UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA

CENTRO UNIVERSITARIO DEL NORTE

INGENIERIA AGRONÓMICA
FITOPATOLOGIA I

PRÁCTICA 8: BACTERIAS FITOPATÓGENAS, AISLAMIENTO Y

CARACTERIZACIÓN
I. INTRODUCCIÓN
Bacterias son microorganismos unicelulares procariontes abundantes y de mayor diversidad en la naturaleza.
Pueden estar asociadas a la planta o parte de ella como residentes (relación temporal, sin causar enfermedad)
como epifitas (relación permanente, sin ocasionar enfermedad) o como patógenos colonizando los tejidos y
provocando la enfermedad. La observación de enfermedades ocasionadas por fitobacterias aconteció desde
1878 con Burrill, quien observó la actuación de una bacteria como patógeno. Erwin Smith, fitopatólogo
norteamericano, en 1889 demostró de forma completa la etiología bacteriana con Erwinia amylovora agente
causal de fuego bacteriano en pera. A partir de 1901, el estudio de enfermedades bacterianas en plantas fue
admitido como área específica del conocimiento dentro de la fitopatología.
La mayoría de las enfermedades bacterianas de plantas son ocasionadas por un reducido número de géneros,
se citan: Rhizobium, Clavibacter (=Corynebacterium), Pectobacterium, Erwinia, Ralstonia, Burkholderia,
Xanthomonas, Pseudomonas, Rhodococcus, Xylella, Leifsonia, Streptomyces, entre otras.

Las fitobacterias pueden producir diversos síntomas tales como: marchitez, manchas foliares y de frutos (se
refieren a la mancha de cualquier tipo, color, tamaño y forma), Ej. mancha necrótica, clorótica, en forma de
V), agallas, pudriciones blandas (pudrición rápida y acuosa de cualquier parte de la planta causada por
bacterias u hongos que producen grandes cantidades de enzimas pectolíticas), clorosis y necrosis vascular,
cancro (lesión profunda y abierta), gomosis (síntoma caracterizado por la exudación bacteriana o de goma
sobre la lesión), muerte descendente (muerte progresiva de la planta de arriba hacia abajo), escaldadura
(lesión que se asemeja a la causada por agua o vapor caliente), estría (lesión alargada corta o extensa,
generalmente observada en hojas de plantas que presentan nervadura paralela como en las gramíneas,
musáceas y otras), brotación excesiva, entre otros. Sobreviven de una estación para otra en restos de cultivos,
en semillas o como epifitas en tejidos infectados de hospederos alternativos.

Las bacterias son fácilmente diseminadas por el aire, agua, por máquinas agrícolas, insectos vectores, entre
otros. Normalmente penetran los tejidos de las plantas a través de heridas y necesitan alta humedad para la
infección, colonización y multiplicación en el tejido infectado. La identificación de las bacterias fitopatógenas
puede ser realizada a través de caracterización morfológica de las colonias en medio de cultivo, criterios
fisiológicos, pruebas bioquímicas, coloración diferencial, por reacción serológica, trofismo, criterios
patogénicos y técnicas moleculares. En el tema de clasificación de bacterias fitopatógenas, se han propiciado
cambios a través de los años. En el campo, algunos síntomas propiciados por bacterias son característicos de
la enfermedad y con buena experiencia también ayudan en la identificación de la bacteria, principalmente a
nivel de género.
En este documento de apoyo y práctica de laboratorio, se brindan nociones generales de los géneros de
bacterias fitopatógenas y de enfermedades asociadas más importantes en Guatemala. Se enseñan los métodos
para aislar una bacteria a partir de material enfermo y su caracterización. Existen muchas técnicas clásicas
que pueden ser utilizadas (fisiológicas, bioquímicas, patogenicidad) que son relativamente fáciles, rápidas y
aplicables al grupo de bacterias “no fastidiosas”.

II. OBJETIVO
Brindar nociones generales de los géneros más importantes de bacterias que ocasionan enfermedades en
plantas y estudiar algunos métodos de aislamiento y caracterización de los principales géneros de bacterias
fitopatógenas dentro del grupo de las no fastidiosas.

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III. REFERENCIAL TEÓRICO
IMPORTANCIA ECONÓMICA DE LAS FITOBACTERISOSIS
Bacterias constituyen importantes patógenos de plantas, ya sea por la gravedad de las enfermedades que
ocasionan en cultivos, por la facilidad con que se diseminan y la dificultad en el control de las enfermedades
por ellas ocasionadas.
En Guatemala, no se cuenta con datos sobre pérdidas por enfermedades bacterianas. Se señalan situaciones
aisladas y que constituyen problemas serios como el caso de Ralstonia en todo el país. Sin embargo, no
existen datos exactos en torno a ese problema, pero en realidad las pérdidas son millonarias en campos de
agricultores y en comercialización. Se menciona el caso de Xylella fastidiosa en café y el amarillamiento letal
del coco ocasionado por un fitoplasma en la costa del Atlántico de Guatemala, problemas de infección de
Clavibacter en tomate, Candidatus Liberibacter en cítricos, entre otros. Todos estos géneros y especies de
bacterias y los patosistemas a los cuales están asociados, deberían ser estudiados.
En el ámbito internacional, se sabe que bacterias han ocasionado pérdidas, ejemplo, el caso del cancro de los
cítricos ocasionado por Xanthomonas citri subsp. citri. Esta enfermedad surgió en Brasil en la década de 50 y
causó problemas serios en la costa Atlántica en los Estados Unidos y el caso de Candidatus Liberibacter en
cítricos, entre otros problemas relatados en la literatura.

CONDICIONES EN QUE SE MANIFIESTAN LAS FITOBACTERIAS

Las enfermedades bacterianas se manifiestan en ambiente específico. Las causadoras de pudrición blanda,
consiguen infectar a través de heridas y cuando hay exceso de agua libre, sea en condiciones de campo o
postcosecha. La deficiencia de boro y calcio aumenta la susceptibilidad de muchas especies de plantas a las
bacterias causadoras de pudrición blanda. La marchitez bacteriana ocasionada por R. solanacearum ocurre
dependiendo de la especie botánica que infecta y ambiente en campo. Por lo tanto, el conocimiento del
ambiente en que ocurre la fitobacteria, es de grande valor en la definición de una enfermedad.

CLASIFICACIÓN
La mayoría de los géneros de bacterias que han sido estudiados, se describen en el manual de Bergey (Krieg y
Holt, 1984). Al comentar sobre bacterias se toma como referencia este manual. Para la 9ª. Ed. (1984), se
reconoce como válida la existencia del Reino Procaryotae, pero no se contempla la sistematización del reino
en fílum, clases, órdenes, etc., a no ser de forma discontinua e incompleta. En vez de eso posiciona a las
bacterias en secciones; las bacterias fitopatogénicas no fastidiosas más importantes, que son objeto de nuestro
estudio en el momento, se localizan en las secciones 4 y 5 en el volumen 1, y 15 en el volumen 2. En la
sección 10 se agrupan los Espiroplasmas y Fitoplasmas, también son procariotas fitopatogénicos que no
poseen pared celular, pleomórficos, localizados en el floema de las plantas hospederas, ocasionan
amarillamientos, entre otros síntomas. Existen nuevas ediciones de dicho manual, que contemplan
modificaciones. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, publicación de 5 volúmenes de 2001a 2011, en
su segunda edición.

En esta práctica se brinda la clasificación de los principales géneros de bacterias. Está basado en la propuesta
realizada por Kado, 2 010 ; Euzèby, basada en la comparación de secuencias de rDNA 16S. No se incluyen
todos los géneros, se enfatizan los de mayor interés en Guatemala.
Las bacterias fitopatógenas son clasificadas de acuerdo a la nomenclatura binomial dentro de género y
especie. Algunas bacterias son clasificadas al nivel taxonómico de sub-especie. En fitopatología se utilizan
niveles clasificatorios infra-específicos denominados: patovares, razas y biotipos, entre otros.
Con el avance de la biología molecular, nuevos arreglos clasificatorios han sido propuestos y adoptados. Para
complementar esta información, consultar el libro de Agrios, enfermedades de las plantas causadas por
organismos semejantes a fitoplasmas, con atención al amarillamiento letal del coco. Además, literatura
sugerida al final de esta práctica.
Para caracterización de un aislamiento bacteriano (estirpe =”strain”) es necesario seguir una serie de pasos
ordenados. Se toman en consideración características relacionadas con morfología, ecología, fisiología,
bioquímica, biología molecular y genética, entre otros.

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PRINCIPALES GRUPOS Y GÉNEROS DE BACTERIAS FITOPATÓGENAS
Fílum Proteobacteria, clase Alfaproteobacteria, familia Rhizobiaceae

Rhizobium radiobacter (Agrobacterium Conn 1942) (=A. tumefaciens) especie formadora de tumores.
Presenta forma de bastón o bacilos no esporulantes, gram-negativos de 0.6-1.0 x 1.5-3.0 μm, móviles por 1 a
6 flagelos perítricos, aeróbica. El % Mol de G + C del ADN es 57-63. Las colonias son lisas, viscosas y no
son pigmentadas. Comúnmente asociada alrededor de las raíces de las plantas y en el suelo. Las patogénicas
causan hiperplasia e hipertrofia del tejido vegetal, provocando síntomas conocidos como tumor o la emisión
de raíces filiformes en el tallo. La especie tipo es Rhizobium radiobacter. Ocasiona tumores en plantas como
manzana, rosa, güisquil, lechuga, mora, yuca, vid, frambuesa, cushin y se sabe que en Guatemala también
ocasiona pérdidas en flores.
R. rhizogenes (A. rhizogenes) provoca proliferación de raíces en el tallo en plantas infectadas. La actividad
patogénica está determinada por plásmidos Ri.

Fílum Proteobacteria, clase Alfaproteobacteria, familia Phyllobacteriaceae

Candidatus Liberibacter
Este género es importante en Guatemala. „Ca. Liberibacter americanus‟ / „Ca. L. americanus‟ Gram negativa;
habita el floema de las plantas. Huanglongbing (HLB ou Greening), asociada a cítricos y otras especies
botánicas de menor importancia. Es trasmitido por el psílido vector Diaphorina citri. Candidatus: término
utilizado para describir entidades procorióticas que poseen apenas secuencias disponibles y cuyas
características requeridas por el Código Bacteriológico para descripción de la entidad están faltando.

Fílum Proteobacteria, clase Betaproteobacteria, familia Burkholderiaceae

Burkholderia
Son bacterias aeróbicas, baciliformes, con tamaño entre 0.5-1.0 x 1.5-4.0 μm. Reacción gram- negativa, no
producen pigmentos fluorescentes, acumulan Poli-β-hidroxi-butirato, son móviles debido a la presencia de
flagelos polares. Habitan en el suelo y son relatadas como agentes de marchiteces y manchas foliares en
ornamentales, estrías en sorgo y pudrición en catafilos de cebolla.

Fìlum Proteobacteria, clase Betaproteobacteria, familia Ralstoniaceae

Ralstonia
Bacteria gram-negativa, tiene forma de bastón, colonias generalmente blancas a beige. Esta es una de las
bacterias más importantes en Guatemala, la especie R. solanacearum ocasiona pérdidas en varios cultivos
de solanáceas (tomate, chile pimiento, berenjena, papa entre otros) y banano. El síntoma típico, en todos los
casos es la marchitez seguida de muerte. Durante la noche o en las horas más frías del día los foliolos pueden
recuperar su turgencia. Plantas con marchitez presentan progresiva decoloración vascular, más intensa en la
base de la planta, que puede ser fácilmente visualizada. Para evitar confusiones con otros patógenos que
ocasionan marchitez es recomendable realizar la prueba de flujo bacteriano y otras técnicas mencionadas en
el laboratorio. La clasificación de esta bacteria ha sufrido cambios constantes desde que fue descubierta. En
la literatura antigua aparece con los nombres de Pseudomonas solanacearum, Burkholderia solanacearum,
Ralstonia solanacearum y reconocida como un complejo. Ralstonia solanacearum, especialización: razas (5),
biovares (6), ecotipos, filotipos (4), sequevares (54), biotipos.
Representantes de este género presenta colonias no fluorescentes células tipo bastonete, con dimensiones
variables entre 0.5-0.7 x 1.5-2.5 μm, reacción gram-negativa, aeróbicas y móviles por medio de flagelos
polares. La especie es habitante del suelo, puede penetrar por el sistema radicular del hospedero y ser
distribuida de forma sistémica a través del xilema. Los síntomas externos que ocasiona es marchitez de hojas
y los síntomas internos, visualizados por la descoloración de los vasos conductores, coloración marrón de los
tejidos de la planta.

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Fìlum Proteobacteria, clase BetaProteobacteria, familia Comamonadaceae

Acidovorax
Comprende bacterias gram-negativas, aeróbicas, células forma de bastonetes rectos o levemente curvos,
dimensiones variables 0.2-0.7 x 1.0 a 5.0 μm. La mayoría presenta un flagelo polar, colonias en medio de
cultivo nutriente-agar no pigmentadas. Trasmitida a través de la semilla. Una especie de interés en Guatemala
es A. citrulli que ocasiona la mancha acuosa en melón y sandía.

Fílum Proteobacteria, clase Gammaproteobacteria, familia Xanthomonadaceae

1. Xanthomonas

Más de una centena de bacterias agentes de enfermedades de plantas están incluidas en este género, lo que
torna a este grupo de gran interés en fitopatología. Es una bacteria en forma de bastón, gram- negativa,
móviles por un único flagelo polar, estrictamente aeróbica, no es capaz de utilizar asparagina como fuente
única de carbón y nitrógeno. La proporción G + C de ADN es de 63-71%. La mayoría colonias amarillas
debido a producción de un pigmento llamado xantomonadina. La especie típica es Xanthomonas campestris
(Pammel, 1895) Dawson, 1939. La mayoría de especies del género son fitopatógenas, pero pequeño número
de saprofitas y epifitas pueden ser encontradas. Xanthomonas posee varias especies reconocidas, pero su
clasificación está sujeta a cambios (Vauterin et al., 1995). En la especie X. campestris se aceptan patovares,
en función, principalmente de los criterios de patogenicidad de hospederos.
Las especies reconocidas pueden ocasionar diferentes tipos de síntomas como: lesiones foliares en el
filoplano, marchitez, cancro, muerte de puntas de ramas, estrías cloróticas en hojas, manchas, entre otros.
Toxinas y enzimas producidas por el patógeno deben estar implicados en el tipo de síntoma exhibido en el
hospedero. Algunas especies relatadas regionalmente para este género son X. fragarie que ataca fresa, X.
albilineans afecta caña de azúcar y provoca la enfermedad conocida como escaldadura foliar, X. citri pv.
citri es una de las más importantes y ocasiona el cáncer de los cítricos. Marchitez y muerte de plantas de yuca
es ocasionada por la especie X. campestris pv. campestris ocasiona la pudrición negra o nervadura negra
de las crucíferas. X. campestris pv. vesicatoria ocasiona la mancha o pústula bacteriana del chile pimiento,
también afecta tomate y berenjena. Existen otras especies y patovares de menor importancia.

2. Xylella
En 1987, fue relatado como un nuevo género para describir bacterias fastidiosas gram-negativas, limitadas al
xilema. Colonias no pigmentadas, células no móviles y no flageladas. Catalasa positiva, oxidasa negativa.
Comprende bacterias en forma de bastonetes rectos, dimensiones variables 0.2-0.4 x 1.0 a 4.0 μm.
Estrictamente aeróbica, no presenta movilidad y no produce pigmentos coloridos. Las colonias son diminutas
y se desarrollan muy lentamente en medios específicos (14 días). Reclasificadas por Schaad en 2004 como X.
fastidiosa subsp. piercei en vid, X. fastidiosa subsp. multiplex en durazno, melocotón y X. fastidiosa subsp.
pauca en cítricos y café.
En la naturaleza el patógeno es trasmitido por cicadélidos que se alimentan del contenido del xilema.
Síntomas exhibidos por plantas enfermas incluyen lesiones salientes presentes en hoja y frutos pequeños en
cítricos; en café se observa nudos cortos, hojas amarilla y pequeñas, seca de ramas, quema y caída de hojas.
Cuando es severo puede ocasionar decaimiento de la planta.

Fílum Proteobacteria, clase Gammaproteobacteria, familia Pseudomonadaceae

Pseudomonas
Bacterias de este género, se caracterizan por presentar la forma de bastonetes rectos o levemente curvos,
dimensiones 0.5-1.0 x 1.5-5.0 μm. Son gram-negativas, aeróbicas estrictas y se mueven por la presencia de
flagelos polares, monotrico o lofotricos. Catalasa +, nitrato reductasa+, la principal característica de los
representantes del género Pseudomonas es la producción de pigmentos fluorescentes en determinados
medios de cultivo. Algunas especies no fluorescentes anteriormente dentro de este género pasaron a ser parte
de los géneros Acidovorax, Burkholderia y Ralstonia.
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Diversas especies son conocidas como patógenos de plantas, ejemplo P. syringae considerada la más
importante desde el punto de vista económico, Ej. P. syringae pv. tomato. Los síntomas que ocasiona son
diversos en función de la especie de la bacteria y se manifiestan en forma de quema de flores y hojas,
manchas foliares, canceres en ramas, pudriciones, agallas. Pseudomonas syringae es una especie heterogénea
con varios patovares. P. viridiflava en cebolla y ajo, Pseudomonas cichorii esta especie ocasiona lesiones
necróticas en hojas de varias especies vegetales.

Fílum Proteobacteria, clase Gammaproteobacteria, familia Enterobacteriaceae

1. Dickeya

Este género de bacteria anteriormente denominada como Erwinia causante de pudrición blanda, tallo hueco en
varios cultivos, se caracteriza porque producen enzimas pectolíticas. Se mencionan algunas especies
importantes como: Dickeya chrysanthemi pv. chrysanthemi pudrición en crisantemo y otras especies
vegetales. D. dadantii en piña, papa. D. dianthicola en alcachofa, tomate, clavel (Dianthus), D. paradisiaca
en banano, D. zeae en maíz.

2. Erwinia

El género Erwinia en muchos libros está dividido en dos grupos las especies pectolíticas y no pectolíticas, sin
embargo esto ha sido modificado.
Se considera como Erwinia, aquellas bacterias que no producen enzimas pectinolíticas, causadoras de
quemas, necrosis y marchitez. Especie Erwinia amylovora que ocasiona la enfermedad de quema de las hojas
de pera y manzana, daño observado en cultivos del altiplano central en Guatemala. E. papayae en papaya, E.
tracheiphila ocasiona marchitez en cucurbitáceas.

3. Pantoea
Anteriormente Erwinia. En 1992, la especie fitopatógena Pantoea citrea fue descrita e incluida como
perteneciente a este género. Un año más tarde, E. ananas y E. stewartii, también fitopatógenas a plantas,
fueron transferidas para Pantoea. Actualmente este género comprende las especies patogénicas Pantoea
citrea, P. ananas y P. stewartii subsp. stewartii conjuntamente con P. agglomerans, considerada, a veces,
como sinónimo de E. herbicola. Síntomas expresados por plantas infectadas por bacterias del género Pantoea
son variables, se menciona manchas foliares, pudriciones, agallas y anomalías en el crecimiento, dependiendo
de la especie patogénica.

4. Pectobacterium

Antiguamente denominada Erwinia. Pectobacterium comprende aquellas bacterias que producen enzimas
pectinolíticas. Designa las bacterias causadoras de pudriciones blandas en frutos y hortalizas, tallo hueco,
entre otros. Son productoras de pectinasa que digiere la lámina media de las células de los órganos atacados y
ocasiona desorganización de los tejidos vegetales, resultando en una pudrición acuosa.
Ejemplos de problemas importantes: P. atrosepticum ocasiona la pudrición y marchitez en papa; P.
betavasculorum pudrición en remolacha; P. carotovorum subsp. carotovorum pudrición blanda en cebolla,
lechuga, zanahoria y otras hortalizas.

Fílum Tenericutes, clase Mollicutes, familia Spiroplasmataceae

Candidatus Phytoplasma
No son cultivados en medios artificiales. Tienen insectos vectores. Se menciona el amarillamiento letal del
coco en la costa del Atlántico en Guatemala.

Fílum Actinobacteria, classe Actinobacteria, familia Micrococcaceae

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Clavibacter Davies, Gillaspie, Vidaver & Harris 1984

Estaba dentro del género Corynebacterium junto con los géneros clasificados como Curtobacterium,
Arthrobacter y Rhodococcus. Normalmente son bastonetes irregulares (pleomórficos), no esporogénicos, no
móviles, colonias blancas, amarillas, naranja dependiendo de la especie o aislamiento medio y edad de la
colonia. Catalasa positivas. El porcentaje molecular G + C del ADN es de 70 +/- 5%. La especie típica es
Clavibacter michiganensis Davies, Gillaspie, Vidaver & Harris, 1984. C. michiganensis subsp.
michiganensis causa el cáncer bacteriano del tomate y chile pimiento. Clavibacter michiganensis subsp.
sepedonicus ocasiona la pudrición en anillo de la papa.

Fílum Actinobacteria, classe Actinobacteria, familia Microbacteriaceae

Leifsonia
Este género es importante en Guatemala. Leifsonia xyli subsp. xyli Davis, Gillaspie, Vidaver y Harris,
ocasiona el raquitismo de la caña de azúcar (RSD = Ratoon Stunting Disease), fue observado por primera vez
en Australia, en 1944-1945 y en la actualidad se ha informado su presencia en 47 países incluyendo
Guatemala. Puede ser identificada con la sintomatología interna del tallo de caña infectada, los haces
fibrovasculares de la base de los nudos presentan coloración rojo naranja que aparece como pequeños puntos
y rayas al realizar un corte transversal del tallo maduro infectado. Se observa apariencia raquítica de las
plantas, tallos muy delgados y pequeños en medio de los normales. Es necesario tener cuidado ya que
enanismo también puede ser provocado por factores ambientales desfavorables y atenciones culturales
inadecuadas. La bacteria se transmite por semilla agámica procedente de plantas enfermas, por herramientas
de corte y posiblemente por roedores.
Leifsonia xyli subsp. cynodontis raquitismo en grama bermuda y maíz.

Fílum Actinobacteria, classe Actinobacteria, familia Streptomycetaceae

Streptomyces

Comprende bacterias que se desarrollan por la formación de filamentos ramificados y de esporas

reproductivas. Estas estructuras se asemejan aquellas producidas por hongos, pero sus dimensiones son
menores. El diámetro de los filamentos bacterianos varia de 0.5-2 μm, y se fragmentan dando origen a una
cadena de esporas, con formato de barril, que miden 0.8-1.7 x 0.5-0.8 μm. Las colonias son generalmente
blancas, pero pigmentos pueden ser producidos alrededor de la colonia dependiendo del medio. Estas
bacterias tienen características saprofíticas, que permite su sobrevivencia en el suelo, bajo condiciones de pH
neutro o ligeramente alcalino. El número de especies patogénicas dentro del género es pequeño siendo estas
agentes de necrosis en órganos subterráneos. La especie más conocida es Streptomyces acidiscabies que
ocasiona la costra o sarna común en tubérculo de papa, rábano, remolacha cuando hay baja de humedad en el
suelo.
IV. MATERIAL Y MÉTODOS
El encargado de laboratorio le brindará un resumen de las principales bacterias fitopatógenas. Realizará una
demostración con material vegetal enfermo con bacterias enfatizando en la sintomatología. Luego,
demostración de algunos métodos utilizados en bacteriología vegetal para el aislamiento de la bacteria y
finalmente los usados en la caracterización de fitobacterias. Se formarán grupos de estudiantes y procederá a
demostrar algunos métodos.

a) AISLAMIENTO DE FITOBACTERIAS
Para el aislamiento de bacterias fitopatogénicas se utilizan diferentes métodos que se adaptan de acuerdo
al género de la bacteria que se desea aislar.
1. Proceda a desinfestar el material enfermo (hojas, tallo).
2.Coloque fragmentos pequeños en alcohol 50-70% por aproximadamente 50 segundos.
3.Luego en hipoclorito 0.5 a 1 % por 1-3 minutos dependiendo del material vegetal y posteriormente lavar
6
 en agua destilada estéril. Para ello, puede utilizar vidrios de reloj o placas de petri pequeñas y para la
transferencia del material de un vidrio a otro use pinza esterilizada.
4. Coloque las porciones de material enfermo que fue desinfestado en 2 a 3 ml de agua destilada estéril
durante 30 a 60 minutos a temperatura ambiente. En algunos casos, el material puede macerarse y realizar
dilución. Tome un asa de la suspensión o dilución resultante, la que se inocula por estría en un medio de
cultivo sólido especial para bacterias, Ej. medio 523.
Es esencial que la superficie del medio esté seca, porque si no las bacterias móviles pueden movilizarse en la
humedad superficial y se produce una variedad de crecimientos de colonias mezcladas y no se obtiene el
aislamiento deseado.
5. Incubar, coloque las placas inoculadas a 25-30 ºC para todas las bacterias fitopatógenas, excepto para
Clavibacter en donde puede utilizar 21-25 ºC. Después, observe las colonias que se desarrollan (de
preferencia a cada 24 h), frecuentemente existe más de un tipo de bacterias. Las bacterias saprofíticas
normalmente crecen con mayor rapidez que las fitopatógenas.
6.Con ayuda de asa bacteriológica estéril, proceda a elegir una colonia que se encuentre bien separada y
considere que es fitopatógena, para eso se necesita un poco de experiencia. Tome en consideración la
descripción de las características de las colonias descritas en la literatura. Elegir una o varias y luego
confirmar la patogenicidad.
7. Transfiera la colonia seleccionada en una placa con medio. Observe cada 24 h, anotando las
características de cada una de las colonias desarrolladas tamaño, forma, tipo de borde, elevación, color, tipo
de crecimiento (lento, rápido, muy rápido), etc.
El método anterior no es generalizado para todas las bacterias. Para el caso particular de bacterias que
ocasionan pudriciones blandas como Pectobacterium, se puede aislar con el procedimiento indicado
anteriormente. Como alternativa, se recomienda utilizar un material susceptible como el chile pimiento
(fruto) a fin de eliminar parte de los contaminantes presentes en la pudrición blanda, esta técnica es fácil de
realizar y será demostrada en el laboratorio.
Si se trata de Ralstonia, pedazos de ramas de plantas enfermas (con marchitez) de aproximadamente10 cm
son desinfestados y se suspenden dentro de tubos con agua destilada estéril para obtención de flujo
bacteriano, este procedimiento se conoce como prueba de flujo bacteriano. Para el caso de la estirpe que
ocasiona el moco del banano, el procedimiento es diferente y similar a la primera descripción.

b) DETERMINACIÓN DE PATOGENICIDAD

Una vez realizado el aislamiento a partir del material enfermo en forma de cultivo puro, hacer réplicas,
identificar y proceder a realizar pruebas de patogenicidad para ver si cumple con los postulados de Koch.
Para esta fase, se utilizan PRUEBAS DE INOCULACIÓN. Puede ser rápida como la técnica de
hipersensibilidad en hojas de tabaco donde se determina si una bacteria es fitopatógena o saprofítica, el
resultado es obtenido en aproximadamente cuatro días y es fácil de realizar. También se utilizan plantas
indicadoras o bien la planta hospedera de donde fue aislada la bacteria, en donde son inoculadas las bacterias
aisladas utilizando diferentes métodos de inoculación, consultar Goto (1990) y Orozco et al., (2004).
En la actualidad los métodos moleculares son importantes en la determinación de bacterias y fitopatógenos en
general. Sin embargo, las pruebas morfológicas, bioquímicas y pruebas de patogenicidad, entre otros, son
necesarias para el estudio de bacterias y se fundamentan en la bacteriología clásica.
PRUEBAS PARA DIFERENCIACIÓN PRIMARIA Y RÁPIDA ENTRE LOS GÉNEROS DE
BACTERIAS FITOPATÓGENAS
c) ESTUDIO DE CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DE BACTERIAS Y
FORMACIÓN DE PIGMENTOS
Las características morfológicas de las bacterias son importantes para identificar un género de bacteria. En
relación a la colonia que forma en medio de cultivo, puede ser de borde entero o borde rizoide, micelioide u
otro y ser compacta o translúcida.

Las bacterias fitopatógenas producen pigmentos, algunos de los cuales se manifiestan solamente en medios de
composición especial. Ejemplo, Xanthomonas campestris produce un pigmento amarillo llamado
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xanthomonadina (no es carotenoide). La pigmentación en especies de Clavibacter es variable con la edad,
medio de cultivo y estado nutricional, particularmente con el contenido de vitamina de los medios de cultivo.
Algunas estirpes de Ralstonia solanacearum de diferente biovares, producen coloración amarilla a café en
medio 523, este pigmento parece ser melanina (Orozco, 1997). En el grupo de Pseudomonas se producen
varios pigmentos, el más importante es uno verde, soluble en agua, fluorescente, al que le llaman fluoresceína
bacteriana o pyoverdina. Este pigmento se observa fuertemente bajo la luz ultravioleta de larga longitud de
onda (365 nm).

d) TINCIÓN DE GRAM
Esta es una importante prueba en la identificación de una bacteria desconocida en su respuesta ante la tinción
de gram. Brinda información útil acerca de la forma y tamaño de las células, y la distinción entre bacterias
gram positivas y gram negativas. El resultado de esta tinción es esencial para la decisión sobre los criterios o
procedimientos que deben ser utilizados en la futura identificación del aislamiento bacteriano.
Procedimiento
✓ Distribuya una porción de la masa bacteriana en estudio sobre un portaobjetos, fije y pasándola sobre una
llama.
✓ Añada una gota de la solución de cristal violeta encima de la masa bacteria fijada por 30
segundos.
✓ Lave con agua el portaobjeto eliminando el colorante y posteriormente adicione una gota de la solución
de lugol por 30 segundos.
✓ Lave con agua y aplique etanol al 95% hasta que no salga más colorante.
✓ Adicione una gota de safranina al 1% durante 30 segundos.
✓ Lave con agua y seque. Observe al microscopio usando los aumentos de 10X y 40X y finalmente el lente
de inmersión 100X.

Resultado: las bacterias gram (+) presentan color azul y las gram (-) color rojo.
Existen métodos alternativos para obtener el mismo resultado como el de Cerny (1976, 1978) que depende de
una reacción colorimétrica para la demostración de aminopeptidasa producida por bacterias gram negativas.
Otro método es el de KOH que se describe a continuación.

e) PRUEBA DE ACTIVIDAD PECTOLÍTICA

✓ Lave un tubérculo de papa y desinfeste con alcohol. Haga cortes para obtener rebanadas de + 2 X 3 cm y
0.5 mm de grueso.
✓ Coloque dentro de una placa de petri con papel filtro humedecido en el fondo, 2 rebanadas de papa
encima de porta objetos o soporte. Alternativamente, añada agua destilada estéril o algodón humedecido
dentro de la placa a fin de mantener una cámara húmeda.
✓ En el centro de cada rebanada aplique con ayuda de un asa una pequeña porción de bacteria. Utilice otra
rebanada sin inocular que sirve como testigo.
✓ Efectúe observaciones cada 24 h, observe la consistencia del tejido inoculado.

Resultado: ocurre pudrición blanda con géneros que ocasionan este síntoma se destaca Pectobacterium.
Algunas especies de Pseudomonas grupo fluorescente también lo hacen con menor intensidad.

f) PRUEBA DE CATALASA
A partir del aislamiento obtenido del material enfermo, haga una réplica, con el auxilio de un asa
tome una porción de bacteria, colóquela sobre portaobjetos y adicione dos gotas de H2O2 (peróxido de
hidrógeno).
Resultado: es positivo cuando hay producción de burbujas de gas.

V. CUESTIONARIO
¿Por qué ocurre el proceso de pudrición blanda en tejidos de plantas?
¿Por qué ocurre marchitez en plantas afectadas por R. solanacearum?
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VI. LITERATURA
ALLEN & MEJÍA. 2004. La marchitez bacteriana del tomate causada por Ralstonia solanacearum. In: Métodos moleculares para diagnóstico de
patógenos y mejoramiento para resistencia en vegetales. FAUSAC, 2004.
BEDENDO, I.P. 2011. Bactérias Fitopatógenicas. In: Manual de Fitopatologia. Volume I, Principios y conceitos, Cuarta edición, 704 p.
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