC).
Los productos farmacéuticos están sujetos a un estricto control de calidad. Varias técnicas
instrumentales se han utilizado con este fin, dentro de las cuales la cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC) y la espectrofotometría UV son de gran importancia. La aspirina y la cafeína
comúnmente están presentes en analgésicos y pueden ser separados y determinados
cuantitativamente por HPLC.
La técnica de HPLC hace uso de una fase móvil, la cual se hace pasar en forma uniforme a una
presión alta (hasta 200 bares aproximadamente). La ventaja más obvia de esta técnica es que
permite la separación y detección de muestras que no son volátiles ó que sufren descomposición con
la temperatura.

Se inyecta una pequeña cantidad de muestra líquida en la fase móvil que pasa a través de una
columna que está empacada con partículas de fase estacionaria. De acuerdo a la afinidad del soluto
con las dos fases se producirá la separación de acuerdo al fenómeno de adsorción (si la fase
estacionaria es un sólido) ó de reparto (si la fase estacionaria es un líquido).
En cromatografía de adsorción se utiliza una fase estacionaria de naturaleza polar, tales como
partículas de sílica ó alúmina hidratada. La fase móvil y el soluto de acuerdo a su polaridad, compiten
por los sitios activos de la fase estacionaria. Con una fase móvil más polar los tiempos de retención
disminuirán. En la siguiente lista se presentan solventes de acuerdo a su fuerza de adsorción en el
adsorbente alúmina. Esta escala se llama serie elutrópica. Un solvente de mayor polaridad
desplazará a uno de menor valor:

En la cromatografía de partición, el soluto se distribuye entre una fase móvil líquida y una fase
estacionaria formada por un líquido inmiscible con la fase móvil y que está en un soporte sólido
inerte. La extensión del reparto es controlado variando la polaridad del solvente. Si la fase
estacionaria es más polar que la fase móvil se llama cromatografía normal, en cambio si la fase móvil
es más polar que la fase estacionaria se llama cromatografía de fase reversa.

El instrumento consiste de un frasco para los solventes, una bomba que proporcione una presión de
4000 psi (o mayor), una válvula para inyectar la muestra (10-500 L), una columna a veces
termostatada, un detector (generalmente de absorción UV), un inscriptor y sí es posible un
integrador.

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 Diagrama HPLC

LOOP CERRADO LOOP ABIERTO

DETECTOR UV (254 nm)

Cada componente de una mezcla se identifica cualitativamente por su tiempo de retención (t r), el
cual depende de la fase estacionaria, fase móvil, velocidad de flujo, temperatura, etc. Para la
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identificación se debe disponer del componente en su forma pura y se inyecta en las mismas
condiciones de la muestra. El área es proporcional a la concentración del componente en la muestra.
Si el pico es angosto y la velocidad de flujo está cuidadosamente controlada, la altura es proporcional
a la concentración.

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