Determinación de proteínas por el método de BCA

Universidad Técnica de Ambato; Facultad de Ciencia e Ingeniería en Alimentos y

Biotecnología

Basantez, Arturo; Bombón, Erika; Castro, Juan; Oñate, Fernanda.

Lunes 15 de junio de 2020

Existen varias técnicas para la cuantificación de proteínas, la mayoría de estos

métodos se fundamentan en la absorción de luz UV, la capacidad de formar complejos
químicos y la propiedad de algunas proteínas de unirse con algunos colorantes. Los
diferentes métodos varían según su nivel de sensibilidad y especificidad. El método de BCA
(ácido bicinconínico) también es conocido como ensayo basado en cobre, es un método del
tipo colorimétrico y se fundamenta en la formación de complejos purpuras. En este método
los iones de Cu2+ presentes en una solución alcalina se reducen tras reaccionar con las
proteínas y forman el ion Cu1+, el mismo que al reaccionar con el BCA formará dicho
complejo púrpura que será medido por UV-VIS para finalmente calcular la concentración de
proteínas. Por tal razón, el presente ensayo tiene como objetivo describir el fundamento del
método para lograr una correcta cuantificación de proteínas por el método BCA.

La concentración de proteínas se determina espectrofotométricamente a una

longitud de onda de 562 nm (Fernández & Galván, 2008). Para obtener la cantidad de
proteínas se elabora una curva de calibrado a partir de un estándar de proteína de
concentración conocida, principalmente se utiliza la albumina sérica bovina (ASB). Este tipo
de cuantificación hace que el método sea rápido y sencillo además que presenta mayor
especificidad frente a otros métodos similares. (Mejía, 2018).

Este método se describe tanto en ensayo estándar (0.1 a 1.0 mg/ml de proteína)
como un microensayo (0.5 a 10 µg /ml de proteína) . A diferencia de otros métodos, el
método de BCA presenta linealidad en un amplio rango de concentraciones de 0 a 1,5
mg/ml, además, es compatible con detergentes no iónicos y otros compuestos que no
interfieren con otros sistemas de cuantificación este kit permite realizar 2500 ensayos en
multiplacas de 96 well, siendo así, este método con mayor tolerancia del reactivo en
combinación con otros, puesto a que la estabilidad del reactivo y el cromóforo resultante
permite el análisis simplificado en un solo paso en comparación con el método de Lowry
(Lemus & Cortez, 2015).

Este método presenta mayor flexibilidad, alta sensibilidad, son más rápidas y
sencillas, muy fiable y baja variación de proteína a proteína durante el análisis, pero en
particular posee complicaciones, es decir el color no es estable con el tiempo para ello se
necesita controlar cuidadosamente el tiempo entre el análisis y la lectura en absorbancia, no
es compatible con azúcares reductores también altas concentraciones de sulfato de amonio
interfieren en la reacción, la muestras deben ser leídas dentro de un lapso de 10 minutos y
la respuesta en la absorbancia no sea lineal (Lemus & Cortez, 2015).

La metodología en si consta de tres pasos principales; la preparación de las

soluciones patrón, la preparación del reactivo de trabajo (preparado al momento a usarse) y
la determinación de las proteínas. De esta manera, PB-L (2016) sugiere utilizar el kit
qPROTEIN(BCA) y seguir el siguiente protocolo:

Se deben preparar soluciones estándar y reactivos, primeramente añadir 2.5 ml del

diluyente a la solución stock (A) tomar en cuenta que no deben utilizar el mismo diluyente
que en ciertas muestras y se debe conservar a temperatura -20°C; a continuación para la
preparación del reactivo del trabajo es recomendable hacerlo al momento de usarlo y se
prepara mediante la mezcla de 50 partes del reactivo (A) con 1 parte del reactivo (B) agitar
suavemente la mezcla hasta obtener una solución verde (PB-L, 2016). Posteriormente, para
la determinación de la concentración proteica se emplea 5 pasos en los que consta añadir
25 µl por well de cada muestra a analizar de la curva de calibración en una placa de 96
well, luego emplear 200 µl del reactivo de trabajo por well, colocar la muestra en la
incubadora a 37°C durante 30 minutos, observar que punto de viraje a violeta según la
concentración de proteínas, dejar enfriar la placa a temperatura ambiente y determinar la
absorbancia a 562 nm con la ayuda de un espectrofotómetro de placa y finalmente con los
resultados obtenidos graficas la absorbancia a 562 nm de la solución patrón en relación a
la concentración siendo así, agregar línea de tendencia para obtener la ecuación de la
curva (PB-L, 2016).

Si, existe interferencias a causa de agentes quelante, ácidos y bases fuertes como:
cisteína, hierro, triptófano, entre otros durante el análisis, lo recomendable remover la
sustancia por diálisis o filtración, también diluir la muestra hasta que la sustancia no
interfiera, precipitar las proteínas de la muestra en soluciones de acetona o ácido
tricloroacético puesto que se está manera se eliminan y la placa con las proteínas se
suspende en agua destilada y procurar aumentar el contenido del reactivo A en la solución
de trabajo si es posible en la proporción del reactivo A:B en 50:2 o 50:3 para eliminar
agente quelante de cobre (PB-L, 2016). Sin embargo, hay que considerar que la
sensibilidad del ensayo se puede aumentar incubando las muestras durante mucho tiempo,
además, si el color se vuelve demasiado oscuro, el calentamiento se puede detener antes,
tomar en cuenta que al igual que el método de Lowry, la respuesta al análisis en el ensayo
de BCA dependen del aminoácido en composición de la proteína, por lo tanto, no puede
obtener una concentración absoluta de proteína determinado y la curva estándar de BSA
solo puede usarse para comparar la relativa de concentración de proteína en soluciones
similares, además, estos errores son corregidos diluyendo las muestras, debido a que la
concentración de proteína permanezca suficientemente alto para ser medible (Walker,
1994).

En conclusión, el método de determinación de proteínas BCA presenta grandes

ventajas como su alta sensibilidad y el tiempo de determinación, siendo ambas cualidades
un resultado del fundamento de la técnica, la misma que se centra en la reacción entre las
proteínas y el ion Cu+2 que se reducirá a Cu+1. En este punto de la experimentación se
puede denotar una relación proporcional entre la cantidad de proteínas existentes en la
muestra y la cantidad de iones de cobre reducidos; es decir, la relación será directamente
proporcional, de esta manera, mientras más iones Cu+1 sean formados, mayor será la
cantidad de complejos formados con las moléculas de BCA y, por tanto, la cantidad de
proteínas determinadas por UV-VIS será mayor y viceversa.

REFERENCIAS:

Fernández, A., & Galván, E. (2008). Métodos para la cuantificación de proteínas.

Universitario de Rabanale.

Lemus, M., & Cortez, L. (2015). Bioquimica General: Fundamentos y analisis de laboratorio.
Universidad Técnica de Machala.

Mejía, L. (2018). Cuantificacion de proteinas.

PB-L. (2016). qPROTEIN (BCA) Kit para cuantificar proteinas totales PB-L Productos Bio-
Lógicos PB-L Productos Bio-Lógicos. http://www.pb-l.com.ar

Walker, J. M. (1994). The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. Methods
in Molecular Biology (Clifton, N.J.), 32, 5–8. https://doi.org/10.1385/1-59259-169-8:11