INFORMES TÉCNICOS BREVES
de ADN Genómico de Alta Calidad de
La sección de Informes Técnicos Breves
de BioFeedback acepta manuscritos con
referencias que describen técnicas o
protocolos de cierta complejidad técnica
y profundidad, pero que pueden ser
demasiado breves para constituir
informes de investigación completos o
revisiones. Escriba al Editor de
BioFeedback, BioTechniques, 154 E.
Central Street, Natick, MA 01760.
Un Método Rápido para la Extracción detergente catiónico desnaturalizante,
dodeciltrimetilamonio bromuro (DTAB),
Sangre Humana Entera en una solución salina concentrada (1 M
de NaCl), con una posterior
precipitación selectiva del ADN
mediante el detergente catiónico
RESUMEN
cetiltrimetilamonio bromuro (CTAB).
Mostramos que el ADN genómico
Se describe un protocolo simple y rápido
obtenido con este método puede
para la purificación de ADN genómico a
utilizarse para todas las aplicaciones
partir de 0.3 ml de sangre humana
relevantes (digestión con enzimas de
entera. La recuperación del ADN es
restricción, PCR, etc.): su calidad y
cuantitativa y reproducible; la calidad es
tal que se puede utilizar para todas las rendimiento son comparables o incluso
técnicas relevantes de biología mejores que todos los demás métodos
molecular. reportados, a pesar de que todo el
procedimiento lleva menos de una hora.
INTRODUCCIÓN
MATERIALES Y MÉTODOS
La difusión de las tecnologías actuales
en genética molecular suele verse Extracción de ADN Genómico de la
obstaculizada por pasos limitantes Sangre
asociados con protocolos complejos y,
Paso 1: Lisis/desnaturalización de la
por lo tanto, laboriosos. Un ejemplo
sangre.
claro es el aislamiento de ADN
genómico de sangre humana entera. Trescientos microlitros de sangre
anticoagulada con EDTA se mezclan con
Los protocolos de rutina en uso
600 µl de "buffer de lisis de sangre" (8%
actualmente requieren al menos un
de DTAB [Sigma Chemical, St. Louis,
aislamiento crudo de leucocitos.
MO]), 1.5 M de NaCl y 100 mM de
Además, después de obtener las
Tris-HCl, pH 8.0.
"preparaciones nucleares" respectivas, la
mayoría de los protocolos (1) implican
largas digestiones con proteinasas
seguidas de extracción con
fenol/cloroformo y diálisis. Debido a las
limitaciones inherentes (se necesitan
muchas manipulaciones cuidadosas de
las muestras), se han desarrollado
métodos alternativos para optimizar la
calidad y el rendimiento del ADN y al
mismo tiempo minimizar el tiempo y el
número de manipulaciones (2,3,6). Estos
métodos se basan generalmente en el uso
de reactivos caotrópicos para lisar
"preparaciones nucleares" derivadas de
"capas de buffy” y generalmente
incorporan pasos de digestión con
proteinasas.
No hemos encontrado referencias a
métodos que comiencen la preparación a
partir de sangre entera, minimizando así
el riesgo de exposición accidental a virus
peligrosos durante los pasos necesarios Figura 1. Electroforesis en gel de
para obtener las preparaciones nucleares. agarosa al 0.8% de ADN genómico. El
ADN genómico humano extraído con el
Aquí describimos un método alternativo
método descrito se digirió con diferentes
basado en un enfoque diferente cuya
enzimas de restricción y se corrió en un
eficacia química ha sido previamente
gel de agarosa TAE al 0.8%: carril 1,
bien establecida para la purificación de
Bg/II; carril 2, EcoRl; carril 3, Mindlll;
ADN derivado de otras fuentes: ADN
carril 4, Psrl; carril 5, Xbal. Los
plasmídico y lambda (4). Para extraer
marcadores de peso molecular son
directamente el ADN de la sangre
DRIgest III de Pharmacia LKB
entera, desde la sangre de ballena,
Biotechnology (M).
hemos introducido el uso de un potente

50 mM EDTA) in a 2-ml Eppendorf
tubey se incuban a 68°C durante 5
minutos en un tubo Eppendorf de 2 ml
(Fremont, CA).
Paso 2: Desproteinización: Luego se
agrega inmediatamente cloroformo (900
μl) y, después de mezclar mediante
inversión (2-3 veces), la muestra se
centrifuga a 10000 rpm durante 2
minutos en una centrífuga de mesa
Eppendorf. Se forma un tapón sólido en
la capa entre la fase orgánica y acuosa,
lo que permite verter la fase acuosa
superior que contiene el ADN genómico
en un nuevo tubo Eppendorf de 2 ml.
Paso 3: Precipitación y resuspensión
del ADN:La muestra está lista para el
paso de precipitación del ADN: se
agregan 900 μl de ddH2O y 100 μl de
CTAB (Sigma Chemical) de una
solución al 5% preparada en 0.4 M de
NaCl. La concentración final de CTAB
será de 0.3%. Después de mezclar
suavemente mediante inversión a
temperatura ambiente, las muestras se
centrifugan a 10000 rpm en una
centrífuga de mesa Eppendorf durante 2
minutos: el pellet de ADN-
Figura 2. Análisis de Southern blot. El
ADN genómico humano, extraído como
se describe, se digirió con diferentes
enzimas de restricción, se corrió en un
gel de agarosa TAE al 0.8%, se transfirió
a una membrana de nailon y se hibridó
con un fragmento del cDNA de la alfa-
antitripsina: carril 1, Bg/II; carril 2,
XhaI; carril 3, MspI; carril 4, PvuII; y
carril 5, HindIII. (La flecha superior es
de 6.7 kb, la flecha del medio es de 3.3
kb y la flecha inferior es de 2.2 kb).
CTAB se resuspende en 300 μl de NaCl
1.2 M para intercambiar el detergente.
Después de la resuspensión del pellet, el
ADN se recupera mediante precipitación
con etanol: se agregan 750 μl de etanol
y, después de mezclar mediante
inversión, las muestras se centrifugan
durante 10 minutos a 10000 rpm (todo a
temperatura ambiente).
El sobrenadante se descarta vertiéndolo,
y el pellet se enjuaga con una solución
de 70% de etanol y 30% de agua.
Después de retirar el lavado con etanol
al 70%, el ADN se disuelve
completamente en 300 µl de TE, pH 7.5
(10 mM de Tris-HCl, pH 7.5; 1 mM de
EDTA) en un plazo de 10 minutos a
55°C o en un volumen inferior.
Análisis de Southern Blot —
Amplificación-secuenciación por PCR
de fragmentos amplificados
Los ADN genómicos se digirieron
utilizando diversas enzimas de
restricción. Después de la electroforesis
durante la noche en gel de agarosa al
Figura 2. Análisis de Southern blot. El
ADN genómico humano, extraído como
se describe, se digirió con diferentes
enzimas de restricción, se corrió en un
gel de agarosa TAE al 0.8%, se transfirió
a una membrana de nailon y se hibridó
con un fragmento del cDNA de la alfa-
antitripsina: carril 1, Bg/II; carril 2,
XhaI; carril 3, MspI; carril 4, PvuII; y
carril 5, HindIII. (La flecha superior es
de 6.7 kb, la flecha del medio es de 3.3
kb y la flecha inferior es de 2.2 kb).
0.8% TAE (Tris-acetato-EDTA), se
realizó la transferencia a una membrana
GeneScreen™ Plus (Du Pont de
Nemours GmbH, Bad Homburg, FRG)
mediante una técnica de transferencia
alcalina (0.4 N de NaOH) (11). La
membrana, después de la neutralización
y un horneado a 80°C durante 2 horas,
se hibridó con un fragmento de cDNA
del gen de alfa-antitripsina marcado con
una actividad específica de 10^8/μg de
ADN utilizando un kit de iniciadores
aleatorios. La hibridación y el lavado se
realizaron según lo descrito (7).
Para amplificar un fragmento específico
del gen de alfa-antitripsina, se utilizaron
las siguientes oligonucleótidos: 5'
d(TGT
CCACGTGAGCCTTGCTCGAGGCCT
GGG) (A1) y 5'
d(GAGACTTGGTATTTTGTTCAATC
ATTAG) (A2), que abarcan las
posiciones 9890 dentro del intrón IV a
10109 dentro del exón V,
respectivamente. Los números de
posición se miden desde el sitio de inicio
de la transcripción propuesto del gen
AAT.
 En conclusión, describimos un nuevo,
rápido y seguro método para extraer
Todo el proceso lleva menos de una hora ADN genómico de sangre entera: este
para obtener ADN completamente método ha sido automatizado
disuelto: el rendimiento de ADN recientemente (5), lo que disminuye el
genómico a partir de 300 µl de sangre tiempo y el trabajo necesarios para
La mezcla de PCR estaba compuesta por
entera es fiablemente constante: 10.5 realizar el diagnóstico de una
1 µg de ADN genómico, 1.25 mM de
(±1.5) µg de ADN. enfermedad genética.
cada desoxinucleósido trifosfato
(dNTP), 10 mM de Tris-HCl, pH 8.3 (a
25°C), 50 mM de KCl, 1.5 mM de
MgCl2, 20 pmol de cada iniciador y 2.5 Mediante electroforesis en gel de campo
unidades de la enzima AmpliTaq™ pulsado, hemos estimado un tamaño
(Perkin-Elmer Cetus, Manza, Italia). La promedio de 250 kb. Este tamaño no
solución se calentó inicialmente a 95°C cambia incluso si el ADN se incuba a
durante 5 minutos, y luego se realizaron 37°C en un buffer de enzimas de
30 ciclos de amplificación: 2 minutos a restricción durante 48 horas o más, lo
94°C, 1 minuto a 60°C, 2 minutos a que indica que está completamente libre
72°C (8). Al final, la muestra se incubó a de endonucleasas contaminantes (datos
72°C durante 12 minutos. Los productos no mostrados).
de PCR se analizaron en un gel de
agarosa al 1.5% utilizando tampón TAE.
La banda recuperada se amplificó en
La calidad del ADN es extremadamente
presencia de 65 pmol del iniciador A1 y
satisfactoria. Su relación promedio O.D.
2 pmol del iniciador A2. Después de esta
260/280 es de 2.0 ± 0.1, considerando
amplificación asimétrica, el ADN de
también que no hay evidencia de ARN
cadena sencilla se recuperó de un gel de
según el análisis de electroforesis en gel.
agarosa de bajo punto de fusión, y se
Se puede utilizar fácilmente para
utilizaron 300 ng para realizar el análisis
cualquier aplicación. La Figura 1
de secuencia utilizando el Kit de
muestra el análisis electroforético en gel
Secuenciación de ADN T7 de Pharmacia
de ADN genómico digerido con diversas
Spa (Milán, Italia) (10).
enzimas de restricción. La Figura 2
RESULTADOS Y DISCUSION muestra el patrón de hibridación
obtenido con el uso de una sonda de
Hemos establecido y optimizado un cDNA de alfa-antitripsina en un análisis
protocolo sencillo para la extracción de de Southern blot de ADN genómico de
ADN genómico a partir de 300 µl de diferentes restricciones. También hemos
sangre entera. El método implica un realizado una amplificación por PCR
primer paso en el que se lisa la sangre utilizando oligonucleótidos específicos
entera con el fuertemente denaturante de alfa-antitripsina en el ADN extraído.
detergente catiónico DTAB en una La Figura 3 muestra un ejemplo del
solución salina concentrada a 68°C fragmento específico generado y su
(paso 1). Este paso de secuencia derivada.
lisis/desnaturalización directa evita así el
riesgo inherente en las manipulaciones
de muestras de sangre no
Hemos analizado la mejor manera de
desnaturalizada, comunes a todos los
almacenar la sangre si la extracción no
demás métodos. El detergente, junto con
puede realizarse con sangre recién
las proteínas desnaturalizadas, se
obtenida. De hecho, el rendimiento de
elimina posteriormente mediante una
ADN disminuye en un 30%-40% si la
extracción con cloroformo (paso 2). Las
sangre se guarda a 4°C durante más de
proteínas desnaturalizadas forman un
cuatro días o si se congela a -20°C sin
tapón sólido en la interfase entre las
ningún tratamiento previo.
fases orgánica y acuosa. Esto permite el
Recomendamos el almacenamiento a -
simple vertido de la fase acuosa, que
20°C después de realizar el paso 1.
contiene el ADN genómico, en un nuevo
Cuando esté listo para completar la
tubo. Este paso, al evitar la aspiración
extracción, la muestra se descongela
con pipeta, mantiene la integridad del
directamente a 68°C y se utiliza para los
ADN, aumenta su recuperación y
pasos posteriores: el rendimiento de
finalmente protege al experimentador de
ADN será entonces exactamente el
la exposición al cloroformo. Después de
mismo que se informa en el método
este paso de preaclarado, el ADN
ininterrumpido.
genómico se precipita selectivamente
mediante la adición de CTAB en una
concentración más baja de NaCl (paso
3).