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Unidad 1 de Biologia Molecular
Unidad 1 de Biologia Molecular
• Preparación de reactivos.
• Sala de preparación de muestras y extracción de ADN → Esta es una sala «sucia» (con ADN),
por lo que sería conveniente que tuviese una ligera presión negativa, para evitar que pueda
escaparse material contaminante. Debe contar con una cabina de bioseguridad y un
espectrofotómetro.
• Sala de PCR → Dispone de los termocicladores
necesarios para llevar a cabo la PCR y un
espacio de trabajo para añadir las muestras de
ADN a la mezcla de reacción.
Incubador de CO
El incubador de CO, es el aparato que proporciona las condiciones ambientales óptimas para el
crecimiento de las células en el medio de cultivo. Consta de los siguientes dispositivos:
• Control de temperatura, responsable de fijar y mantener estable la temperatura óptima para cada
tipo de cultivo.
• Recircularización del aire interior, para homogeneizar la temperatura.
• Control de CO,. El CO, puro se suministra comprimido en botellas presurizadas y este dispositivo
lo mezcla con aire en la proporción adecuada (4-7%) y lo inyecta en el interior del incubador.
• Control de humedad. En el interior del incubador se requiere una humedad ambiente elevada
para evitar la evaporación del medio de cultivo. En los incubadores más sencillos se consigue
simplemente colocando una bandeja con agua en el suelo del incubador. Sin embargo, esta
solución no es la ideal por la facilidad con la que se contamina esa agua. Por ello, los incubadores
actuales incorporan un dispositivo de control de humedad que inyecta agua estéril.
Microscopio invertido
El control del crecimiento de un cultivo se realiza por observación microscópica directa. Ahora bien, el
tamaño de los frascos de cultivo impide la utilización de un microscopio óptico convencional y por ello se
recurre a un microscopio invertido.
El microscopio invertido se caracteriza por tener invertidas la posición de la fuente de luz (por encima de
la platina) y el revólver de objetivos (por debajo de la platina) respecto de un microscopio convencional.
Lo ideal, además, es que el microscopio esté equipado con un sistema de contraste de fases para facilitar
la visualización de las células en crecimiento, ya que se trata de estructuras vivas, transparentes y sin
coloración.
Equipo de criogenia
El equipo de criogenia permite conservar a largo plazo y en forma viable muestras de células y líneas
celulares.
El equipo de criogenia mínimo está constituido por un tanque o depósito de nitrógeno líquido. Se puede
ampliar con una nodriza para rellenar el tanque o con una instalación que conecte con un suministro
centralizado de nitrógeno. Es un equipamiento imprescindible en los laboratorios de cultivos celulares y
optativo en los de citogenética.
Equipamiento específico para citogenética
En el equipo específico para citogenética son fundamentales:
• Equipo de análisis de imagen. Es básico para documentar y analizar metafases, con el fin de
obtener un cariotipo. Consta de los siguientes elementos:
• Microscopio óptico convencional de luz transmitida, para visualizar las metafases teñidas con
técnicas de bandeo.
• Cámara digital, para obtener imágenes de las metafases para su posterior análisis.
• Software específico para análisis de metafases. Existen varios programas informáticos
comerciales que analizan las metafases, cromosoma a cromosoma, permitiendo su
reconocimiento con base en el patrón de bandas y su emparejamiento para obtener el cariotipo.
• Microscopio óptico convencional y de fluorescencia. Debería ser un microscopio distinto al
del análisis de imagen. Se utiliza para recuentos de células, estudios de viabilidad y morfología
celular, visualización de preparaciones de hibridación in situ fluorescente, etc.
Equipamiento común
Entre el equipamiento común de los laboratorios de citogenética y cultivos celulares es habitual encontrar:
• Un equipo de esterilización. La esterilidad de todo el material y de los reactivos que estén en
contacto con los cultivos es imprescindible. Por esta razón, estos laboratorios deberían contar con
un equipo de esterilización compuesto por un autoclave para esterilizar todo tipo de material y un
sistema de filtración con filtros de 0,22 um para esterilizar soluciones.
• Un sistema de purificación de agua. El agua utilizada para preparar reactivos y medios de cultivo
tiene que ser ultrapura, estéril y libre de apirógenos.
• Nevera y congeladores de -20 y -80°C. Un sistema de frío es necesario para conservar a las
temperaturas adecuadas los distintos reactivos empleados en el laboratorio.
• Otros equipamientos (Centrífugas, placa calefactora si se hace hibridación in situ, pHmetro,
balanza, agitador magnético, pipeteadores automáticos, etc).
1.3.2. La estructura del laboratorio
Al igual que en el laboratorio de biología molecular, la prevención de la contaminación condiciona la
estructura de los laboratorios de citogenética. Por eso, en estos laboratorios también se aplica el criterio
de la separación física de áreas «limpias» y «sucias». Así, un laboratorio de citogenética completo debe
estructurarse como mínimo en tres salas:
• Sala de cultivos → Es la sala «limpia» del laboratorio, en la que se van a realizar todos los
procedimientos directamente relacionados con el cultivo celular. Debe estar situada en una zona
tranquila, alejada de vías de paso habituales para evitar turbulencias. Lo ideal es que esté dotada
de un sistema que le suministre aire filtrado y una ligera presión positiva, para que el aire ambiente
esté, en lo posible, libre de microorganismos. En esta sala se dispondrán las cabinas de flujo
laminar, los incubadores y el microscopio invertido.
• Sala de laboratorio convencional → Es la sala sucia, con el resto de equipamiento, excepto el
equipo de criogenia. En esta sala se van a realizar todos los procedimientos que no están
directamente relacionados con el cultivo celular, como la preparación de extensiones, tinciones,
cariotipos, citogenética molecular, etc. Esta área puede tener una zona oscura para el microscopio
de fluorescencia.
• Sala de frío, con los congeladores y el equipo de criogenia → Esta sala debe estar separada
de la sala de cultivos, porque los congeladores generan bastantes turbulencias. Suele ser una
cámara frigorífica, para minimizar el consumo de nitrógeno líquido y alargar la vida de los
congeladores.
1.3.3. Las condiciones de trabajo técnica aséptica
Los hábitos de trabajo en los laboratorios de citogenética y cultivos celulares están totalmente
condicionados por la prevención de la contaminación.
En este sentido, las condiciones de trabajo en la sala de cultivos se ajustan a una estricta técnica aséptica
que impida la contaminación de los cultivos por microorganismos, por eso, todas las manipulaciones se
realizan dentro de la cabina de flujo laminar.
Entre las normas más importantes, que afectan también al protocolo de trabajo en la cabina de flujo
laminar, se pueden citar las siguientes:
• Lavado frecuente de manos.
• Uso de guantes y batas desechables estériles.
• La puerta de la sala siempre debe estar cerrada.
• Uso exclusivo de material y reactivos estériles. El material desechable estéril no es intercambiable
con el de otras salas.
• No introducir mecheros Bunsen en las cabinas porque generan turbulencias que alteran el flujo
laminar.
• Colocar en el interior de la cabina exclusivamente el material que se vaya a utilizar en la sesión
de trabajo.
• No sacar el material estéril de su embalaje hasta el momento de uso, evitando tocar con él
cualquier superficie.
• El material usado reutilizable de vidrio se puede colocar en un recipiente con hipoclorito al 10%
hasta finalizar la sesión de trabajo. Después se lleva al laboratorio general para su limpieza y
esterilización.
• El material fungible utilizado en la cabina se deposita en contenedores adecuados para material
contaminado, que se retiran al finalizar la sesión de trabajo.
• Restringir el acceso a la sala de cultivos exclusivamente al personal que esté realizando algún
procedimiento. No se deben recibir visitas en esta Sala.
• Limpieza de las cabinas de flujo laminar con etanol al 70% o desinfectante comercial apropiado
para cabinas al finalizar cada sesión de trabajo.
• En las cabinas dotadas de lámpara germicida UV, esta se puede conectar, como mínimo, 30
minutos después de la limpieza
• Realizar un mantenimiento programado de las cabinas, como mínimo anualmente, que incluya
comprobación del filtro HEPA
• Limpieza y desinfección de superficies con etanol al 70% o desinfectantes apropiados.
Por supuesto, son también de aplicación todas las normas básicas de trabajo aplicables a cualquier
laboratorio.
1.4 La seguridad en el laboratorio
El diseño de los laboratorios responde al criterio de prevenir la contaminación de las muestras, pero
también a criterios de seguridad.
La seguridad en los laboratorios de biología molecular, citogenética y cultivos celulares hace referencia
a la prevención de la exposición de personal a agentes nocivos y también a impedir la liberación de estos
al exterior.
En función de la naturaleza de estos agentes, la seguridad puede ser:
• Biológica o bioseguridad. Trata de la prevención ante agentes patógenos y toxinas.
• Química. Para la prevención a la exposición de agentes químicos.
1.4.1. Bioseguridad
La bioseguridad de un laboratorio engloba todas las normas, técnicas, prácticas y hábitos de trabajo que
intentan evitar la exposición accidental (no intencionada) del personal a agentes biológicos
potencialmente peligrosos (patógenos y toxinas) o su liberación al medio ambiente.
En este sentido, cualquier muestra biológica debe considerarse como potencialmente peligrosa y deben
adoptarse las medidas mínimas de protección en lo que hace referencia al uso de EPI.
En los laboratorios de biología molecular, el principal problema de bioseguridad lo plantea el trabajo con
microorganismos en general y con organismos modificados genéticamente (GMO), en particular. El Real
Decreto 178/2004, de 30 de enero, por el que se aprueba el Reglamento General para el Desarrollo y
Ejecución de la Ley 9/2003, de 25 de abril, por la que se establece el régimen jurídico de la utilización
confinada liberación voluntaria y comercialización de organismos modificados genéticamente, en su
artículo 12, clasifica las actividades de utilización confinada de los GMO en cuatro tipos en virtud del
riesgo para la salud humana y el medio ambiente:
• Tipo 1: riesgo nulo o insignificante.
• Tipo 2: riesgo bajo.
• Tipo 3: riesgo moderado.
• Tipo 4: riesgo alto.
Esta valoración del riesgo hay que hacerla siguiendo los criterios que establece el propio RD (Anexo l)
donde se describen los elementos que se deben tener en cuenta y el procedimiento que se aplica para
realizar la evaluación del riesgo.
También establece (Anexo ll) las medidas de protección y confinamiento mínimas según el tipo de
actividades desarrolladas en el laboratorio.
En los laboratorios de citogenética y cultivos celulares se deberían aplicar como mínimo las medidas de
protección y contención de tipo 2, excepto que se trabaje con microorganismos con un riesgo superior.
1.4.2. Seguridad química
El RD 363/1995, de 10 de marzo, por el que se aprueba el reglamento sobre notificación de sustancias
nuevas y clasificación, envasado y etiquetado de sustancias peligrosas, establece hasta 15 tipos de
sustancias peligrosas con base en sus características fisicoquímicas, características toxicológicas y
peligrosidad para la salud humana.
Muchos de los reactivos utilizados en los laboratorios de biología molecular y citogenética y cultivos
celulares se encuadran dentro de alguna de estas categorías. En consecuencia, las buenas prácticas de
laboratorio referidas a seguridad química deben incluir medidas para:
• Prevenir la exposición del personal a estas sustancias, entendiendo por exposición el contacto
con ellas por penetración cutánea, inhalación o ingestión.
• Su almacenamiento seguro.
• Gestión eficiente de los residuos que generen.
Estas medidas se establecerán con base en el catálogo de productos utilizados en el laboratorio y de
acuerdo con la ficha de datos de seguridad (FDS) específica de cada producto, que aporta información
de hasta 16 apartados relativos a la composición, manipulación, peligros, vías de exposición, efectos
tóxicos, almacenamiento, eliminación y primeros auxilios.
La FDS debe ser suministrada obligatoriamente por el distribuidor del producto y debe guardarse en el
laboratorio para su posible consulta por todo el personal ante cualquier eventualidad.
Como medidas genéricas se pueden mencionar las siguientes:
• Utilización de los EPI adecuados a las posibles vías de exposición de cada producto.
• Prohibición de pipetear con la boca.
• Manipulación de productos volátiles en el interior de campanas de aspiración de gases.
• Manipulación de productos inflamables aliados de fuentes de calor y llamas.
• Correcto etiquetado de todos los envases que contengan agentes químicos, incluyendo las
soluciones stock y de trabajo preparadas en el laboratorio a partir de productos puros. El
etiquetado debe incluir, como mínimo, el nombre del producto, la fecha de preparación y el
pictograma de peligro, en su caso.
• Almacenamiento de los productos químicos en armarios adaptados a sus características de
peligrosidad (inflamables, tóxicos, corrosIvos, etc.) y respetando siempre las incompatibilidades.
• Como ejemplos de sustancias peligrosas habituales en los laboratorios de biología molecular y
citogenética se pueden mencionar los siguientes:
• Inflamables: alcoholes (etanol, isopropanol, metanol).
• Tóxicas y muy tóxicas: acrilamida, azida sódica, bromuro de etidio, diaminobencidina (DAB),
formamida, tetrametilurea.
• Carcinógenas: acrilamida (grado 2), DAB (grado 2), formaldehído (grado 1).
• Mutágenas: acrilamida (grado 2), bromuro de etidio (grado 3).
• Teratógenas y/o perjudiciales para la fertilidad: acrilamida (grado 3), Formamida (grado 2),
tetrametilurea (grado 1).
1.4.3. Equipamiento y normas de seguridad.
La distribución del laboratorio, las instalaciones, la señalización y el equipamiento deben ser los
adecuados para minimizar y prevenir los riesgos comunes a cualquier laboratorio. En concreto:
• Deben disponer de instalaciones de emergencia convenientemente señalizadas, como duchas de
emergencia, lavaojos, extintores, etc.
• Estar dotados con los equipos de protección individual (EPI) adecuados, según las muestras que
se manipulen y los procedimientos que se desarrollen, como guantes, batas desechables, gafas
de seguridad, mascarillas, pantallas, etc.
• Deben tener instalaciones adecuadas para el almacenamiento de sustancias tóxicas y peligrosas,
como armarios para inflamables y armarios específicos para sustancias químicas tóxicas y
corrosivas.
• Deben tener contenedores adecuados para la recogida selectiva y la cla. sificación de residuos
• Deben disponer de kits para recogida de derrames de productos quími cos y citotóxicos
• Debe contar con un manual de seguridad y un plan para la gestión de residuos
Por otra parte, el personal debe cumplir también una serie de normas básicas de comportamiento en los
laboratorios:
• Lavado frecuente de manos.
• Utilización de los EPI adecuados.
• Uso de ropa de trabajo adecuada y abrochada, evitando, en lo posible, las mangas anchas, los
colgantes, los zapatos abiertos y, en general, la ropa que deje al descubierto una parte importante
del cuerpo.
• Prohibición de comer, beber, fumar y maquillarse.
• Uso de gafas de seguridad cuando se llevan lentes de contacto.
• Prohibición de pipetear con la boca
• Recibir la formación adecuada para el manejo de los aparatos.
• Conocer el plan de gestión de residuos y el manual de seguridad del laboratorio y cumplir las
normas de actuación que recogen ambos documentos.
1.4.4. El manual de seguridad
El manual de seguridad es un documento de obligado conocimiento de todo el personal del laboratorio.
Debe contener la siguiente información:
• Evaluación de los riesgos inherentes a cada puesto de trabajo en el laboratorio.
• Descripción y normas de utilización del equipamiento de seguridad del laboratorio (cabinas de
bioseguridad, cabinas de aspiración de gases, EPI, etc.)
• Hábitos de trabajo apropiados para minimizar los riesgos de exposición.
• Normas de almacenamiento de productos químicos.
• Normas para la eliminación de desechos y gestión de residuos, incluyendo los derrames
• Normas de actuación en casos de emergencias, accidentes biológicos y accidentes químicos.
1.4.5. Gestión de residuos
Los laboratorios de biología molecular y citogenética deben disponer de un plan de gestión de residuos
tóxicos y peligrosos, en virtud de su actividad.
El plan de gestión de residuos sólidos debe incluir medidas para la recogida selectiva, la clasificación y el
almacenamiento temporal de residuos hasta su recogida por una empresa gestora.
Medidas a gestionar
En el plan de gestión de residuos se tienen que especificar medidas para gestionar:
• Residuos biosanitarios especiales → Entre este grupo o clase de residuos se incluyen los
objetos punzantes y cortantes que han estado en contacto con productos biológicos, cultivos
microbiológicos y material contaminado con los mismos, cultivos celulares, grandes cantidades de
sangre y otros líquidos biológicos, etc
• Residuos químicos → Se incluyen los envases que han contenido productos químicos, reactivos
caducados o innecesarios, los EPI contaminados, los filtros de cabinas de aspiración de gases,
los derrames, etc.
• Residuos citotóxicos → Incluye los restos de productos carcinógenos, mutágenos y teratógenos,
así como los envases que los hayan contenido.
• Residuos radiactivos → Como norma general, los residuos se recogen en:
o Contenedores para los residuos sólidos.
o Garrafas en el caso de residuos líquidos.
Y deben cumplir con:
• Estar homologados y ser específicos para cada tipo de residuo.
• Diferenciarse, normalmente por código de color.
• Estar perfectamente etiquetados.
En cuanto a su manejo, no se deben llenar más de 2/3 de su capacidad y deben cerrar herméticamente.
Finalmente, el plan de gestión de residuos debe especificar las normas de actuación en caso de derrames.
Derrames
Los derrames se cuentan entre los accidentes de laboratorio más comunes y entrañan cierta peligrosidad.
Su gestión implica tres acciones que deben ejecutarse de forma inmediata:
1. Neutralización. Va a depender de las características químicas del producto derramado
2. Absorción. El material absorbente que se use dependerá de la naturaleza del derrame. Algunos
ejemplos son:
o Serrín para líquidos no inflamables ni tóxicos ni corrosivos.
o Carbón activo, para líquidos inflamables, tóxicos o corrosivos.
o Absorbentes-neutralizadores comerciales, para cualquier derrame líquido según
indicaciones del fabricante.
o Celulosa para absorber directamente derrames de pequeñas cantidades.
3. Eliminación. El residuo se introduce en un envase adecuado y se elimina en el contenedor
específico.
o Los derrames de productos en polvo se recogen directamente, evitando la formación de
aerosoles y de polvo en suspensión.
o Los derrames de productos volátiles tóxicos por inhalación recogidos con celulosa deben
ser eliminados rápidamente en envases adecuados con cierre hermético; o bien poner la
celulosa en una cabina de aspiración de gases con filtro de carbón activo hasta su
evaporación y, posteriormente, tratarlo como un residuo químico.
Durante la realización de estas actividades:
• Debe restringirse el acceso al laboratorio.
• Las personas responsables de la recogida deben estar equipadas con los EPI adecuados al
producto derramado.
• Se debe tener especial cuidado con derrames de líquidos inflamables y volátiles.