Manual Del Laboratorio - Microbiologia TP - 2023B

UNIVERSIDAD SANTIAGO DE CALI
FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS

Página 1 de 13
CURSO DE MICROBIOLOGÍA, Código: CN208
PRACTICA # 1: Limpieza, desinfección y esterilización
1. Propósito de la práctica
La limpieza, desinfección y esterilización son procesos importantes para asegurar la calidad
de los resultados en microbiología; ya que la microbiota se encuentra en todas partes,
incluyendo a ambiente que nos rodea.
1. Definiciones según la Organización Mundial de la Salud

• Antimicrobiano: Compuesto que mata los microorganismos o suprime su crecimiento
y proliferación.
• Antiséptico: Sustancia que inhibe el crecimiento y el desarrollo de microorganismos,
pero no necesariamente los mata. Los antisépticos suelen aplicarse a las superficies corporales.
• Biocida: Término general para cualquier sustancia que mate organismos.
• Desinfectante: Sustancia o mezcla de sustancias químicas utilizada para matar
microorganismos, pero no necesariamente esporas. Los desinfectantes suelen aplicarse a
superficies u objetos inanimados.
• Esporicida: Sustancia o mezcla de sustancias químicas utilizadas para matar
microorganismos y esporas.
• Germicida químico: Sustancia o mezcla de sustancias químicas utilizada para matar
microorganismos.
• Microbicida: Sustancia o mezcla de sustancias químicas que mata microorganismos.
Este término se utiliza a menudo en lugar de «biocida», «germicida químico» o
«antimicrobiano».
• Descontaminación: Cualquier proceso utilizado para eliminar o matar
microorganismos.
• Desinfección: Medio físico o químico que permite matar microorganismos, pero no
necesariamente esporas.
• Esterilización: Proceso que mata o elimina todas las clases de microorganismos y
esporas.

Página 2 de 13
2. Limpieza del material de laboratorio

La limpieza es la eliminación de suciedad, materia orgánica y manchas que es requerida para
asegurar los procedimientos de desinfección o esterilización. Incluye el cepillado, la aspiración,
el desempolvado en seco, el lavado o el fregado con paño y agua con jabón o detergente. Existen
métodos físicos o químicos para realizar la limpieza:
• Métodos físicos: Se puede realizar a través de cepillado, aspiración, desempolvado en

seco. Este procedimiento puede generar aerosoles y, por tanto, contaminación en las áreas de
limpieza.
• Métodos químicos: Se realiza a través del lavado con un paño y agua con detergente o
sustancias tensoactivas que permite la eliminación de la materia orgánica, la cual puede
contener microorganismos.
• Detergente: Material diseñado para remover y eliminar la contaminación indeseada de
alguna superficie de algún material
3. Etapas de la limpieza
a. Recoger y desechar los residuos del producto, polvo o cualquier otra suciedad presente
en el lugar a limpiar. Debe identificar el tipo de material a desechar (materia orgánica, cultivos,
reactivos químicos como colorantes, entre muchos otros) y cuál es la manera indicada para
ello.
• Humedecer o lavar con suficiente agua potable el lugar o superficie que se va a limpiar.
• Preparar la solución de detergente que se va a usar.
• Enjabonar la superficie por limpiar, esparciendo la solución de detergente con
esponja o cepillo.
• Estregar la superficie fuertemente con ayuda de un paño o cepillo, eliminando toda
la suciedad posible.
• Dejar la solución de detergente aplicada por un minuto para que este actúe.

Página 3 de 13
• Enjuagar con suficiente agua asegurándose de que todo el detergente se elimine.

• Observar detenidamente el lugar que se limpió para verificar que haya sido
eliminada toda suciedad.
4. Desinfección y esterilización del material de laboratorio

Agentes antimicrobianos físicos: Entre los numerosos agentes físicos que son
antimicrobianos, el calor es el más efectivo y fiable porque puede destruir microbios más
rápidamente en las condiciones adecuadas. Cuando usamos agentes antimicrobianos físicos,
podemos estar seguros de que todas las formas de vida microbiana se destruyen
completamente.
El término esterilización es absoluto; significa destrucción total e irreversible de células

vivas, incluso de las formas resistentes como esporas bacterianas. Un número de agentes
ambientales físicos, tales como ultravioleta o radiación ionizante, ondas ultrasónicas o
sequedad total: ejerce estrés sobre los microorganismos y pueden matarlos, pero no pueden
destruir grandes concentraciones de microorganismos en un cultivo de laboratorio o una
muestra clínica. Incluso pequeños números de microorganismos no puede ser totalmente
destruido cuando se expone a los rayos ultravioleta o se seca o si, por ejemplo, están protegidos
por tejidos contenidos en un paquete quirúrgico limpio.
• Luz ultravioleta: ésta no penetra en la mayoría de las sustancias, incluidos los tejidos
y, por lo tanto, se utiliza principalmente para inactivar microorganismos ubicados en
superficies. En los laboratorios de microbiología, las lámparas ultravioletas se utilizan dentro
de CBS para descontaminar sus superficies, generalmente al final del día.
• Filtración: es otro ejemplo de un método físico de esterilización que se usa para
eliminar bacterias, hongos y sus endosporas del aire o las soluciones. Estas se pueden eliminar
del aire al pasar el aire a través de filtro de partículas de aire una alta eficiencia. (HEPA). Las

Página 4 de 13
soluciones pueden ser esterilizadas pasando el líquido a través de un filtro especial de

nitrocelulosa que tiene un tamaño de poro físico inferior a 0.22 µm. Anteriormente, se
utilizaban filtros con diámetros de 0.45 µm, pero la evidencia de su disminuida capacidad de
retención ante bacterias como Brevundimonas diminuta (anteriormente conocida como
Pseudomonas diminuta), replanteó su aplicación en procesos de esterilización. Los filtros con
poros de 0,2 µm pueden eliminar todos los microorganismos excepto los virus y la bacteria
Mycoplasma spp. La filtración se utiliza para esterilizar soluciones que contienen
macromoléculas biológicas, como enzimas y otras proteínas o antibióticos, los cuales son
inactivados por esterilización a alta temperatura.
• Calor: es un excelente agente de esterilización cuando se aplica a temperaturas
suficientemente altas por un período de tiempo adecuado, porque detiene efectivamente las
actividades celulares. Dependiendo de si está húmedo o seco, el calor puede coagular las
proteínas celulares (pensar en un huevo cocido) u oxidar los componentes celulares (pedazo
de papel en llamas). El calor no es selectivo en sus efectos sobre los microorganismos (otras
células vivas), pero tiene una gran capacidad para destruir todos los materiales, sean vivos o
no.
Agentes antimicrobianos químicos
Cuando la aplicación de calor no es práctica, los agentes químicos son útiles para destruir
microorganismos patógenos. Existe una amplia variedad de agentes químicos que tienen
capacidad de antimicrobianos, los cuales podemos separar en dos clases generales: (1) Aquellos
que son útiles para destruir microorganismos patógenos en el medio ambiente o superficies
inertes (desinfectantes) o en la piel (antisépticos), (2) los que pueden administrarse a pacientes
para el tratamiento de enfermedades infecciosas (agentes antimicrobianos, a menudo llamados
antibióticos). Muchas sustancias antimicrobianas son demasiado tóxicas para ser utilizadas en
la terapia del paciente, pero son valiosos como desinfectantes ambientales.

Página 5 de 13
Cada agente tiene un modo de acción químico limitado, y la actividad frente a los
microorganismos expuestos a ella pueden variar ampliamente en sus respuestas. Algunos
microbios o sus formas pueden sucumbir a sus efectos (como las células bacterianas
vegetativas) mientras que otros no pueden (como las endosporas bacterianas).
2. Objetivos
Conocer los procedimientos de limpieza, desinfección y esterilización que deben aplicarse

en el laboratorio de microbiología para garantizar la inocuidad de los procesos realizados, así
como la seguridad y la confiabilidad de los resultados.
3. Materiales y reactivos por grupo de trabajo
MATERIALES POR GRUPO DE TRABAJO – EFECTO DEL CALOR EN LOS MICROORGANISMOS
• 1 cultivo con 2 mL de Staphylococcus spp. en caldo Tripticasa de Soya (TSB), sembrado

con 20-24 horas de antelación.
• 1 cultivo con 2 mL de Bacillus spp. en TSB, sembrado con 6 días de antelación.
• 4 placas de agar Tripticasa de Soya (TSA)
• 2 mecheros
• 1 plancha de calentamiento
• 2 asas en argolla
• 1 beaker con capacidad para 250 mL
• 1 gradilla

Página 6 de 13
MATERIALES POR GRUPO DE TRABAJO - ESTERILIZACIÓN
• Gaza y algodón para hacer tapones

• 4 cajas de Petri de vidrio
• Papel Kraft, papel de aluminio y cinta testigo
• 1 probeta de 100 µL
• 1 Erlenmeyer de 250 µL
• Pipetas de vidrio de 25 mL, 10 mL, 5 mL y 0,1 ml
• 4 tubos de vidrio con tapa
4. Metodología
EFECTO DEL CALOR EN LOS MICROORGANISMOS
1. PREPARACION DE CONTROL DE CRECIMIENTO
En una placa de TSA, previamente dividida a la mitad y rotulada, se siembra por

agotamiento, en una mitad, Staphylococcus spp. Y, en la otra mitad, Bacillus spp. Esto con el fin
de observar el crecimiento correcto de cada una de las especies que se están empleando en el
experimento (Figura 1).
Figura 1. Preparación del control (Elaborada por Aura Falco).


Página 7 de 13
2. EFECTO DEL CALOR SECO SOBRE LOS MICROORGANISMOS
Con un marcador indeleble, divida una placa de TSA en dos partes.
1. Flamee el asa en el mechero, tome una asada del cultivo de Staphylococcus spp. y
siémbrelo por agotamiento en la primera mitad de la placa. Etiquete esta muestra como: sin
incineración (SI, Fig. 2).
2. Seguidamente, vuelva a flamear el asa en el mechero y tome, nuevamente, un asada del
cultivo de Staphylococcus spp. y flamee nuevamente el asa hasta ignición. Cuando el asa este
fría, siembre por agotamiento en la segunda mitad de la placa. Etiquete esta sección como: con
incineración (CI, Fig. 2).
3. Repita los procedimientos 1 y 2, pero ahora con el cultivo de Bacillus spp.
4. Incubar las placas a 35°C, durante 24 horas.
5. Por favor, anote los resultados en la tabla 1, que se encuentra en la sección
correspondiente a resultados esperados.
Figura 2. Efecto del calor seco sobre los microorganismos (Elaborada por Aura Falco).
3. EFECTO DEL CALOR HÚMEDO SOBRE LOS MICROORGANISMOS

Con un marcador indeleble, divida dos placas de agar nutritivo en cuatro cuadrantes.

Página 8 de 13
1. Etiquete una placa como Staphylococcus spp. y la otra como Bacillus spp. Luego, etiqueta
los cuadrantes en cada placa de la siguiente manera: 5, 10, 15 y 20 minutos (Fig. 3).
Figura 3: Efecto del calor húmedo sobre los microorganismos. Rotulación de las placas.
(Elaborada por Aura Falco).
2. Llene un beaker con agua y colocarlo sobre una plancha de calentamiento encendida.
3. Una vez el agua esté hirviendo, tome el cultivo de Staphylococcus spp. y de Bacillus spp.
y colóquelos en el baño de agua hirviendo.
4. Deje los tubos en agua hirviendo durante 5 minutos. Retire los tubos con cuidado,
asegurándose de que no goteen agua.
5. Enfríe los tubos rápidamente colocándolos bajo agua corriente (fría) y siembre una
asada de cada cultivo en el cuadrante correspondiente a los 5 minutos (Fig. 4).
6. Devuelva los tubos al baño de agua hirviendo durante 5 minutos adicionales y repita el
procedimiento para 15 y 20 minutos.
7. Incubar las placas a 37°C durante 20 horas.
8. Por favor, anote los resultados en la tabla 2, que se encuentra en la sección
correspondiente a resultados esperados.

Página 9 de 13
Figura 4: Efecto del calor húmedo sobre los microorganismos (Elaborada por Aura Falco).
ESTERILIZACIÓN DE MATERIAL DE VIDRIO
Para llevar a cabo la esterilización del material de vidrio debe seguir los pasos que se
describen a continuación.
• Erlenmeyer y probetas
1. Colocar un tapón de algodón envuelto con gaza en la boca del Erlenmeyer y de la
probeta (Fig. 5).
Figura 5: Preparación de Erlenmeyer para esterilización.


Página 10 de 13
2. Cubrir el tapón con una porción de papel de aluminio. No olvide colocar la cinta para
esterilizar o testigo.
NOTA: cuando se utiliza algodón para Erlenmeyer y probetas se debe tomar la precaución de
que éste pueda ser manipulado con facilidad, para ello no debe quedar ni muy apretado, ni muy
flojo y debe alcanzar aproximadamente 3 cm dentro del material de vidrio.
• Pipetas de vidrio
1. Coloca una pequeña torunda de algodón en el extremo superior de la pipeta (Fig. 6).
2. Recorta el papel Kraft en tiras de aproximadamente 10 cm de ancho por el largo que da
el pliego del papel.
3. Envuelve la pipeta con el papel Kraft según las indicaciones del profesor.
4. Marcar externamente el volumen de la pipeta. Por ejemplo: 5 mL, 1 mL, etc. No olvide
colocar la cinta para esterilizar o testigo.
Figura 6. Preparación de pipetas para esterilización.
• Placas de Petri
1. Recorte papel Kraft de acuerdo con el número de placas a envolver (no se recomiendan
más de 4 en cada paquete).
2. Envuelva las placas de Petri con papel Kraft siguiendo las indicaciones del profesor (Fig.
7). No olvide colocar la cinta para esterilizar o testigo.

Página 11 de 13
Figura 7. Preparación de pipetas cajas de Petri para esterilización.
• Tubos de ensayo
1. Coloque las tapas de los tubos de ensayo siguiendo las indicaciones del profesor.
2. Organice los tubos de ensayo en una gradilla destinada para tal fin. No olvide colocar la
cinta para esterilizar o testigo.
Finalmente, todo el material de vidrio que se preparó en la sesión del laboratorio será
esterilizado en una autoclave durante 15 minutos, a 121°C y 15 lb de presión. Es importante
mencionar que una vez que el material sale de la autoclave se debe colocar en una estufa a 70°C,
durante unas horas, para que el material que sale húmedo se seque por completo.
5. Resultados esperados
Para cada sesión del laboratorio el estudiante debe diligenciar las tablas dispuestas para los
resultados esperados (RE) y los resultados obtenidos (RO) en el laboratorio, para poder
discutirlos en clases.
Es importante hacer notar que esta sección “Resultados esperados” debe entregarla en
físico (impresa) al profesor cuando él se lo informe y siguiendo todas sus indicaciones.

Página 12 de 13
Tabla 1. Registro de los resultados del experimento “Efecto del calor seco sobre los
microorganismos”.
Control de Con incineración Sin Incineración
Cultivo crecimiento (CI) (SI)
RE RO RE RO RE RO
Staphylococcus spp.
Bacillus spp.
Además de diligenciar la tabla, debe incluir la explicación microbiológica correspondiente

a los resultados esperados e indicar si coinciden con los resultados obtenidos. De no coincidir,
debe explicar qué ocurrió durante el desarrollo de la metodología.
Tabla 2. Registro de resultados de experimento “Efecto del calor húmedo sobre los
microorganismos”.
Minutos en ebullición
Cultivo 5 10 15 20
RE RO RE RO RE RO RE RO
Staphylococcus spp.
Bacillus spp.


Página 13 de 13
5. Referencias bibliográficas
• https://www.who.int/topics/medical_waste/manual_bioseguridad_laboratorio.pdf.
Manual de bioseguridad en el laboratorio. – 3a ed.
• https://www.cdc.gov/labs/BMBL.html. Biosafety in Microbiological and Biomedical
Laboratories (BMBL) 5th Edition.
• Laboratory manual and workbook in microbiology: applications to patient care. Paul A.
Granato, Josephine A. Morello, Verna Morton. Twelfth edition. | New York, NY: McGraw-Hill
Education.
• http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/10_Prep
_de_material_de_vidrio.pdf
• https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2689620;
• https://www.pda.org/docs/default-source/website-document-
library/chapters/presentations/metro/defining-a-strategy-for-the-validation-and-
qualification-of-sterile-filtration-processes-of-investigational-medicinal-
compounds.pdf?sfvrsn=8
Adriana Correa adriana.correa00@usc.edu.co

Elaborado Luz Dary Caicedo ludcaice@usc.edu.co
E-mail
por: Aura Falco aura.falco00@usc.edu.co
Carlos Andrés Aranaga carlos.aranaga00@usc.edu.co
Revisado
Luisa María Nieto Ramírez E-mail luisa.nieto01@usc.edu.co
por:
Departamento Ciencias Básicas Área Biología

Página 1 de 11
PRACTICA # 2: Medios de cultivo
Los medios de cultivo son sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio
que contienen los nutrientes necesarios para el aislamiento de microorganismos y es una de las
herramientas principales para su identificación. Un medio de cultivo debe estar exento de todo
microorganismo contaminante.
Para que un microorganismo pueda crecer adecuadamente en un medio de cultivo; este debe
cumplir unos requerimientos básicos:
• Disponibilidad de nutrientes adecuados: Los requerimientos mínimos que debe

tener un medio son, carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas. Actualmente, la
forma más extendida de aportar estas sustancias a los medios es utilizar peptona que, además,
representa una fuente fácilmente asequible de nitrógeno y carbono. tienen requerimientos
nutricionales especiales que pueden encontrarse en la sangre, o carbohidratos y sales minerales
como las de calcio, magnesio, manganeso, sodio o potasio y sustancias promotoras del
crecimiento, generalmente de naturaleza vitamínica.
• Consistencia del medio: Partiendo de un medio líquido podemos modificar la
consistencia añadiendo productos como albúmina, gelatina o agar, con lo que podemos obtener
medios en estado semisólido o sólido. Los medios sólidos tienen uso universal, por su
diversidad. Adicionalmente, existen también medios líquidos cuyo uso está ampliamente
extendido en el laboratorio.
• Presencia (o ausencia) de oxígeno y otros gases: Gran cantidad de bacterias pueden
crecer en una atmósfera con tensión de oxígeno normal. Algunas pueden obtener el oxígeno
directamente de variados sustratos. Los microorganismos anaerobios estrictos sólo se podrán
desarrollar en una atmósfera sin oxígeno ambiental.
• Condiciones adecuadas de humedad: Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio
como en el ambiente, son imprescindible para el desarrollo de las células vegetativas
microbianas en los cultivos.

Página 2 de 11
• Luz ambiental: La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la

oscuridad que en presencia de luz solar. Hay excepciones claras como el caso de los
microorganismos fotosintéticos.
• pH: La concentración de iones hidrógeno es vital para el crecimiento de los
microorganismos. La mayoría de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro,
aunque los hay que requieren medios más o menos ácidos.
• Temperatura: Los microorganismos mesófilos crecen de forma óptima a temperaturas
entre 15 y 43ºC; sin embargo, otros microorganismos pueden crecer a temperaturas muy bajas
(psicrófilos) o altas (termófilos).
• Esterilidad del medio: Este es el punto es fundamental, todos los medios de cultivo
deben estar perfectamente estériles para evitar que crezcan formas de vida que puedan alterar,
enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los especímenes
inoculados en dichos medios.
1. CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

A. Según su estado físico
• Medios sólidos
El medio sólido se caracteriza por contener agar (a razón de 15 g/L de medio) o algún
otro agente de solidificación, en su mayoría, inerte (Fig. 8). El medio sólido puede ser utilizado
para el aislamiento de bacterias u hongos y permiten determinar las características de las
colonias del aislado y, en algunos casos, permite además identificar características metabólicas
específicas frente algunos sustratos.

Página 3 de 11
Figura 8. Medios de cultivo sólidos (Tomado de http://www.microplanet-

psl.com/es/productos/control-microbiologico).
• Medios semisólidos
Los medios semisólidos generalmente se preparan con agar a razón de 7 g/L de medio
de cultivo. Son útiles para la determinación de la motilidad bacteriana y para llevar a cabo
estudios con bacteriófagos (virus capaces de infectar bacterias). Un ejemplo de ellos es el medio
swarmming utilizado para identificar este tipo de movilidad en Pseudomonas aeruginosa (Fig.
9).
Figura 9. Agar “swarmming” que permite observar la movilidad de P. aeruginosa.


Página 4 de 11
• Medio líquido (caldo)

Estos medios contienen cantidades específicas de nutrientes que permitirán el
crecimiento de los microorganismos, pero no tienen rastro de agentes gelificantes como la
gelatina o el agar (Fig. 10). El caldo sirve para varios propósitos como: la propagación de un
gran número de organismos, realizar estudios de fermentación, entre otros.
Figura 10. Medios de cultivo líquidos (Tomado de https://www.tiselab.com/home/).
B. Según la finalidad / su uso funcional / su aplicación

Se necesitan muchos medios especiales para facilitar el reconocimiento, la enumeración
y el aislamiento de ciertos tipos de bacterias. Para satisfacer estas necesidades, se disponen de
una gran cantidad de medios de cultivo.
• Medios de propósito general o básicos

Los medios básicos son medios simples que son compatibles con la mayoría de las
bacterias no fastidiosas. El agua peptonada, el caldo y el agar nutritivo se consideran medios
básicos. Estos medios se utilizan generalmente para el aislamiento primario de
microorganismos.
• Medios de enriquecimiento: La adición de nutrientes adicionales como: sangre, suero,

yema de huevo, etc. al medio basal, los hace medios enriquecidos. Los medios enriquecidos se

Página 5 de 11
utilizan para cultivar bacterias exigentes desde el punto de vista nutricional. Agar sangre, agar
chocolate etc. son algunos de los medios enriquecidos. El agar sangre se prepara agregando 5-
10% (en volumen) de sangre a un medio base (Fig. 11).
Figura 11. Medios de enriquecimiento.
• Medios selectivos: Están diseñados para inhibir las bacterias comensales o

contaminantes no deseadas, es decir, ayuda a recuperar el patógeno de una mezcla de bacterias.
Cualquier medio de agar se puede hacer selectivo mediante la adición de ciertos agentes
inhibidores que no afecten al microorganismo de interés. Varios enfoques para hacer un medio
selectivo incluyen la adición de antibióticos, de colorantes o una combinación de estos, entre
otros. A continuación, algunos ejemplos.
• El agar manitol sal (contienen NaCl al 10%) se emplea para recuperar S. aureus.
• El Agar MacConkey se emplea para seleccionar especies bacterianas que forman
parte de la flora intestinal de los animales de sangre caliente como: Escherichia coli, Klebsiella
pneumoniae y Proteus mirabilis, entre muchas otras. Se caracteriza por contener sales biliares
y cristal violeta (un colorante) que inhiben el crecimiento de la mayoría de las bacterias Gram
positivas.
• El Agar cetrimida es utilizado para recuperar Pseudomonas spp. Se caracteriza
por contener cetrimida, el cual es un agente antiséptico.
• El medio Lowenstein Jensen utilizado para recuperar M. tuberculosis se hace

Página 6 de 11
selectivo al incorporar el colorante verde de malaquita.

• Caldos de enriquecimiento: El medio de enriquecimiento se usa para aumentar la
concentración relativa de ciertos microorganismos en el cultivo, antes de colocarlos en un
medio sólido selectivo. Los medios de enriquecimiento son medios líquidos que también sirven
para inhibir los comensales en las muestras clínicas. El caldo selenito F, que contiene
tetrationato y agua con peptona alcalina (APW), se utilizan para recuperar patógenos de
muestras fecales.
• Medios diferenciales: Ciertos medios están diseñados de tal manera que diferentes
bacterias pueden ser reconocidas en base al color de la colonia. Varios enfoques incluyen la
incorporación de colorantes, sustratos metabólicos como carbohidratos, entre otros, de modo
que las bacterias que los utilizan se observan como colonias de diferentes colores. Los medios
diferenciales permiten el crecimiento de más de un microorganismo de interés, pero con
colonias morfológicamente distinguibles. Algunos medios diferenciales pueden clasificarse
también como selectivos. Ejemplos de medios diferenciales incluyen (Fig. 12):
• El agar manitol sal empleado para recuperar S. aureus.
• El Agar MacConkey utilizado para los miembros de la Familia
Enterobacteriaceae.
Figura 12. Ejemplos de medios diferenciales.


Página 7 de 11
• Medios de identificación: Son los destinados a comprobar alguna cualidad específica

que permita reconocer la identidad de un microorganismo. Actualmente existen en el mercado
una gran cantidad de medios específicos de identificación para ciertos microorganismos, con lo
cual se consigue simultáneamente abaratar el costo y reducir el tiempo de la identificación. Son
ejemplos de estos medios, el Chromocult®, que identifica E. coli; o el CAN2 que identifica
diferentes especies de Candida spp. Algunos medios cromogénicos, también son selectivos
porque, además de identificar algunos microorganismos, tienen antibióticos que permiten el
crecimiento de microorganismos con resistencia a ellos, como el medio MRSA que permite la
identificación de Staphylococcus spp resistentes a la meticilina (Fig. 13).
Figura 13. Ejemplos de medios de identificación.
• Medios de conservación: Se utilizan para conservar un aislado/cepa que, por diversas

razones (líneas de producción, investigación), requiera mantenerse viva durante un tiempo
prolongado. En el laboratorio se pueden conservar las cepas de tres formas: haciendo pases
periódicos de placa a placa (se recomienda hacer pocos pases), a través de liofilización,
congelando las cepas a -20 o -70°C, empleando medio Skim milk (a base de leche descremada al
0,1%) o en caldo de cultivo de enriquecimiento suplementado con glicerol (20-30% v/v).

Página 8 de 11
• Medios de transporte: Se usan para el transporte de muestras clínicas o de cepas que

no pueden ser cultivadas inmediatamente. El medio de transporte Cary Blair se utiliza para
transportar heces de pacientes con sospecha de cólera; mientras que el medio de AMIES (sólido
o liquido), se utiliza para muestras para cultivos aerobios o anaerobios y levaduras.
2. Control de calidad de los medios de cultivo

• Control de esterilidad: Se realiza para verificar que los medios de cultivos no
se contaminaron durante su proceso de elaboración y esterilización. Para ello, se toma al azar,
el 10% del lote de las placas y/o de los tubos preparados y se incuban a 37°C, durante 24 a 48
horas.
• Control de calidad: Permite determinar la capacidad del medio para lo que fue
preparado y/o exhibir una respuesta bioquímica típica. Para ello se deben utilizar cepas
control ATCC que aseguren que el medio cumple la condición para lo cual fue preparado.
• Control de caducidad: En el momento de preparar los medios es preciso
anotar de forma visible sobre cada tubo, placa, frasco o matraz, el nombre del medio de
cultivo, fecha de preparación y su fecha de caducidad. De esta forma será fácil llevar un control
de los medios en cuanto a su fecha de caducidad.
2. Objetivos
• Diferenciar algunos medios de cultivo utilizados en el laboratorio de microbiología.
• Utilizar las técnicas necesarias para la buena preparación y conservación de un medio

de cultivo.

Página 9 de 11

• 4 cajas de Petri
• Agar nutritivo (AN), Agar Tripticasa de Soya (TSA) o cualquier otro agar disponible para
realizar esta práctica
• 1 agitador magnético
• 1 mechero
• 1 plancha de calentamiento
• 1 balanza
• 1 espátula
• Papel aluminio
• Barra para retirar magnetos
• 1 pipeta de 10mL estéril
• 1 Erlenmeyer o Boeco de 250 mL
• 1 probeta de 100 mL
4. Metodología
• Pese el medio de cultivo siguiendo las indicaciones del fabricante, es decir, teniendo en
cuenta cuántos gramos del medio se deben pesar para preparar el volumen requerido.
Colocarlo en un Erlenmeyer o Boeco que previamente tenga un poco de agua destilada.
• Agregue el agua destilada hasta el volumen correspondiente y mezcle con el agitador
magnético. Es muy importante que siga las recomendaciones del fabricante debido a que
algunos medios requieren ser calentados antes de ser esterilizados, mientras que otros no.
• Coloque el tapón de algodón y gaza al Erlenmeyer que contiene el medio de cultivo o
cierre el Boeco ajustando la tapa. Recuerde que no debe dejar la fuertemente cerrada.

Página 10 de 11
• Coloque el Erlenmeyer o el Boeco dentro del autoclave y esterilice a 121°C, 15 lb de

presión, durante 15 minutos. Es importante que tenga en cuenta que hay algunos medios de
cultivos que no necesitan ser esterilizados en el autoclave, como, por ejemplo: Chromocult® o
XLD.
• Al finalizar este proceso, deje enfriar el medio hasta que alcance una temperatura de
56°C, aproximadamente. Mientras tanto, proceda a rotular las cajas de Petri con el nombre del
medio preparado, la fecha de preparación y el número del lote.
• Sirva el medio de cultivo en las cajas de Petri. Esto lo puede hacer dentro de una cabina
de bioseguridad, pero no si no cuenta con ella, también lo puede hacer encendiendo un
mechero.
• Cuando el medio esté solidificado, debe someter las cajas a un control de calidad. Para
ello, se selecciona 1 caja por lote y se incuba a 37°C.
• Se debe realizar lectura del control de calidad a las 24 y 48 horas de incubación para
asegurar que no se contaminaron durante el proceso de preparación. Si se encuentra una caja
contaminada, se deben colocar a 37°C todo el lote.
El lote de placas realizadas por cada grupo debe estar libre de contaminación.
• Manual of Clinical Microbiology. 10th edition. Versaloviic J, Carroll KC, Funke G,
Joregesen JH, Landry ML and Warnock DW (ed). Washington DC. ASM Press 2011.
• Procedimientos en microbiología clínica. Sociedad Española de Enfermedades
infecciosas y Microbiología clínica.
• http://www.seimc.org/documentos/protocolos/microbiologia/;
https://microbeonline.com/category/mycology/
• Preparación de Medios de Cultivo: https://www.youtube.com/watch?v=cneascR3OEc.

Página 11 de 11

E-mail
Revisado
Luisa María Nieto Ramírez E-mail luisa.nieto01@usc.edu.co
por:
CURSO DE MICROBIOLOGÍA, Código: CN208 Página 1 de 13
PRACTICA # 3: Diluciones y técnicas de siembra de

microorganismos
1. Estimación del número de células en un cultivo bacteriano: El número de células
de un cultivo puede ser determinado por diferentes métodos, por ejemplo, por densitometría,
utilizando espectrofotómetros o fotocolorímetros; o por recuento directo del número de células
bajo el microscopio de luz, utilizando cámaras de Petroff-Hauser. Con ambos métodos se
realizan contajes de la población total, sin discriminar entre las células viables y las muertas.
Estimar la población de células vivas requiere realizar una titulación o contaje viable. Si el
cultivo original se diluye en forma precisa y, a partir de estas diluciones, se siembran volúmenes
conocidos sobre placas de medio rico, solamente las bacterias viables del cultivo darán origen
a la formación de colonias. Cada bacteria viable que se encuentre en un punto sobre el medio
de cultivo sólido comenzará a multiplicarse sucesivamente, lo que dará lugar a un clon de
células genéticamente relacionadas, llamada colonia.
2. Contaje viable por el método de las diluciones:

En general, para muchos propósitos prácticos se utilizan cultivos bacterianos en fase
exponencial de crecimiento; esto significa que cada mililitro de cultivo contiene alrededor de
200 - 400 millones de células, es decir, entre 2-4 x 108 células/ml. Si de este cultivo se siembran
0,1 ml sobre una placa de medio rico, se estarán colocando entre 20 a 40 millones de bacterias
y esto se reflejará en un crecimiento denso de las células sobre la placa de medio, denominado
césped bacteriano o cultivo masivo, imposible de cuantificar.
Si se realizan diluciones seriadas del cultivo, con factores de dilución conocidos, en cada
dilución, la población disminuirá en forma proporcional a la dilución. Así que, previamente a
sembrar el cultivo, este debe ser diluido en forma seriada. Para establecer una dilución de 1
parte en 10 partes (1/10), se añade, por ejemplo, 1 ml del cultivo original a un tubo de ensayo
que contenga 9 ml de solución salina estéril (0,85%) o de agua peptonada:

microorganismos
𝑉𝑜𝑙 𝑑𝑒 𝑐𝑢𝑙𝑡𝑖𝑣𝑜 1 𝑚𝑙 1
= = = 10−1
𝑉𝑜𝑙 𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 (9 𝑚𝑙 + 1 𝑚𝑙) 10
En esta dilución, el número de bacterias por mililitro será 10 veces menor al del cultivo
original y puede expresarse como 1/10 o 10-1. Si de esta dilución 10-1 se toma 1 ml y lo lleva a
un nuevo tubo con 10 ml de eluyente estéril, habrá efectuado una dilución del cultivo original
de 1/100 (1/10 x 1/10), lo cual es igual a 10-2, así el número de bacterias por mililitro será 100
veces menor con respecto al número original de bacterias (Fig. 14).
Figura 14: Diluciones seriadas
A medida que se realizan diluciones seriadas sucesivas, el número de bacterias

disminuirá hasta un valor tal que, al sembrar sobre una placa de medio, un volumen
determinado, de una dilución particular, dé lugar al crecimiento de un bajo número de colonias,
por ejemplo, de 100 a 300. Estas colonias indicarán el número de células vivas que contenía el
volumen sembrado.
Se puede disminuir el número de pasos de la secuencia de dilución, si se añaden 0,1 ml

del cultivo a un tubo que contenga 9.9 ml de eluyente estéril, se habrá realizado, en un solo paso,
una dilución 1/100, ya que:

microorganismos
𝑉𝑜𝑙 𝑑𝑒 𝑐𝑢𝑙𝑡𝑖𝑣𝑜 0,1 𝑚𝑙 1

= = = 10−2
𝑉𝑜𝑙 𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 (9,9 𝑚𝑙 + 0,1 𝑚𝑙) 100
Si se conoce el volumen de siembra, la dilución efectuada y el número de colonias

surgidas después de la incubación, se puede calcular el título o número de bacterias por mililitro
del cultivo original, aplicando la siguiente fórmula:
UFC 𝐹𝑎𝑟𝑡𝑜𝑟 𝐷𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 × 𝑁ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠

𝑇í𝑡𝑢𝑙𝑜 ( ) =
ml 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑆𝑖𝑒𝑚𝑏𝑟𝑎
Por ejemplo: al realizar dos siembras de la dilución 10-5 se obtienen los siguientes resultados:
Factor de Volumen de Número Título

Dilución siembra de colonias (UFC/ml)
105 x 200 col.
105 0,1 ml 200 = 2 x 108
0,1 ml
105 0,05 100 105 x 100 col.
= 2 x 108
0,05 ml
3. TÉCNICA DE SIEMBRA DE MICROORGANISMOS

Para efectuar el estudio de los microorganismos se han diseñado diversos métodos que
permiten cultivarlos bajo condiciones artificiales, en los que es posible cultivarlos bajo
condiciones experimentales y manejar un solo tipo de microorganismo. Una de las técnicas más

microorganismos
utilizadas en el laboratorio de microbiología consiste en trasladar una muestra microbiológica

de un ambiente determinado a un medio de cultivo, lo que permite obtener cultivos
microbianos. La aplicación de estos procedimientos ha permitido propagar a los
microorganismos en cultivos mixtos, así como su aislamiento y la obtención de cultivos puros
(axénicos), facilitando de este modo, la caracterización, aplicación y control de estos. La forma
de sembrarlos y cultivarlos depende del tipo de microorganismo y propósito específico del
estudio.
Cultivar un microorganismo significa promover intencionalmente el desarrollo de éste en

medios de cultivo y bajo condiciones de laboratorio controladas. La población de
microorganismos que crece en un medio se llama cultivo. Cuando éste contiene una sola
especie de microorganismo, se denomina cultivo puro o axénico, cuando contiene más de una
especie de microorganismos se denomina cultivo mixto. Un cultivo axénico o puro consiste en
una sola especie microbiana, que proveniente de una sola célula. Los cultivos axénicos o puros
son muy raros en la naturaleza. En los medios naturales, por ejemplo, en el suelo, en el agua o
en el cuerpo humano, existe microbiota (poblaciones mixtas). Al colocar estas muestras en un
medio de cultivo, se pueden encontrar diferentes microorganismos (hongos/bacterias)
clasificando este cultivo como mixto.
Técnicas de siembra
1. El método de siembra por agotamiento o por estrías
Es el método más fácil y el más usado para obtener cultivos axénicos (puros). Para ello, con
un asa de siembra, se toma una muestra de la población mixta y a continuación se hacen estrías
sobre la superficie de un medio sólido preparado en una placa de Petri. A medida que se van
haciendo estrías en zigzags con el asa, se van depositando menos microorganismos en la
superficie del medio. A continuación, se flamea el asa, se toca en la región donde se han
realizado las últimas estrías y se continúa la siembra con la misma técnica, en la superficie de

microorganismos
medio sin sembrar aún. Repitiendo este proceso varias veces se logra separar células
individuales y, que después del periodo de incubación, se observen colonias aisladas (Fig. 15).
A continuación, las placas se incuban a la temperatura adecuada, permitiendo que las

células aisladas experimenten un número suficiente de divisiones para formar colonias visibles.
Aunque cada colonia posiblemente representa un clon derivado de una sola célula, no podemos
asegurarlo. Quizás, dos células quedaron depositadas tan juntas que han originado una única
colonia mixta. Por tanto, para asegurarnos de que hemos obtenido un cultivo axénico, conviene
repetir el procedimiento a partir de una colonia bien aislada en la primera placa. Las colonias
que se desarrollen la segunda vez serán, casi con toda seguridad, cultivos axénicos.
2. Los métodos de siembra por profundidad y en superficie
Estas técnicas se emplean cuando la muestra contiene tantos microorganismos, que la

siembra no se puede realizar en una sola etapa y, por tanto, requiere de diluciones previas
(diluciones seriadas). Luego, a partir de esas diluciones, se realizan las siembras.
Figura 15: Siembra por estría en placa o agotamiento (Tomado de: Clinical microbiology
procedures Handbook. Fourth edition).

microorganismos
a. Siembra por profundidad: Las muestras diluidas se mezclan con agar fundido y se
vierten en la placa. Algunas colonias quedarán embebidas en el agar y otras crecerán en la
superficie. Las colonias superficiales se extenderán y serán más grandes. Generalmente, lo que
se hace es que, a partir de un cultivo en medio líquido o, de una suspensión bacteriana, se
realizan diluciones seriadas. (10-1 ,10-2 ,10-3). Luego, se toma una alícuota (generalmente es 1
ml) de la última dilución y se vierte en una placa de Petri a la que luego, se le agrega agar fundido
(~56°C). Las cajas de Petri se deben incubar a la temperatura y las condiciones requeridas.
Después de la incubación, se desarrollan colonias en el agar (más pequeñas) y en su superficie
(más grandes).
b. Siembra en superficie: Las muestras diluidas se siembran directamente en la

superficie de la placa de agar, extendiéndolas con ayuda de un asa de Diralsky o rastrillo de
vidrio estéril. La suspensión se absorbe en el agar, dejando las células microbianas sobre la
superficie. En ambas técnicas las placas se incuban a la temperatura y el tiempo adecuado, es
decir, hasta que se observe el crecimiento de colonias.
3. Medios inclinados
Este tipo de cultivo es empleado para mantener cepas a mediano plazo para realizar
pruebas adicionales posteriores o para la realización de pruebas bioquímicas para
identificación de microorganismos. Se requiere práctica y siempre debe hacerse cerca del
mechero Bunsen. El cuello del tubo o del frasco debe ser flameado antes de recubrirlo o de
volver a colocar la tapa.
4. Cultivos por punción

Este tipo de cultivo también es empleado con frecuencia para realizar pruebas bioquímicas
que permiten la identificación de microorganismos, aunque también puede usarse para el

microorganismos
mantenimiento a mediano plazo de aislados y/o cepas. Se requiere para ello un asa recta y
siempre debe hacerse cerca del mechero Bunsen. El cuello del tubo o del frasco debe ser
flameado antes de recubrirlo o de volver a colocar la tapa.
5. Conservación de los cultivos axénicos

Los aislados puros pueden ser mantenidos por diferentes períodos de tiempo para estudios
posteriores. Este proceso se realiza especialmente con fines de investigación, proceso en el cual
se genera un biobanco o banco de cepas. Por reglamentación nacional, los biobancos deben ser
registrados en el Instituto Humboldt. También existen bancos de cepas comerciales que
cuentan con cepas caracterizadas microbiológica y molecularmente y que son utilizadas como
control de calidad de todos los procesos microbiológicos.
Existen muchas técnicas de mantenimiento de los cultivos puros, pero casi todas consisten
en una desecación (eliminación del agua) o en un almacenamiento a baja temperatura.
a. Liofilización: Es un proceso de desecación a partir de un cultivo líquido. El cultivo

líquido se vierte en un pequeño vial o ampolla de vidrio y se añade leche descremada o Skin
milk, para proteger las células durante el proceso. La mezcla se congela en hielo seco y se
expone al vació para su sublimación (eliminación del agua congelada). Durante el proceso de
sublimación las células permanecen congeladas. Posteriormente se procede al sellado de los
viales, mientras aún se mantiene el vacío. Los cultivos liofilizados se almacenan a temperatura
ambiente.

microorganismos
b. Congelación en nitrógeno líquido: Para almacenar un cultivo empleando bajas

temperaturas, se utiliza como sustancia protectora dimetilsulfóxido (DMSO).
c. Congelación entre -20 y -80°C: Se utilizan como sustancias protectoras, la leche

descremada o glicerol (20-30%) en caldo de enriquecimiento (TSB o BHI). Se guardan en
crioviales o viales de polipropileno.
2. Objetivos
• Conocer uno de los métodos para evaluar poblaciones bacterianas: el contaje viable.
• Adquirir destrezas en diferentes técnicas de siembra, dependiendo del tipo del medio de
cultivo y de la finalidad de dicha siembra.

• Un cultivo en TSB de: Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella
pneumoniae y Staphylococcus aureus
• Una caja de agar MacConkey (MK) sembrada con la cepa de E. coli ATCC 25922.
• Una caja de agar MK, de agar Chromocult (CH) y de agar manitol salado (AMS).
• Seis (6) cajas de ATS
• Un boeco con 50 ml de AN mantenido a 60°C
• Dos tubos con 9 mL de solución salina (SS, 0,85%) y dos tubos con 9,9 mL de SS (0,85%).
• 2 asas en argolla
• 2 mecheros
• 1 gradilla
• 1 baño de María
• Una pipeta automática de 1000 µL y una de 100 µL

microorganismos
• Puntas para pipeta automáticas de 1000 µL y de 100 µL estériles.

• Un asa de Diralsky o rastrillo de vidrio
• Un beacker de 100 ml que contenga 5 ml de alcohol para quemar.
4. Metodología
1. Procedimiento para sembrar por agotamiento

a. A partir de medio sólido: De la placa con agar MK sembrada con E. coli, picar una
colonia y sembrarla por agotamiento en ATS. Para ello, debe esterilizar el asa de siembra con
calor seco, enfriarla colocándola cerca del mechero o en un borde del agar, para luego hacer
estrías sobre la superficie del ATS (Fig. 15), quemando el asa en cada nueva zona de estrías para
así asilar colonias. Incubar a 37°C durante 24 horas.
b. A partir del medio líquido: A partir de un cultivo líquido y, usando el asa, debe
sembrar el cultivo de cada una de las especies bacterianas en agar MK, TSA y CH, AMS siguiendo
las indicaciones de la figura 14. Para ello, debe esterilizar un asa de siembra con calor seco,
enfriar el asa al lado del mechero o en un borde limpio del agar, para luego hacer estrías sobre
la superficie del AN (Fig. 15), quemando el asa en cada nueva zona de estrías para así asilar
colonias. Incubar a 37°C por 24 horas las placas de MK, TSA y CH y AMS durante 48 horas.
2. Procedimiento para sembrar por profundidad

A partir de una suspensión bacteriana, realizar diluciones (10-1, 10-3, 10-5 y 10-6) en SS
(0,85%) estéril. Tomar 1 mL de la 10-6 y colocarlo en una placa de Petri vacía (Fig. 16). Agregar
20 ml de agar nutritivo en forma líquida mantenido a 60°C y mezclar, cubriendo toda la
superficie del cultivo inicial. Incubar a 37°C durante 20 horas. Revisar los resultados para
realizar el recuento de colonias y calcular el título bacteriano (UFC/ml).

microorganismos
Figura 16. Esquema de diluciones seriadas para sembrar por profundidad (Realizado por A.
Falco)
3. Procedimiento para en el método de siembra en superficie:

Tomar 100 µL de la dilución 10-5 preparada anteriormente y con un asa de Diralsky o
rastrillo, extender la suspensión en AN. Incubar a 37°C por 24 horas. Repetir el procedimiento
sembrando 50 µL. Revisar los resultados y realizar recuento de colonias. y calcular el título
bacteriano (Fig. 17).
Figura 17. Esquema de diluciones seriadas para la siembra en superficie (Realizado por A.
Falco).

microorganismos
Tabla 3. Registro de los resultados del experimento “Siembra por agotamiento” partiendo de
medio sólido y de medio líquido.
Siembra por agotamiento

De sólido a
De líquido a sólido
sólido
Cultivo
RE RO
RE RO
TSA MK CH AMS TSA MK CH AMS
E. coli
P. aeruginosa
K. pneumoniae
S. aureus


microorganismos
Tabla 4. Registro de resultados de experimento “Siembra en profundidad y por superficie” de

un cultivo de E. coli.
Número de Factor de Vol. Promedio

Título
colonias dilución siembra del Título
Profundidad
– Placa 1
Profundidad
– Placa 2
Superficie
– Placa 1
Superficie
– Placa 2

Joregesen JH, Landry ML and Warnock DW (ed). Whasington DC. ASM Press 2011.
• Laboratory Manual and Workbook in Microbiology. Twelfth edition. Granato Paul A;
Morello Josephine A; Morton Verna. New York: McGraw-Hill Education, 2019.
• Clinical Microbiology Procedures Handbook. Fourth edition. Amy L. Leber. Whasington
DC. ASM Press, 2016.

microorganismos

E-mail
Revisado por: Luisa María Nieto Ramírez E-mail luisa.nieto01@usc.edu.co
PRACTICA # 4: Características macroscópicas de bacterias y

Tinción Gram
Características macroscópicas de bacterias
Para la identificación correcta de los microorganismos, el primer paso es determinar las

características del cultivo. Para ello, se debe proveer el medio de cultivo con los nutrientes
adecuados para su desarrollo (como componentes proteicos, carbohidratos, minerales,
vitaminas y humedad). Aunque los caldos de enriquecimiento proporcionan los nutrientes
suficientes para el crecimiento de la mayoría de las bacterias, los medios de cultivo sólidos son
esenciales para poder aislar y separar las bacterias; ya sea que provengan de muestras con más
de una población (cultivos mixtos), como, por ejemplo, una muestra de esputo o una muestra
de suelo o, muestras de las que se espera el crecimiento de un solo tipo de microorganismo
(cultivo puro), como la sangre. Cuando una mezcla de bacterias es sembrada por agotamiento
(estrías) en una placa de agar, la muestra se diluye para que las células bacterianas individuales
se puedan depositar en ciertas áreas de la placa. Estas células individuales se multiplican hasta
que se forma un agregado llamado colonia. Cada colonia representa el crecimiento de una
especie bacteria. Una sola colonia podrá ser transferida a otro medio, donde se podrá obtener
un cultivo puro. Las placas estriadas son fundamentales en el laboratorio porque permiten
determinar cuántos tipos de microorganismos (bacterias u hongos) están presentes.
Las características de las colonias en medios de cultivo pueden ser características para cada
especie. La observación de esas características como color, textura, superficie, forma y tamaño
podrían proporcionar información sobre la identidad de un organismo particular. Sin
embargo, la identificación final no puede realizarse solo por la morfología de la colonia.
A continuación, se presentan algunas de las características que se pueden observar tanto en
bacterias (Fig. 18). como en hongos.

Tinción Gram
Característica de la morfología de las colonias bacteriana.
I. TAMAÑO
1. Grande
2. Mediana
3. Pequeña
4. Puntiforme
II. FORMA, BORDES Y ELEVACIÓN:
1. Superficie
2. Lisa
3. Rugosa
III. CONSISTENCIA:
1. Blanda
2. Dura
3. Mucoide
IV. ASPECTO
1. Brillante u opaco
2. Mate o translúcida
VI PIGMENTO (Se observan en medios como agar nutritivo o agar sangre)
1. Amarillo
2. Rojo
3. Verde
VII HEMÓLISIS (Se observa solo en agar sangre)
1. Parcial (alfa)
2. Total (beta)
3. No hemolítica

Tinción Gram
Figura 18: Característica de la morfología de las colonias bacteriana (Tomado de

http://projectomartin.blogspot.com/2012/12/practica-8_9.html)
Tinciones
Las tinciones en microbiología son las primeras herramientas que se utilizan en el

laboratorio para el diagnóstico de las enfermedades infecciosas. Existe gran variedad de
tinciones desarrolladas para la detección de los diferentes agentes infecciosos en los que se
incluyen bacterias, parásitos y hongos.
Para hacer tinciones se necesitan colorantes, los cuales son compuestos orgánicos o
inorgánicos que tienen la capacidad de colorear. Químicamente, el colorante está constituido
por un componente cromóforo y un auxócromo. El cromóforo es un compuesto orgánico
responsable de la absorción selectiva de la luz y que transmite un color determinado, mientras
que los auxócromos son grupos cargados positivamente que intensifican una sustancia o
cromóforo en la síntesis de colorantes.

Tinción Gram
1. Clasificación de los colorantes
a. Según su comportamiento químico
Ácidos o Aniónicos (-): la carga del radical (cromóforo) es negativa. Corresponden

fundamentalmente a colorantes citoplasmáticos, ya que los citoplasmas de las células se
consideran básicos, captando muy bien los colorantes ácidos. Ejemplo: Las eosinas y las
auraminas.
Básicos o Catiónicos (+): la carga del ion cromóforo es positiva. Corresponden a colorantes
que tiñen estructuras nucleares o similares, que son acidas, es decir, cargadas negativamente.
Ejemplos: Fucsina básica, cristal violeta o violeta de Genciana y azul de Metileno.
Neutros: Son sales compuestas de un colorante ácido y un colorante básico, por ejemplo,
el eosinato azul de Metileno que, en general, posee propiedades de colorante ácido y básico.
b. Según la estructura que el colorante tiñe:

Tinción simple: Se hacen empleando un solo colorante y, por lo general, se usan para resaltar
las características morfológicas más marcadas de la célula bacteriana; el valor de esta clase de tinción
es su simplicidad y facilidad de empleo. Un ejemplo de ellas es la coloración con azul de metileno
(+). El color reside en el ion azul de metileno cargado positivamente. Las células bacterianas tienen
una carga negativa débil cuando el pH del medio externo está cerca de la neutralidad que es lo que
generalmente ocurre. La célula bacteriana cargada negativamente se combina con el ion azul de
metileno cargado positivamente, con lo cual se tiñe la bacteria. Las diferencias en las cargas dan lugar
a una afinidad entre el colorante y la célula bacteriana.

Tinción Gram
Tinción diferencial: Se usan dos o más colorantes y uno de ellos sirve de contraste. Se
denominan diferenciales porque discriminan ciertas características y permiten agrupar a los
microorganismos. Ejemplos: Coloración de Gram y Coloración de Ziehl Neelsen.
La coloración de Gram es uno de los procedimientos más importantes y utilizados en la

caracterización de las bacterias. Esta técnica está basada en la habilidad de las bacterias para retener
el cristal violeta, después de ser sometidas a la decoloración con alcohol. Las bacterias que retienen
el cristal violeta se denominan Gram positivas y se observan de color morado o violetas, mientras
que las que se decoloran, se tiñen con el colorante de contraste, safranina, y se observan de color rojo
o rosado. En la coloración de Gram se utilizan cuatro soluciones:
1. Cristal violeta, como colorante básico.
2. Lugol, como mordiente, es decir, fija el colorante primario.
3. Alcohol-acetona, que remueve el colorante básico, si no ha quedado bien fijado.
4. Safranina, como colorante de contraste, que colorea las células decoloradas con el alcohol-
acetona.
Tinción especial: Se usa para resaltar características o estructuras específicas tales

como: cápsulas, flagelos, esporas. Los mordientes son necesarios para la tinción de ciertas
estructuras especiales como cápsulas, flagelos y paredes celulares que tienen poca afinidad por
los colorantes. El proceso consiste en el tratamiento de las células antes, después o durante la
tinción con sustancias que tienen afinidad por el material celular y por la tinción y unen a
ambas. El proceso de tinción supone una reacción de intercambio de iones entre el colorante y
los sitios activos de la superficie o del interior de la célula, de tal forma que, los iones teñidos
del colorante reemplazan los iones de los componentes celulares.

Tinción Gram
Detección de microorganismos ácido alcohol resistentes empleando la coloración

de Ziehl Neelsen
La tinción de Ziehl-Neelsen es la técnica utilizada en el diagnóstico rutinario de

bacterias denominadas acido alcohol resistentes, entre las cuales la más importante, es el bacilo
causante de la tuberculosis. El agente etiológico de la tuberculosis fue descrito por Robert Koch,
pero fueron los trabajos de Paul Ehrlich, los que identificaron la resistencia a la decoloración
por alcohol-ácido, mientras que las últimas modificaciones a la tinción fueron realizadas por
Franz Ziehl y Karl Adolf Neelsen.
El género Mycobacterium es el único miembro en la Familia Mycobacteriaceae. La pared

celular de las micobacterias es extremadamente compleja en cuanto a su composición
bioquímica y está compuesta por ácidos micólicos (70-90 número de átomos de carbono) junto
con lípidos libres (ej. trealosa-6,6´-dimicolato) que proveen a la célula de una barrera
hidrofóbica. El bacilo de la tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis, es resistente a los ácidos
y se tiñe de rosado con la coloración de Ziehl Neelsen con la fucsina fenicada (Fig. 19). No se
pueden decolorar por medio de ácidos o etanol. Es una técnica de tinción diferencial que se basa
en que las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen estos ácidos micólicos.
La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese
la pared bacteriana que contiene ceras.
Figura 19: Bacilos acido alcohol resistentes (Tomado de

https://fiestadelosmicroorganismos.wordpress.com/2016/12/15/practica-10-tincion-de-
ziehl-neelsen/)

Tinción Gram
2. Objetivos
• Definir las características de la morfología de las colonias y la diferencia entre cultivos
axénicos y mixtos.
• Preparación de frotis directos.
• Realizar coloraciones: simples y diferenciales
• Interpretar y evaluar correctamente los resultados obtenidos en las distintas
coloraciones.
Características macroscópicas de bacterias
• Cajas de agar nutritivo con cepas ATCC 25922 (E. coli), 27853 (P. aeruginosa), 25923 (S.
aureus), Bacillus spp., 4352 (K. pneumoniae).
• Cajas de agar MK, agar Chromocult, agar manitol salado, agar cetrimide en las que se
encuentran sembradas las especies: ATCC 25922 (E. coli), 27853 (P. aeruginosa), 25923 (S.
aureus), Bacillus spp., 4352 (K. pneumoniae).
Tinción Gram
• Caja de portaobjetos y de cubreobjetos
• 1 gotero con azul de metileno
• 1 batería de coloración de Gram: Cristal violeta, lugol, alcohol-acetona, safranina.
• 2 asas en aro
• 2 mecheros
• 1 gotero con solución SS estéril (0,85%)
• 1 gotero con aceite de inmersión
• 2 microscopios

Tinción Gram
4. Metodología
1. Procedimiento para determinar las características macroscópicas de las

bacterias
A partir de los cultivos entregados a cada grupo, describir y dibujar las características
morfológicas de cada microorganismo, de acuerdo con el cuadro que observa en la sección de
“Resultados esperados”.
2. Procedimiento para realizar la Tinción Gram

1. Preparación de frotis o directos.
a. Directo a partir de medio líquido: Realice los pasos del 1 al 7 de la Fig. 20.
Figura 20: Realización de extendidos a partir de cultivo líquido.


Tinción Gram
b. Directos a partir de colonia. Realice los pasos del 1 al 7 de la Fig. 21.
Figura 21: Realización de extendido a partir de colonia.
2. Realización de la coloración diferencial: Tinción de Gram

• Cubrir su frotis con una gota de cristal violeta durante un minuto
• Lavar el exceso de colorante con agua, empleando un frasco lavador
• Agregar una gota de lugol durante un minuto
• Lavar con agua y secar rápidamente
• Decolorar por de 7 a 8 segundos con la mezcla alcohol-acetona
• Lavar y dejar secar
• Agregar una gota de safranina y dejarla actuar durante 30 segundos
• Lavar con agua y dejar secar
• Observar al microscopio con objetivo de 40X para enfocar, y luego, con objetivo de
100X con aceite de inmersión.

Tinción Gram
Tabla 5. Registro de los resultados de las “Características macroscópicas de bacterias y tinción

Gram”.
Nombre de la
especie Características macroscópicas Forma al microscopio
bacteriana
Gram:
Color:
Forma:
Borde:
Elevación:


Tinción Gram
• Clinical Microbiology Procedures Handbook. Fourth edition. Amy L. Leber.
Whasington DC. ASM Press, 2016.
• Koneman’s Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology. 7th edition. Gary W.
Procop, Deirdre L. Church, Geraldine S. Hall, William M. Janda, Elmer W. Koneman, Paul C.
Schreckenberger, Gail L. Woods. Philadelphia: Wolters Kluwer Health, 2017.
• Clinical Microbiology Procedures Handbook. Fourth edition. Amy L. Leber.
Whasington DC. ASM Press, 2016.
• Koneman’s Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology. 7th edition. Gary W.
Procop, Deirdre L. Church, Geraldine S. Hall, William M. Janda, Elmer W. Koneman, Paul C.
Schreckenberger, Gail L. Woods. Philadelphia: Wolters Kluwer Health, 2017.

E-mail

Página 1 de 10
PRACTICA # 5: Pruebas de identificación bacteriana
Las pruebas de identificación y susceptibilidad son utilizadas para
identificar/tipificar los microorganismos y su respuesta a antimicrobianos.
Tradicionalmente, la identificación de bacterias y hongos se han basado en el examen
de la morfología de la colonia y, en bacterias, se ha utilizado la realización de pruebas
bioquímicas en tubos de ensayo. Estos métodos continúan utilizándose en muchos
laboratorios de microbiología, pero requieren mucho tiempo y trabajo. Adicionalmente,
las pruebas bioquímicas en tubo dependen de interpretaciones subjetivas y, los
resultados finales, están disponibles entre 24 a 48 horas.
Actualmente, estas metodologías han comenzado a ser desplazadas en gran medida

por el uso de instrumentos automatizadas que no solo permiten identificar bacterias y
levaduras de una forma rápida y confiable, sino que también proporcionan resultados
de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana para cada organismo identificado.
Para entender un poco la dinámica de las metodologías más utilizadas para realizar
las pruebas de identificación, se presentarán a continuación los métodos más utilizados
y aceptados para su estudio.
METODOS DE IDENTIFICACION - Métodos fenotípicos
Además de las características macro y microscópicas de las colonias; las pruebas

bioquímicas son las más utilizadas convencionalmente, ya sea para identificación manual o
automatizada. Estas pruebas utilizan las características metabólicas de las bacterias para poder
identificarlas. Se encuentran disponibles alrededor de 48 procedimientos bioquímicos claves
para la identificación de bacterias Gram positivas y Gram negativas. Las pruebas de
identificación se pueden agrupar en:

Página 2 de 10
Identificación preliminar y con lectura inmediata: Son pruebas que generan

resultados inmediatos, algunos ejemplos son las pruebas de catalasa y oxidasa.
1. Prueba de la catalasa: Utilizada especialmente para bacterias Gram positivas.

El peróxido de hidrógeno es el producto final del metabolismo oxidativo de
carbohidratos, la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias
facultativas, exceptuando a Streptococcus spp., producen una
enzima llamada catalasa que degrada el peróxido de hidrógeno obteniendo
agua y oxígeno. El principio de esta prueba es que la enzima catalasa reacciona con
peróxido de hidrógeno para formar agua y oxígeno - las burbujas observadas son
oxígeno (figura 22).
Figura 22. Tomado de: http://microbitosblog.com/2011/09/27/pruebas-bioquimicas
2. Pruebas bioquímicas: Entre ellas las más utilizadas son:

a. Triple sugar iron agar (TSI): La fermentación es un proceso
metabólico en el cual un sustrato orgánico sirve como el hidrógeno final aceptor en lugar
de oxígeno. El medio TSI es uno de los más utilizados para la determinación de esta
reacción oxidativa, la cual se puede observarse en la parte superior del tubo y la
fermentación en el fondo del tubo. Los fermentadores generan un color amarillo en el

Página 3 de 10
medio, mientras que los no fermentadores general alcalinización del medio. El indicador
de color utilizado para este medio es azul de bromotimol.
b. Citrato: El agar citrato se usa para identificar si el organismo tiene la
capacidad de utilizar el citrato como fuente de energía. El medio contiene citrato como
única fuente de carbono y sales de amonio inorgánico como la única fuente de nitrógeno.
El crecimiento es indicativo de la utilización de citrato, un metabolito intermedio en el
ciclo de Krebs. Cuando la bacteria metaboliza citrato, las sales de amonio se rompen y
generan amoníaco, que aumenta la alcalinidad. El cambio en el pH convierte el indicador
azul de bromotimol del medio de verde a azul reacción que realiza por encima de pH
7.6.
c. Urea: Medio de urea, ya sea un caldo o agar, contiene urea y el indicador
de pH es rojo de fenol. Muchos organismos, especialmente aquellos que infectar el tracto
urinario, tienen una enzima ureasa, que es capaz de hidrolizar la urea en presencia de
agua para liberar dos moléculas de amoníaco y dióxido de carbono. El amoniaco se
combina con el dióxido de carbono y agua para formar carbonato de amonio, que
convierte el medio alcalino, girando el indicador de su naranja original a color amarillo
a rosa brillante.
d. Lisina (Lisina hierro azúcar): El medio se usa para detectar si un
organismo tiene la capacidad de descarboxilar o hidrolizar un aminoácido, formando
una amina que produce un pH alcalino. El medio basal contiene peptonas de carne y
extracto de levadura, que suministran nutrientes nitrogenados para apoyar el
crecimiento bacteriano. Esto permite identificar las enzimas descarboxilasa y
deaminasa. La glucosa es el carbohidrato fermentable. Los indicadores de pH son
púrpuras de bromocresol y rojo cresol.
e. MIO (movilidad, indol y ornitina descarboxilasa): En este medio se
puede observar la movilidad de algunas bacterias, adicionalmente, el medio contiene
tripteína que aporta triptófano sustrato de la enzima triptofanasa, sustrato del indol que

Página 4 de 10
puede ser revelado con el reactivo de Kovacs. La glucosa es el hidrato de carbono

fermentable, la ornitina es el sustrato para la enzima ornitina descarboxilasa y el
purpura de bromocresol es el indicador de pH.
Métodos moleculares
Basados en técnicas de amplificación del ácido nucleico
Existen metodologías que permiten la amplificación de ácidos nucleicos que

permiten identificar los microorganismos. Dentro de estas técnicas la más utilizada se
llama reacción en cadena de la polimerasa o PCR. En este método, la muestra se calienta
para separar el ADN microbiano (en el caso de microorganismos ARN se requiere un
paso adicional de transcripción reversa). Un segmento diana es específicamente
amplificado y copiado de forma exponencial por repetición de ciclos con diferentes
periodos de temperatura de incubación en presencia de una enzima ADN polimerasa. A
partir de ello se obtiene millones de copias de la secuencia diana. Es una técnica
específica, rápida, sensible, versátil.
MALDI-TOF MS (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time Of Flight Mass

Spectrometry)
La tecnología se ha incorporado a una plataforma de instrumentos automatizada, que

proporciona un método alternativo rápido, confiable y económico para la identificación de
bacterias y hongos. El instrumento MALDI-TOF MS se compone de tres elementos básicos:
1. Cámara de ionización
2. Analizador de masas
3. Detector de iones.

Página 5 de 10
Una bacteria desconocida u hongo aislado, se coloca sobre un portaobjetos en un pocillo de

muestra y se superpone con una matriz química. Después del secado, el portaobjetos se coloca
en la cámara de ionización. Una vez que la puerta de la cámara está cerrada, un punto en la placa
es sometido a la acción de un rayo láser. La energía del rayo láser cumple dos funciones:
a. Ioniza las moléculas de proteínas microbianas individuales en iones cargados

positivamente
b. Transforma las proteínas de una fase sólida a un gas, un proceso llamado desorción.
La muestra vaporizada es luego dirigido y acelerado a través del analizador de masas, que
separa los iones cargados positivamente en función de su relación masa-carga. La velocidad a
la que viajan los iones depende de su relación masa-carga, aquellos con relaciones más
pequeñas viajan más rápido que aquellos con relaciones más grandes.
Al salir del analizador de masas, las partículas ionizadas son capturadas y sus tiempos de
vuelo se mide con un detector de iones. El espectro de masas generado es esencialmente una
huella digital única de "proteína" de la bacteria u hongo desconocido. Basados en el perfil
obtenido, el microorganismo desconocido se identifica por comparación computarizada en una
base de datos de espectros de referencia de más de 22,000 previamente bien caracterizados.
2. Objetivos
• Conocer las diferentes técnicas utilizadas para realizar la identificación
utilizadas para la identificación de bacterias.

• Un cultivo bacteriano en TSB de: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella
pneumoniae y Staphylococcus aureus.

Página 6 de 10
• Una batería bioquímica: TSI, lisina, citrato, urea, MIO, reactivo de Kovacs
• Dos mecheros
• Dos asas en argolla y dos en punta
• Un gotero con SS estéril (0,85%)
4. Metodología
INOCULACIÓN DE LA BATERÍA BIOQUIMICA:
• TSI: Fermentación de hidratos de carbono y producción de ácido sulfhídrico. Picar hasta

el fondo y superficie.
• Citrato: Uso de citrato como fuente de carbono. Siembra en superficie.
• Urea: Bacterias que utilizan urea. Siembra en superficie.
• LIA: Descarboxilación y desaminación de la lisina y producción de ácido sulfhídrico.
• MIO: Movilidad – producción de indol y de la enzima ornitina descarboxilasa. Picar
hasta el fondo.
TSI: Observar el color del medio de cultivo y la producción de gas:
1. Superficie alcalina/Profundidad ácida: Se observa la superficie roja y el fondo amarillo.

2. Superficie ácida/Profundidad ácida: Se observa la superficie y el fondo amarillos.
3. Superficie alcalina/Profundidad alcalina: Se observa la superficie roja y el rojo.
4. Presencia de burbujas: Producción de gas.
5. Color negro en el medio: Producción de ácido sulfhídrico.

Página 7 de 10
LISINA: Observar cambio de color.
1. Descarboxilación:
a. Positivo: Superficie alcalina/Profundidad alcalina – superficie violeta/fondo
violeta.
b. Negativo: Superficie alcalina/Profundidad ácida – violeta/amarillo.
2. Desaminación:
a. Positivo: Superficie rojiza/Profundidad ácida.
3. Producción de SH2: Color negro en el medio
UREA: Observar cambio de color.

a. Positivo: Cambio de color a rosado – rojizo.
b. Negativo: No hay cambio de color.
CITRATO: Observar cambio de color.
a. Positivo: Crecimiento bacteriano con intenso color azul en el pico de flauta.

b. Negativo: Ausencia de crecimiento y permanencia de color verde en el medio
de cultivo.
MIO:
a. Movilidad:
• Positiva: Presencia de turbidez o crecimiento más allá de la línea de
siembra.
• Negativa: Crecimiento limitado a la línea de siembra.
b. Ornitina descarboxilasa:
• Positiva: Color purpura; Negativa: Color amarillo.

Página 8 de 10
Tabla 6. Registro de los resultados esperados para las “Pruebas bioquímicas – Identificación
bacteriana”.
TSI Lisina Urea Citrato MIO

Cultivo
Superficie Profundidad Gas Motil Indol Ornitina
Eco
Pa
Kp
Sa
Tabla 7. Registro de los resultados obtenidos para las “Pruebas bioquímicas – Identificación
bacteriana”.
TSI Lisina Urea Citrato MIO

Cultivo
Superficie Profundidad Gas Motil Indol Ornitina
Eco
Pa
Kp
Sa


Página 9 de 10
• Clinical Microbiology Procedures Handbook. Fourth edition. Amy L. Leber. Whasington
DC. ASM Press, 2016.
• Koneman’s Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology. 7th edition. Gary
W. Procop, Deirdre L. Church, Geraldine S. Hall, William M. Janda, Elmer W.

Elaborado Aura Falco aura.falco00@usc.edu.co
E-mail
por: Luz Dary Caicedo ludcaice@usc.edu.co

Página 10 de 10


Página 1 de 7
PRACTICA # 6: Hongos
Hay una gran diversidad de hongos y, algunos de ello, son comestibles. Las setas
comestibles son hongos, al igual que el moho que forma las líneas azules o verdes de algunas
clases de queso; mientras que la levadura, otro tipo de hongo, es un ingrediente necesario para
la elaboración de distintos tipos de pan. Otros hongos pueden causar enfermedades. Un ejemplo
es Candida spp., un hongo dimórfico que puede causar infecciones conocidas como candidiasis.
Los hongos también son responsables de afecciones de la piel como el pie de atleta y la tiña.
CARACTERÍSTICA DE LA MORFOLOGÍA DE LAS COLONIAS DE HONGOS
I. TEXTURA: (Se observa en el anverso de la caja de Petri)
1. Algodonosa
2. Afelpada
3. Granular
4. Polvosa
5. Pastosa
6. Algodonosa-granular
II. TOPOGRAFÍA: (Se observa por el reverso de la caja de Petri)
1. Lisa
2. Radiada o Rugosa

Página 2 de 7
3. Verrugosa
III. CONSISTENCIA (levaduras)
1. Cremosa
2. Mucosa
3. Dura- Pastosa
IV COLOR: Amarillo, Verde, Azul (Fig. 23).
Figura 23: Característica de la morfología de las colonias de hongos (Tomado de:

Koneman’s Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology).

Página 3 de 7
2. Objetivos
• Identificar las diferentes estructuras somáticas y reproductivas que poseen los hongos
y que son útiles para su identificación.
• Utilizar las diferentes técnicas de montaje y coloración de hongos.

• Cajas de Petri con los siguientes hongos aislados: Fusarium solani, Aspergillus niger;
Penicillium spp., Rhizopus spp., Beauveria bassiana, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans.
• Un gotero con azul de lactofenol (ALF)
• Portaobjetos y cubreobjetos
• Cinta transparente adhesiva
• Dos asas en punta y 2 mecheros
4. Metodología
1. Técnica de las dos agujas:
a) Colocar una gota de azul de lactofenol (ALF) en el centro de un portaobjetos
b) Tomar con un asa curva una porción de colonia de hongos y colocarlo encima de la gota
de azul de lactofenol.
c) Con ayuda de una aguja recta estéril disociar el micelio con el objeto de hacer más delgada
la preparación que permita una mejor visualización de las estructuras del hongo.
d) Observar al microscopio primero con objetivo de 10x y posteriormente con objetivo de

40x.

Página 4 de 7
2. Técnica de la cinta adhesiva transparente:
a) Colocar una gota de ALF en el centro de un portaobjetos
b) Tomar un pequeño fragmento de cinta transparente entre los dedos pulgar e índice, con
el lado adhesivo hacia afuera.
c) El lado adhesivo se presiona sobre la superficie de la colonia de moho
d) Colocar la cinta con el lado adhesivo hacia abajo y pegarla sobre el portaobjeto con el
ALF.
e) Observar al microscopio con objetivos de 10x y 40x.
La observación microscópica de los hongos permite su identificación. Ud. debe tener en

cuenta:
a) Tipo de hifa: septada – no septada; pigmentada o hialina.
b) Forma, tamaño y ornamentaciones del conidioforo
c) Tipo de conidias de acuerdo con lo revisado en la teoría de microbiología (microconidias,

macroconidias, artroconidias, clamidoconidias, esporangiosporas, blastoconidias, etc).
El estudiante debe registrar las características esperadas y las observadas en cada una de
las colonias de los hongos que se le entreguen, de acuerdo con la tabla 8 y 9.

Página 5 de 7
Tabla 8. Registro de los resultados esperados en “Morfología de las colonias de hongos y

estructuras microscópicas”.
NOMRE DEL CARACTERÍSTICAS

CARACTERÍSTICAS MICROSCÓPICA
HONGO MACROSCÓPICAS
Color:
Tabla 9. Registro de los resultados obtenidos en “Morfología de las colonias de hongos y

estructuras microscópicas”.

CARACTERÍSTICAS MICROSCÓPICA
HONGO MACROSCÓPICAS
Textura:
Color:
Topografía:
Consistencia:

Página 6 de 7

• Baker, F. J. 1990. Manual de técnicas de microbiología médica. Editorial Acribia.

Zaragoza, España. 676p.
• Castaño-Zapata. J; Del Rio Mendoza, L. 1997. Manual para el diagnóstico de hongos,

bacterias, virus y nematodos fitopatógenos. Zamorano-Universidad de Caldas. 210p.
Luz Dary Caicedo ludcaice@usc.edu.co

Elaborado por: E-mail
Carlos Aranaga carlos.aranaga00@usc.edu.co
Aura Falco aura.falco00@usc.edu.co


Página 7 de 7

Página 1 de 10
PRACTICA # 7: Parasitología
La parasitología es la parte de la biología cuyo objeto de estudio es el parasitismo que

producen protozoarios, helmintos y artrópodos. Para que se genere un proceso infecciones se
requiere que se cumplan tres condiciones: Inoculo el cual cambia de acuerdo con el
microorganismo, factores de virulencia y fases del parásito ya que no todas las fases son
infectivas.
Los parásitos pueden clasificarse de acuerdo con:
• Localización: Endoparásitos o ectoparásitos.

• Reproducción: Intracelulares o extracelulares.
• Número de especies de huéspedes que pueden parasitar:
• Estenoxeno: si su ciclo de vida requiere la transmisión de animales al humano: Taenia
solium, que infecta al cerdo en la fase larvaria y se desarrolla en la fase adulta en las personas,
en cuyas heces se elimina el huevo que infecta de nueva cuenta al cerdo.
• Eurixeno: si se transmite de animales al humano, pero no a la inversa, como ocurre con
Toxoplasma gondii, que infecta al ser humano como quiste presente en los tejidos de cerdos,
reses o aves, pero los animales no se infectan con los toxoplasmas que el humano adquiere.
Huésped: El huésped puede diferenciarse como:
• Accidental. El alojamiento que suministra al parásito es circunstancial.

• Intermediario. Permite el establecimiento de fases inmaduras o asexuales del parásito.
• Definitivo. Posibilita el establecimiento de las fases maduras o sexuales del parásito.
• Completo. Actúa como definitivo e intermediario.

Página 2 de 10
• Paraténico. Alberga al parásito sin que éste se desarrolle en alguna fase (se dice que es
de transporte).
• Reservorio. Permite que el parásito conserve su naturaleza infectiva para el humano.
A continuación, se presentan algunos ejemplos de los principales parásitos asociados a

infección en el humano y sus diferentes estadios.
PROTOZOARIOS
Giardia intestinalis (sinonimia: G. lamblia, G. duodenalis): infecta a mamíferos, entre ellos

el humano. Tiene dos estadios durante su ciclo de vida: el trofozoito forma vegetativa en forma
de pera con disco suctor y es el encargado de producir las manifestaciones clínicas, y el quiste,
que es la estructura de resistencia y la forma infectiva (figura 24).
Diagnóstico: Se diagnostica con exámenes de materia fecal (coprológico), que es el estudio
directo en el cual se buscan tanto quistes como trofozoítos.
Figura 24. Quiste y trofozoíto de G. lamblia. Tomado de:

https://www.cdc.gov/dpdx/giardiasis/index.html
Amibiasis: infección humana producida por el protozoario Entamoeba histolytica y afecta,

sobre todo, al intestino grueso, aunque también puede afectar otras áreas extraintestinales
como el hígado. El parásito presenta dos fases: trofozoíto y quiste. El trofozoíto es la fase móvil,

Página 3 de 10
en la que se reproduce y durante la cual ocasiona en realidad los daños al huésped. El quiste es
inmóvil y es la fase infectante y resistente (figura 25).
Diagnóstico: La amibiasis intestinal se diagnostica con exámenes de materia fecal
(coprológico), que es el estudio directo. Si las muestras son liquidas se puede observar tanto
como trofozoítos como quistes; sin embargo, si la muestra es formada, existe menos posibilidad
de encontrar trofozoítos. Como el parásito ingresa por vía oral, debe descontaminar bien los
alimentos. En el interior del quiste se efectúa la división nuclear, por la cual el quiste maduro
adquiere cuatro núcleos (Figura 26).
Figura 24. Transformación del trofozoíto de Entamoeba histolytica a la forma quística

(Tomado de: Parasitología médica. Marco Antonio Becerril Flores)
Figura 25. Quiste de E. histolytica/E. dispar. Tomado de

https://www.cdc.gov/dpdx/amebiasis/index.html
.

Página 4 de 10
Plasmodium: Microorganismo causante de la malaria o paludismo. Hasta la fecha se han

identificado más de 100 especies que infectan mamíferos, aves y reptiles (WHO, 2008). En el
humano existen cuatro especies causantes de la enfermedad: P. vivax, P. malariae, P. ovale y P.
falciparum; esta última provoca las formas más graves de la enfermedad. La enfermedad se
adquiere mediante la picadura de la hembra del mosquito Anopheles. Este microorganismo
tiene un ciclo de vida en la cual en el huésped vertebrado se realiza el ciclo de vida asexual y la
sexual ocurre en el intestino del mosquito (Fig. 26).
Diagnóstico: El método más utilizado para el diagnóstico del paludismo es la técnica del
frotis de sangre o la gota gruesa en la cual se observan las diferentes estructuras del parásito.
Figura 26. Diferentes fases del parásito Plasmodium. Tomado de:

https://www.cdc.gov/dpdx/malaria/index.html
Balantidium coli: presenta dos fases en su ciclo de vida: trofozoíto y quiste, el cual es la
forma infectante y se infecta cuando este ingiere alimentos y bebidas contaminadas (Fig. 27).
Diagnóstico: Se realiza a partir de materia fecal en la cual fácilmente se puede identificarse
por su gran tamaño.

Página 5 de 10
Figura 27. Quiste y trofozoíto de B. coli. Tomado de:

https://www.cdc.gov/dpdx/balantidiasis/index.html.
HELMINTOS
1. CESTODOS O GUSANOS PLANOS

Taenia solium, o “solitaria” es hermafrodita y tiene dos tipos de huéspedes: uno definitivo
(el humano) y otro intermediario (el cerdo). En el humano causa “teniasis” cuando está en la
fase adulta (2 a 4 m de longitud) y se establece en el intestino. También puede producir
“cisticercosis” si la fase larvaria migra fuera del intestino (Fig. 28).
Diagnóstico: La cisticercosis se diagnóstica por la clínica del paciente y pruebas
inmunológicas o patológicas. El diagnóstico de la fase intestinal es la observación de los huevos
o proglótides en materia fecal.

Página 6 de 10
Figura 28. Huevos y proglótides de Taenia spp. Tomado de:

https://www.cdc.gov/dpdx/taeniasis/index.html.
2. NEMATODOS O GUSANOS REDONDOS.

Ascaris lumbricoides: es un gusano cuatro fases larvarias, una fase de huevo, y el adulto,
macho o hembra. El macho es más pequeño que la hembra.
Diagnóstico: Se puede generar eliminación de lombrices al defecar. En ocasiones el paciente
le lleva al médico un espécimen de Ascaris. Los huevos se detectan mediante el examen directo
(Fig. 29).
Figura 29: Huevos y gusano adulto de Ascaris lumbricoides. Tomado de

https://www.cdc.gov/dpdx/ascariasis/index.html

Página 7 de 10
Trichuris trichiura: parasitosis intestinal, se le considera como geohelmintiasis debido a

que, para completar su ciclo biológico, sus huevos requieren estar en tierra por 3 a 4 semanas
para alcanzar el estadio de huevo larvado, que es la forma infectante para el humano (Fig. 30).
Diagnóstico: El hallazgo de los huevos característicos del helminto confirman el diagnostico.
Figura 30: Huevos de T. trichiura. Tomado de:

https://www.cdc.gov/dpdx/trichuriasis/index.html
3. Objetivos
• Identificar las características de parásitos asociados con infecciones clínicas.

• Lámina con quistes de Balantidium coli
• Lámina con huevos de Taenia spp.
• Lámina con huevos de Enterobius spp.
• Lámina con huevos de Trichuria spp.
• Lámina de Entamoeba histolytica

Página 8 de 10
• Lámina de Giardia intestinalis

• Lámina de Trypanosoma spp.
• Muestra preservadas de Taenia spp.
• Muestras preservadas de otros helmintos parásitos
• Microscopio
• Aceite de inmersión.
5. Metodología
Observar al microscopio empleando los aumentos 40X y 100X.
El estudiante debe registrar las características observadas en cada uno de los parásitos que
observe, de acuerdo con la tabla 10.

Página 9 de 10
Tabla 10. Registro de los resultados observados en “Parásitos”.

REPRESENTACIÓN ESQUEMÁTICA
PARÁSITO MICROSCÓPICAS
1.
2.
3.
4.

• Parasitología Medica. Marco Antonio Becerril: McGraw Hill, 2011.
• DPDx - Laboratory Identification of Parasites of Public Health Concern:
https://www.cdc.gov/dpdx/index.html.

Página 10 de 10

Luz Dary Caicedo ludcaice@usc.edu.co
Elaborado por: E-mail
Carlos Aranaga carlos.aranaga00@usc.edu.co
Aura Falco aura.falco00@usc.edu.co
Luisa María Nieto
Revisado por: E-mail luisa.nieto01@usc.edu.co
Ramírez

Manual Del Laboratorio - Microbiologia TP - 2023B

Cargado por

Información del documento

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Manual Del Laboratorio - Microbiologia TP - 2023B

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

UNIVERSIDAD SANTIAGO DE CALI

FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS

PRACTICA # 1: Limpieza, desinfección y esterilización

1. Definiciones según la Organización Mundial de la Salud

FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS

PRACTICA # 1: Limpieza, desinfección y esterilización

2. Limpieza del material de laboratorio

• Métodos físicos: Se puede realizar a través de cepillado, aspiración, desempolvado en

FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS

PRACTICA # 1: Limpieza, desinfección y esterilización

• Enjuagar con suficiente agua asegurándose de que todo el detergente se elimine.

4. Desinfección y esterilización del material de laboratorio

El término esterilización es absoluto; significa destrucción total e irreversible de células

FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS

PRACTICA # 1: Limpieza, desinfección y esterilización

soluciones pueden ser esterilizadas pasando el líquido a través de un filtro especial de

Agentes antimicrobianos químicos

FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS

PRACTICA # 1: Limpieza, desinfección y esterilización

Conocer los procedimientos de limpieza, desinfección y esterilización que deben aplicarse

3. Materiales y reactivos por grupo de trabajo

MATERIALES POR GRUPO DE TRABAJO – EFECTO DEL CALOR EN LOS MICROORGANISMOS

• 1 cultivo con 2 mL de Staphylococcus spp. en caldo Tripticasa de Soya (TSB), sembrado

FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS

PRACTICA # 1: Limpieza, desinfección y esterilización

MATERIALES POR GRUPO DE TRABAJO - ESTERILIZACIÓN

• Gaza y algodón para hacer tapones

EFECTO DEL CALOR EN LOS MICROORGANISMOS

1. PREPARACION DE CONTROL DE CRECIMIENTO

En una placa de TSA, previamente dividida a la mitad y rotulada, se siembra por

Figura 1. Preparación del control (Elaborada por Aura Falco).

FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS

PRACTICA # 1: Limpieza, desinfección y esterilización

2. EFECTO DEL CALOR SECO SOBRE LOS MICROORGANISMOS

Con un marcador indeleble, divida una placa de TSA en dos partes.

3. EFECTO DEL CALOR HÚMEDO SOBRE LOS MICROORGANISMOS

FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS

PRACTICA # 1: Limpieza, desinfección y esterilización

FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS

PRACTICA # 1: Limpieza, desinfección y esterilización

ESTERILIZACIÓN DE MATERIAL DE VIDRIO

Figura 5: Preparación de Erlenmeyer para esterilización.

FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS

PRACTICA # 1: Limpieza, desinfección y esterilización

Figura 6. Preparación de pipetas para esterilización.

FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS

PRACTICA # 1: Limpieza, desinfección y esterilización

Figura 7. Preparación de pipetas cajas de Petri para esterilización.

FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS

PRACTICA # 1: Limpieza, desinfección y esterilización

Control de Con incineración Sin Incineración

Cultivo crecimiento (CI) (SI)

Además de diligenciar la tabla, debe incluir la explicación microbiológica correspondiente

Además de diligenciar la tabla, debe incluir la explicación microbiológica correspondiente

FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS

PRACTICA # 1: Limpieza, desinfección y esterilización

Adriana Correa adriana.correa00@usc.edu.co

FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS

PRACTICA # 2: Medios de cultivo

• Disponibilidad de nutrientes adecuados: Los requerimientos mínimos que debe

FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS

PRACTICA # 2: Medios de cultivo

• Luz ambiental: La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la