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PROBLEMAS T6 (Estudiantes)
MTODOS ISOTPICOS

6.1e.- Calcula la radioactividad (en Ci) que emitir una muestra de 10 mg de
Na
2
SO
4
donde todo el azufre presente es
35
S (radioactivo).
Datos: periodo de semidesintegracin del
35
S: 87,1 das; Masa molecular
Na
2
SO
4
: 142 S: 105,53 Ci.

6.2e.- Se dispone de una muestra de ATP marcada con
32
P que el da 1 de enero
tena 20 curios/mg. Qu radioactividad especfica tendr el 1 de abril?
Datot t

(
32
P) es de 14,3 das. S: 0,255 Ci/mg

6.3e.- Una muestra de cido frmico (CH
2
O
2
) marcado con
14
C presenta una
radioactividad especfica de 1 Ci/mg. No todos los tomos de carbono son
radioactivos. Calcula la proporcin
14
C/
12
C de la muestra.
Datos: el periodo de semidesintegracin del
14
C es de 5760 aos; MM(cido
frmico), 46
S:
14
C/
12
C = 0,00074 (Uno de cada 1350 tomos de C es radioactivo)

6.4e.- Una muestra de timidina tritiada con un mximo de un ncleo de
3
H por
molcula tiene una radiactividad especfica de 6 Ci/mmol Qu porcentaje de las
molculas son radiactivas? Esa misma timidina se utiliza como precursor para la
sntesis de un DNA (2510
6
Da, aproximadamente 75700 bases) que posee un
50% AT. Si se utiliza un contador con una eficiencia del 40 % para el tritio, a
qu masa de DNA corresponde una medida de 1000 cpm?
Datos: t

(
3
H)= 12,3 aos; 1Ci= 3,710
10
dps
S: i) 20,57%; ii) 0,25 ng DNA.

6.5e.- Una muestra de hormona tiroidea marcada con
131
I presenta una
radioactividad de 10 Ci. Al cabo de cunto tiempo quedar reducida la
radioactividad de la muestra a 2 Ci?
Dato: t

(
131
I) = 8,1 das.
S: 18,8 das

6.6e.- Cuntos tomos de
14
C existen en una muestra que emite 4000 cpm
contada en un aparato cuya eficiencia para este radioistopo es del 80 %?
Calcular el intervalo de confianza al 95 % de la medida anterior (4000 cpm)
sabiendo que se ha determinado contando durante 10 min? Qu aproximacin se
introduce en este clculo?
Datos:
14
C = 1,4410
-8
horas
-1
; a (95 %)= 2
S: 2,0810
13
tomos
14
C; 4000 40, o en valor relativo 4000 1 %
6.7e.- En la tumba de Ramss II se hall un pergamino cuya proporcin
14
C/
12
C
era un 68 % de la que tienen los seres vivos actuales. Calcular la antigedad de
ese pergamino. Dato: t
1/2
(
14
C) =5760 aos.
S: 3205 aos

6.8e.- Si la proporcin de
14
C en la madera de una casa es el 95 % de la que tiene
la madera de un rbol recin cortado, calcula la antigedad aproximada de la
casa. Dato: periodo de semidesintegracin del
14
C: 5760 aos.
S: 426 aos.

6.9e.- El
45
Ca tiene un periodo de semidesintegracin de 163 das. Calcula:
a) La constante de desintegracin () en das
-1
y segundos
-1

b) El porcentaje de la radioactividad inicial que queda al cabo de 90 das en
una muestra que contiene
45
Ca
S: a) 4,2510
-3
das
-1
; 4,9210
-8
segundos
-1
; b) 68,2 %

6.10e.- Se tiene una muestra de fosfato de tiouridina marcado con
32
P y con
35
S,
con una radiactividad especfica total de 9000 dps/mol. Al cabo de 45 das, la
radiactividad especfica ha descendido a 4200 dps/mol Cul era la radiactividad
especfica para cada uno de los radioistopos del fosfato de tiouridina inicial (el
que daba 9000 dps/mol)? Cmo se podra conocer la radiactividad debida a cada
radioistopo sin necesidad de esperar a que la velocidad de desintegracin
decaiga? Qu fraccin de molculas llevaban un tomo de
32
P?
Datos:
32
P= 5,6510
-7
s
-1
;
35
S= 9,2210
-8
s
-1

S:
32
P: 3559 dps/mol;
35
S: 5441 dps/mol. Aproximadamente 1 de cada 10
14
molculas

6.11e.- Se realiza una experiencia de autorradiografa con
32
P. Tras un tiempo de
exposicin de 350 horas se revela la emulsin y se observa que ha sido
sobreexpuesta no pudindose contar bien los rastros. Se desea saber cunto
tiempo habra que haber expuesto la emulsin para tener exactamente un tercio
de los rastros obtenidos con 350 horas de exposicin. Datos:
32
P = 5,6510
-7
s
-1

S: 91,6 horas

6.12e.- Un DNA con un 40% de pares AT se sintetiza a partir de precursores
marcados, concretamente [-
32
P]dATP, 2 Ci/mmol, y se visualiza por
autorradiografa. Tras un tiempo de exposicin de 150 horas se observa que cada
molcula de DNA produce una media de 8 rastros. Si la eficiencia de la emulsin
utilizada es del 40 % para el
32
P, cul es el nmero aproximado de nucletidos
que integran una molcula de ese DNA?
Datos. 1 Ci= 2,210
12
dpm
32
P = 5,6510
-7
s
-1

S: 1,510
6
nucleotidos/molcula
6.13e.- Con objeto de medir la absorcin de fosfato del medio externo por parte
de una determinada bacteria, se traslad un cultivo de dicha bacteria a un medio
con
32
P-ortofosfato de una actividad especfica inicial de 0,2 Ci/mmol. En el
momento de poner en contacto las clulas con el medio, se tom una muestra de
0,1 mL del medio de cultivo y se cont en un contador de centelleo de 80 % de
eficiencia para el
32
P, dando 2500 cpm. Las clulas estuvieron en contacto con el
medio durante 12 horas y, a continuacin, se sedimentaron por centrifugacin a
baja velocidad tomndose una alcuota de 0,1 ml del sobrenadante que, a causa
de una avera en el contador no puedo ser contada hasta 68 horas despus de la
centrifugacin. Cuando finalmente se realiz la medida, en las mismas
condiciones que la inicial, se obtuvo un valor de 1200 cpm. Teniendo en cuenta
que el cultivo se hallaba en fase estacionaria (es decir, que el nmero de clulas
no aument durante el experimento) y a una densidad celular de 210
6

clulas/mL, cul fue el valor promedio de molculas de fosfato tomadas por
cada clula en el intervalo de tiempo considerado?
Datos:
32
P= 5,6510
-7
s
-1

S: 9,210
6
molculas fosfato/clula

6.14e.- En la traduccin in vitro de un mRNA se utiliz una mezcla de
aminocidos que contena
14
C-Met de radiactividad especfica 1000 dps/mg,
como nico precursor marcado. Como resultado del proceso de obtuvo una
protena, P, constituida por una nica cadena polipeptdica cuyo aminocido
carboxilo terminal era, casualmente, Met. Dicha protena fue sometida a un
tratamiento con bromuro de ciangeno que dio lugar a solo dos polipptidos
marcados que posean una radiactividad especfica de 840 y 660 dpm/mg.
Calcular el peso molecular de la protena P. (Nota: el bromuro de ciangeno
rompe enlaces peptdicos en el lado carboxilo de residuos de metionina; MM
Met= 131,1).
S: 21291 g/mol.

6.15e.- En una experiencia de doble marcaje con
3
H y
14
C se midi la
radiactividad de 0,5 g de muestra en un contador analizador de altura de pulso
subdividido en dos canales. En las mismas condiciones se determin la
radiactividad de patrones de
3
H y
14
C en ambos canales y se obtuvieron los
siguientes resultados:

cpm
Canal A Canal B
Patrn
3
H 10200 2
Patrn
14
C 4570 8452
Muestra 750 782

Teniendo en cuenta que el ruido de fondo del aparato es de 20 cpm por el
canal A y de 2 cpm por el canal B, y que la eficiencia es del 80 % para el 14C y
el 20 % para el 3H, calcular la radiactividad especfica de la muestra para cada
uno de los radioistopos y determinar el intervalo de confianza al 95 % de
probabilidad de la medida del ruido de fondo del canal A (20 cpm) sabiendo que
ha sido contado durante 500 minutos.
S:
14
C: 3000 dpm/g;
3
H: 3100 dpm/g; 20 0.4 y en valor relativo 20 2 %

6.16e.- Una protena de peso molecular 60000 es capaz de unir reversiblemente
GMP cclico. En una experiencia de equilibrio de dilisis se coloc 0,1 mL de
una disolucin de 6 g/mL de la protena en una de las cmaras de la celdilla,
mientras que al otro lado de la membrana semipermeable se puso 0,1 mL de una
disolucin de GMP cclico marcado con
3
H, de radiactividad especfica 10
6

cpm/mol. Una vez alcanzado el equilibrio se tomaron 10 L de cada una de las
celdillas y se cont 2570 cpm en la alcuota de la cmara que contena la protena
y 1870 cpm en la que no contena protena. Calcular la concentracin de GMP
cclico libre en el equilibrio y el valor de la funcin de saturacin.
S: [cGMP] libre = 1,8710
-7
M; = 0,7

6.17e.- Se hizo crecer una planta en una atmsfera que contena
14
CO
2
(310
8

cpm/mol). Despus de varias semanas se prepar un extracto de hojas para
determinar el contenido en glucosa-1-fosfato mediante dilucin isotpica inversa.
A 20 mL de extracto se le aadieron 1,5 mmoles de glucosa-1-fosfato no
marcada. A continuacin se consigui aislar una pequea cantidad de glucosa-1-
fosfato del extracto y se cristaliz y recristaliz varias veces hasta que se
determin una actividad especfica constante e igual a 2,610
5
cpm/mol.
Calcular la concentracin de glucosa-1-fosfato original del extracto.
S: 10,84 M


PROBLEMAS T7 (Estudiantes)
CROMATOGRAFA

7.1e.- Un nucletido se somete a
cromatografa en papel con doble
desarrollo (monodimensional) de 10 cm
(distancia alcanzada por el frente del
eluyente, cada una de las veces, contando
a partir del punto donde se deposit la
muestra). La posicin final de la mancha
se halla a 6,4 cm del origen. Cul es el Rf
del nucletido en este sistema
cromatogrfico? (Atencin: no es 0,32).

7.2e.- Una determinada sustancia origina el siguiente perfil de elucin en una
columna de cromatografa de reparto. Calcular, de forma aproximada, el nmero
de platos tericos de la columna para dicha sustancia en las condiciones de
elucin correspondientes.


S: 278

7.3e.- El octapptido AVGWRVKS se digiri con la proteasa tripsina. Qu tipo
de cromatografa es la ms adecuada para separar los productos, la de
intercambio inico o la de exclusin molecular? Si la proteasa empleada hubiese
sido quimotripsina, cul hubiese sido la tcnica de separacin ptima? Justifica
la respuesta.

7.4e.- Se aplican 20 mg de una mezcla de protena que contiene un 30 % de un
enzima, E, en una columna de DEAE-Sepharosa. Tras finalizar la elucin con un
gradiente de fuerza inica se recuperan, en total, 18,9 mg de protena, sin
embargo no se detecta ninguna actividad del enzima E. Da una explicacin a esta
ausencia de actividad. Qu ha podido ocurrir?

0
0.2
0.4
A



0 10 40 30 20 50 60
Ve (mL)
V
0

6.4 cm
10 cm
7.5e.- Durante el proceso de purificacin de un enzima, un investigador emplea
un sistema cromatogrfico tras el cual se obtiene un incremento de la actividad
total por arriba incluso de la actividad total presente en el extracto crudo de
partida. Cmo puedes explicar esto?

7.6e.- Indicar el orden de elucin de los componentes de una mezcla de los
siguientes pptidos en una experiencia de cromatoenfoque con una columna
equilibrada a pH 9,0 eluda con un tampn multi-inico a pH 4,0 (en la Tabla se
proporcionan los pKa de los grupos disociables de cada pptido). Razona la
respuesta.
Pptido pKa
a) Asp-Gly-Ala 2,1 4,5 9,0
b) Ala-Val-His-Gly 3,1 6,5 9,7
c) Ala-Ile-Lys-Gly 3,6 8,0 10,4
d) Val-Gly-Leu 3,3 9,7
e) Lys-Gly-Ala-Glu 3,2 4,2 8,3 10,5

S: c>b>d>e>a, de acuerdo con sus pI aproximados.

7.7e.- Se dispone de una mezcla de protenas cuyas propiedades son las
siguientes:

Protena
Masa
molecular
pI
a 12000 10
b 62000 4
c 28000 7
d 9000 5

Cul sera el orden de elucin de estas protenas en una columna de
DEAE-celulosa eluida con un gradiente de concentracin de sal a pH 8,0? Y en
una columna de Bio-Gel P30?

7.8e. Un enzima requiere la presencia de Mg
2+
para su actividad. La eliminacin
del in conduce a la desnaturalizacin irreversible de la protena. La
cromatografa de intercambio inico y la de exclusin molecular empleados en la
purificacin del enzima llevan a la prdida de la actividad. Intentar explicar a qu
se debe y sugerir que cambios podran hacerse para mejorar la purificacin.

7.9e.- Se pretende analizar la actividad enzimtica de las subunidades separadas
de un enzima tetramrico tras su disociacin. Las subunidades son idnticas y
debe garantizarse que no existen tetrmeros sin disociar en la disolucin de
subunidades a estudiar. Qu sistema cromatogrfico se elegira para separar los
monmeros de los tetrmeros no disociados?

7.10e.- Se ha determinado el volumen de elucin de varias protenas de masa
molecular conocida en columna cromatogrfica de exclusin molecular sobre
Superdex 200. Los resultados obtenidos son los de la Tabla:

Protena Masa molecular Ve (mL)
Citocromo c 12400 206
Quimotripsingeno 25000 184
Ovoalbmina 44000 165
Seroalbmina 68000 153
Lactoperoxidasa 82000 147
Catalasa 240000 115
Fibringeno 330000 106
Tiroglobulina 670000 90

A continuacin se cromatografia sobre la misma columna una protena
problema obteniendo un volumen de elucin de 131 mL. Al repetir esta
cromatografa habiendo disuelto previamente la protena en dodecilsulfato sdico
(SDS) al 1 % y equilibrando la misma columna con la misma disolucin con
SDS 1 %, el volumen de elucin de la protena problema pasa a ser 152 mL.
Calcula la masa molecular de la protena y comenta los resultados.
S: 133000

7.11e.- Se desea separar la siguiente mezcla de protenas: Albmina de suero
(MM 68000), Catalasa (MM 240000), Citocromo c (MM 12400 ) y -
galactosidasa (MM 520000). Qu subtipo de gel Sephacryl S- se puede utilizar
para conseguir una buena separacin? Cul ser el orden de elucin?

7.12e.- Dos molculas de DNA de masa molecular 610
6
, una lineal y otra
circular, cul de ellas eluir en primer lugar en una cromatografa de exclusin
molecular? Y entre RNA ribosmico nativo y desnaturalizado?

7.13e.- Dos protenas de masas moleculares similares presentan, a pH 5,5 una
estructura secundaria considerable (un 75 % de -hlice). A pH 8,5 una de ellas
se desnaturaliza y adquiere una conformacin en ovillo estadstico, pero recupera
su estructura al volver a condiciones de pH 5,5. Disea un procedimiento que
permita separar estas protenas.

7.14e.- Muchas drogas, como la morfina, se unen a receptores especficos en el
tejido nervioso. Disea un procedimiento para la purificacin de estos receptores.
Proporciona los detalles que consideres importantes.

7.15e.- Un investigador est interesado en purificar rpida y eficazmente un
enzima que une ATP desde un extracto crudo conteniendo muchas otras
protenas contaminantes. Qu sistema cromatogrfico le sugeriras? Proporciona
los detalles necesarios para aplicar el sistema propuesto hasta la obtencin de la
protena purificada.

7.16e.- Se quiere purificar una protena que se encuentra fuertemente unida a
DNA. La disociacin de la protena al DNA requiere NaCl 2 M y el tratamiento
del complejo protena-DNA con nucleasas (DNasa) no destruye el DNA (debe
quedar protegido de un modo desconocido). Qu sistema cromatogrfico podra
emplearse para aislar la protena?

7.17e.- Una cierta cantidad de un pptido, previamente purificado, se someti a
hidrlisis cida total. Posteriormente se pas el hidrolizado a travs de un
analizador automtico de aminocidos con lo que se obtuvieron los siguientes
resultados:
moles Masa molecular
Glicina 0,248 75
Arginina 0,093 174
Lisina 0,155 146
Metionina 0,062 149
Serina 0,124 105
Triptfano Trazas 204

El tratamiento del pptido con tripsina y la posterior separacin
cromatogrfica de los productos permiti identificar 9 pptidos ms pequeos. El
tratamiento con bromuro de ciangeno dio lugar a 2 fragmentos a partir del
pptido inicial. El triptfano, el cual es parcialmente destruido en el proceso de
hidrlisis cida, se determin espectrofotomtricamente. Para ello se midi la
absorcin a 280 nm de una disolucin acuosa conteniendo 0,2 mg/mL, en una
cubeta de 1 cm de paso de luz, y se obtuvo una medida de 34,5 % de
transmitancia (
280
triptfano= 5550 M
-1
cm
-1
).
a) Calcula la masa molecular del pptido
b) Cul de las dos hidrlisis selectivas es indicativa del nmero de restos de
aminocidos que hay en el pptido, y cmo se explicara el resultado de la
otra hidrlisis que aparentemente no concuerda?
S: a) 2378 g/mol
7.18e.- Para aumentar la cantidad de material de partida en la purificacin de
protenas por cromatografa de exclusin, debe aumentarse el dimetro de la
columna?, debe aumentarse la longitud?, o deben aumentarse ambos?

7.19e.- En una columna de slice para HPLC se encuentra que un soluto eluye
prcticamente con el frente de solvente cuando la composicin de la fase mvil
es hexano: cloroformo 50 % (v/v).
a) Con qu modo de cromatografa lquida est trabajando?
b) Cmo modificaras la composicin de la fase mvil para obtener una
retencin aceptable?





PROBLEMAS T8 (Estudiantes)
ELECTROFORESIS

8.1e.- Calcular el punto isoelctrico (pI) del cido p-aminobenzoico a partir de
los siguientes datos de electroforesis:

pH 2,0 3,5 4,0 4,5 6,0 8,0 9,0
Distancia
migracin
(cm)
+5,0 +3,6 -0,2 -3,1 -5,2 -5,3 -5,3

8.2e.- En una electroforesis de alto voltaje en papel a pH= 4,0 Cules de los
siguientes aminocidos migrarn hacia el ctodo y cules hacia el nodo?

Gly, Cys, Asp, His, Lys

Si se encontrasen todos ellos formando parte de una mezcla Cmo
quedaran distribuidos tras la electroforesis?

8.3e.- Una mezcla contiene los siguientes pptidos, a los que les corresponden los
valores de pK
a
indicados:

pK
1
pK
2
pK
3
pK
4

Glicilglicina 3,06 8,13
Histidilhistidina 2,25 5,60 6,80 7,80
Glicilalanina 3,15 8,25
Aspartilglicina 2,10 4,53 9,07
Fenialanilarginina 2,66 7,57 12,40

Discutid la posibilidad de separarlos por electroforesis en papel a pH 5,65.

8.4e.- La secuencia amino-terminal de la protena P es:

Val-His-Leu-Pro-Glu-Lys-Gly-Ser-Arg-Met.

Tras someter este pptido a electroforesis de alto voltaje en papel a pH 7,0
se observ una migracin de 0,3 cm hacia el ctodo. El mismo pptido obtenido
de una protena mutante (P*) migr, en las mismas condiciones, 2,9 cm en
direccin al nodo.
Se cree que la mutacin de la protena P* consiste en la sustitucin del
residuo de Leu de la posicin 3 por Asp. Estn de acuerdo los datos
electroforticos con esta hiptesis?

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Sin
obt
pue
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8.6
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la
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8.7
del
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pH
MM
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pH
ede
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ser
las
8.8e.- El revelado especfico de actividad tirosina-aminotransferasa de una
carrera electrofortica correspondiente a un extracto obtenido de hgado de rata
mostr tres bandas (A, B y C). Al objeto de caracterizar estas actividades, los
extractos se sometieron a electroforesis en geles de diferente porcentaje de
acrilamida. Las movilidades electroforticas relativas de las tres bandas fueron:

% acrilamida A B C
2 17,78 10,00 8,87
4 11,24 8,13 6,22
6 7,88 6,24 4,73
8 5,53 4,92 3,07
10 3,66 4,00 2,14

A la vista de los datos, se trata realmente de isoenzimas o podran ser
simplemente agregados oligomricos?

8.9e.- Para averiguar la masa molecular del enzima dihidropterina-reductasa se
someti, junto con protenas patrn de masa molecular conocido, a electroforesis
en geles de distinto porcentaje de acrilamida y se determinaron las pendientes de
las representaciones de Ferguson resultantes. El mismo enzima, y tambin
protenas patrn, se sometieron a SDS-PAGE. Los resultados obtenidos fueron:

Protena MM (KDa) pendiente Rm con SDS
Mioglobina 17 0,48 0,46
Prolactina 24 0,55 -
Ovoalbmina 44 0,66 0,27
Quimotripsingeno 26 - 0,34
Catalasa 58 - 0,21
BSA monmero 66 0,79 -
Dmero de BSA 122 1,16 -
Dihidropterina reduc. ? 0,64 0,42

Discutir los resultados. Qu puedes decir acerca de la estructura del enzima?
S: MM nativo, 40 kDa; MM desnaturalizado, 20 kDa

8.10e.- La protena A posee una masa molecular de 130000. Existe una forma
mutante, A*, en la que dos residuos de Thr estn sustituidos por Asp. La protena
A se escinde, por tratamiento con bromuro de ciangeno, en dos fragmentos: B
(MM 50000) y C (MM 80000). Estos fragmentos se separan por electroforesis en
acetato de celulosa a pH 3.0, siendo la movilidad electrofortica de B mayor que
la de C.

a) Dibuja la representacin de Ferguson (log Rm vs % T) que cabe esperar para
los 4 polipptidos (A, A*, B y C) a pH 3,0. Representa una sola grfica.
b) Dibuja (sealando los polos) el resultado que cabe esperar tras someter una
mezcla de los 4 polipptidos a:
I) electroforesis en SDS-PAGE
II) electroforesis en gradiente de acrilamida (5-30 %) a pH 3,0

8.11e.- Un virus contiene 256 molculas de protenas, de las cuales 64 tienen una
masa molecular de 8100 y las restantes 192 de 26000. Dibuja un esquema del
posible resultado que se obtendra tras disociacin del virus y electroforesis SDS-
PAGE. Hay que tener en cuenta tanto las distancias recorridas como las
intensidades de las bandas correspondientes a cada protena.

8.12e.- Qu posee una mayor migracin electrofortica, un plsmido
superenrollado, circular relajado o lineal, todos de igual nmero de pb? Por
qu? Haz un esquema del resultado de una electroforesis en gel de agarosa de
una muestra que contuviese una mezcla de un plsmido presente en las tres
formas mencionadas?

8.13e.- Por qu para la determinacin electrofortica del tamao de una
molcula de DNA (por comparacin con patrones), esta debe ser lineal?

8.14e.- Por qu los geles de poliacrilamida no sirven para separar fragmentos
grandes de DNA? Por qu los geles de agarosa no generan buena resolucin (al
menos no tan buena como los geles de acrilamida) en la separacin
electrofortica de protenas?

8.15e.- El Bromuro de etidio se emplea en la tincin de geles de agarosa tras la
separacin electrofortica de cidos nucleicos. Cmo funciona? Detecta
igualmente DNA de doble cadena y de simple cadena, RNA, DNA de distintos
tamaos? Explcalo.

8.16e.- La figura adjunta representa el resultado de una electroforesis en gel de
agarosa del plsmido circular pTV172 y de los fragmentos resultantes tras el
tratamiento con distintos enzimas de restriccin. En la lnea de la izquierda se
aplicaron patrones de DNA lineal de tamaos conocidos (kb). Calcula el tamao
del plsmido intacto y describe su mapa de restriccin.


PROBLEMAS T9 (Estudiantes)
CENTRIFUGACIN

9.1e.- Cul es el campo centrfugo aplicado en un punto que gira a 5 cm de su
centro de rotacin y con una velocidad angular de 3000 rad/s
-1
? S: 4510
6
cm/s
2
;
como RCF sera: 45900g.

9.2e.- Para la sedimentacin de la fraccin microsomal de un homogeneizado de
hgado se emplea una ultracentrfuga a velocidad de 40000 rpm. Cul es la
velocidad angular, , en radianes por segundo? Una partcula situada a 10 cm del
centro de rotacin en esta centrifugacin a qu campo centrifugo relativo, RCF,
est sometida? S: 175,510
6
cm/s
2
; RCF= 179000g

9.3e.- Calcula la fuerza centrfuga desarrollada sobre una partcula situada en un
rotor de 10 cm de radio cuando gira a 1000 rpm. Exprsalo con respecto a la
aceleracin gravitacional. Cul sera esa fuerza para una partcula situada a 20
cm del eje de giro? S: RCF
1
=111,9; RCF
2
=223,8

9.4e.- La variacin del coeficiente de sedimentacin, s, con la concentracin para
el enzima cido graso-sintasa (AGS) de glndula mamaria bovina se muestra en
la siguiente Tabla:

AGS (mg/mL) 0,44 2,00 3,77 7,44
s
20,w
(Svedberg) 13,40 13,27 13,06 12,62

La centrifugacin se desarroll a 56000 rpm. Determina la masa molecular
del enzima asumiendo un volumen especfico parcial de 0,72 mL/g y sabiendo
que el coeficiente de difusin D
20,w
es 2,1210
-7
cm
2
s
-1
. Cmo puedes explicar el
descenso de s con la concentracin?
Datos: R= 8,310
7
erg/molK (1erg= 1gcm
2
/s
2
); T= 20 C;
20,w
= 1,0 g/mL.
S: La extrapolacin a concentracin cero proporciona s
0
= 13,5S. De aqu aplicando la
expresin derivada de Svedberg: M= sRT/[D(1-
d
)] MM= 552000.

9.5e.- Razona la validez de las siguientes afirmaciones:
a) La centrifugacin diferencial permite separar la fraccin nuclear y
mitocondrial de forma eficaz y con un mnimo grado de contaminacin.
b) La centrifugacin diferencial permite separar las fracciones de
peroxisomas y mitocondrias.
c) Los cidos nucleicos RNA y DNA pueden separarse mediante una
centrifugacin isopcnica en gradiente de densidad de cloruro de cesio.
S: a) bien; b) bien pero no siempre; c) bien, la
DNA
1,6-1,7g/mL y
RNA
1,9 g/mL.

9.6e.- El coeficiente de sedimentacin de la protena hemocianina de N. antiqua a
pH 5.7 y en presencia de iones divalentes es de 101,1S. En presencia del agente
quelante EDTA y a pH 7,5 disminuye el s a 60S. A pH 9,2 resulta ser, tan slo,
de 15,9S. Asumiendo que este ltimo valor corresponde al de la subunidad
constituyente, determinar de forma aproximada el nmero de subunidades de la
forma de mayor s. S: Aplicando la aproximacin de la dependencia de s con la MM, lo
que exige asumir i) forma esfrica para todas las formas y ii) idntico para todas las
formas. As s=M
2/3
{[(4/3)
1/3
(1-
d
)]/[N
a
2/3

1/3

2/3
]} y, por lo dicho, todo entre las llaves
son constantes para todas las partculas s= M
2/3
K. s
101,1
/s
60
= (M
s101,1
)
2/3
/(M
s60
)
2/3
y
s
101,1
/s
15,9
= (M
s101,1
)
2/3
/(M
s15,9
)
2/3
y de aqu: M
s101,1
= 16M
s15,9
16 subunidades.

9.7e.- En el fraccionamiento subcelular de un extracto de msculo se determin
la actividad de 4 enzimas marcadores en las 4 fracciones (F1-F4) obtenidas, as
como en el homogeneizado (H) de partida. Los datos resultantes se muestran en
la siguiente Tabla:

Fraccin
Protena
(mg/mL)
Succinato-oxid.
(u/mL)
Lactato-deshidrog.
(u/mL)
Glucosa-6-
fosfatasa (u/mL)
H 31,00 3,20 4,00 6,00
F1 10,00 2,70 0,10 0,50
F2 6,00 0,01 3,50 0,01
F3 7,25 0,10 0,20 4,00
F4 7,20 0,30 0,01 1,00

Identifica cada una de las fracciones y comenta los resultados.
S: Se obtiene la actividad especfica (actividad/concentracin protena) para observar
mayores diferencias que identifican las fracciones [mitocondrial, microsomal y soluble
(citosol)].

9.8e.- El coeficiente de sedimentacin del enzima dimrico xantosina-5-fosfato-
aminasa (X5P-aminasa), deducido por ultracentrifugacin analtica en
experimentos de velocidad de sedimentacin, es de 5,91 S. Tras someter al
enzima completo y a su subunidad, junto con protenas patrn, a
ultracentrifugacin zonal en gradiente de concentracin de sacarosa y fraccionar
el gradiente (de abajo a arriba) se obtuvieron los resultados de la Tabla:

Protena s
20,w
N de fraccin
Catalasa 11,80 15
Alcohol-DH 7,60 23
BSA 4,31 29
Ovoalbmina 3,55 31
X5P-aminasa ? 27
Monmero de X5P-aminasa ? 28

Calcula el coeficiente de sedimentacin del enzima y de su subunidad
constituyente por el mtodo de Martin y Ames.Cmo explicas la discordancia
de los valores de s obtenidos con aquellos deducidos por ultracentrifugacin
analtica? S: s
0
20,w (enzima nativo)
= 5,0S; s
0
20,w (subunidad)
= 4,2S

9.9e.- La fosfatasa alcalina de E. coli posee un coeficiente de sedimentacin de
6,0 S. Una mezcla de fosfatasa alcalina y la protena lisozima se ultracentrifugan
en un gradiente de densidad (isocintico) de sacarosa. Tras centrifugacin el
gradiente es fraccionado perforando el fondo del tubo y recogiendo 30 fracciones
de igual volumen. Al analizar las fracciones se encuentra un mximo de fosfatasa
alcalina en la fraccin 15 y un mximo de actividad lisozima en la 25.
a) Calcula el coeficiente de sedimentacin de la lisozima.
b) Determina la masa molecular de la fosfatasa alcalina sabiendo que la
MM de la lisozima es 17000.
S: Aplicar el mtodo de Martin y Ames en el que slo se emplea una protena patrn. a) aqu
la fosfatasa alcalina es el patrn: s
(lisozima)
= 2S. b) aqu la lisozima es la protena patrn:
MM
(fosfatasa alcalina)
= 88000

9.10e.- Calcula la densidad de
flotacin y el % de pares de bases GC
de un DNA cuyo perfil tras
centrifugacin en un gradiente de
densidad de CsCl es que se muestra en
la tabla:
S: De la representacin de A
260
frente a N
fraccin se obtiene el mximo entre las
fracciones 40-43. As la densidad de
flotacin correspondiente es: 1,665-1,675.
De la relacin emprica entre densidad de
flotacin y el % GC se obtiene:12 %




9.11e.- Una fraccin ribosomal de la bacteria Acetobacter acetii, obtenida por
centrifugacin diferencial en un medio de densidad 1,04 g/mL, presentaba
actividad de enzimas oxidasa. Los investigadores pensaron que en dichas
bacterias deban existir unas partculas (oxidosomas) conteniendo los enzimas
oxidasa que sedimentaban como los ribosomas. Mediante centrifugacin
isopcnica en gradiente preformado de sacarosa encontraron la actividad oxidasa
en una zona del gradiente de densidad 1,23-1,26 g/mL, mientras que los
ribosomas sedimentaban en el fondo del tubo (densidad de los ribosomas
estimada por centrifugacin isopcnica en CsCl, 1,52 g/mL). Los autores de este
N de
fraccin
A
260

Densidad
gradiente (g/mL)
1 0,01 1,580
10 0,01 1,595
20 0,01 1,620
30 0,02 1,645
35 0,20 1,650
37 0,45 1,660
40 0,50 1,665
43 0,45 1,675
45 0,40 1,680
50 0,10 1,690
60 0,03 1,710
trabajo proponen que el dimetro de los oxidosomas (d
ox
) se puede calcular con
la ecuacin:
d
2
ox
(
ox
-1,04) = d
2
rib
(
rib
-1,04)
donde
ox
y
rib
son las densidades de oxidosomas y ribosomas,
respectivamente.
Se conoce, por microscopa electrnica, que el dimetro de los ribosomas
(d
rib
) 70S es de 18 nm. De aqu los autores deducen:
d
2
ox
(1,245-1,04) = 18
2
(1,52-1,04); y as d
2
ox
= 28 nm
Cul es el fundamento terico de obtener de esta forma el tamao de la
partcula?
Es una deduccin rigurosa o implica simplificaciones? Qu crticas
pueden hacerse?
El hecho de que los oxidosomas y ribosomas hayan sedimentado juntos
en el medio de densidad 1,04 g/mL, es casual o hubiese ocurrido de igual forma
en otro medio de distinta densidad (siempre inferior a la de las partculas)?
S: De Svedberg, asumiendo partculas esfricas, s= m
p
(1-
d
)/6r. Como m
p
= Vol
m

m
y

m
= 1/
m
.s= Vol
m
(
m
-
d
)/6r
.
El dimetro d= 2r y el Vol
p
= 1/6d
3
, as s= d
2
(
p
-
d
)/18.
Para los ribosomas y oxidosomas, respectivamente: s
rib
= d
rib
2
(
rib
-
d
)/18; s
ox
= d
ox
2
(
ox
-

d
)/18. Los autores asumen (por centrifugacin diferencial en medio de densidad 1,04
g/mL) que s
rib
= s
ox
y as d
rib
2
(
rib
-
d
)/d
ox
2
(
ox
-
d
), con lo que queda demostrado. Crticas:
son esferas? La densidad de flotacin obtenida en medios distintos no son comparables
(distinta solvatacin). Cmo de exacta es la co-sedimentacin en la centrifugacin
diferencial? Y el tiempo de centrifugacin, se tuvo en cuenta para asumir que s
rib
= s
ox
?

Suponiendo que en este medio es cierto que: s
rib
=s
ox
, es casual, a densidad inferior a 1,04
los oxidosomas, por ser ms grandes seran ms rpidos. Con
d
>1,04 seran los ribosomas
ms rpidos. (ver solucin del problema 9.7 de clase, para una mayor explicacin).

9.12e.- Explicar porque la presencia de bromuro de etidio en centrifugacin
isopcnica en gradiente de densidad con CsCl modifica la densidad de flotacin
del DNA y de forma diferente para DNA circular, DNA superenrrollado y DNA
lineal.
S: El BrEt se intercala, desenrollando un poco la doble hlice, y ello disminuye la densidad
de flotacin. El DNA circular y el superenrrollado, por restriccin topolgica, no unen tanto
BrEt como el lineal. En presencia de BrEt el DNA lineal disminuye su densidad mucho,
menos el circular y an menos el superenrrollado.

9.13e.- La densidad del DNA en CsCl 7 M con MgCl
2
0,01 M es menor que en
CsCl 7 M slo. Porqu?
S: Probablemente el catin divalente, Mg
2+
, con una masa de 24,3 se una a los grupos fosfato
(cargados negativamente). En un medio con slo CsCl, es el catin Cs
+
, masa de 132,9, se
une a los grupos fosfato. Esta diferencia de masas se traduce en diferencias de densidad de
flotacin.
9.14e.- El factor de necrosis
tumoral (TNF) es una protena
implicada en inflamacin y
apoptosis. En las clulas se
encuentra en forma de trmero.
Cuando se obtiene en forma
recombinante, no se conoce si se
organiza en su forma trimrica
natural. La cromatografa de
exclusin molecular, dada su
limitada resolucin, no permite
averiguar su masa molecular con
precisin o si su elucin pudiese
estar afectada por un plegamiento
incorrecto de la forma
recombinante. As se decidi
estimar la masa molecular
mediante ultracentrifugacin analtica.
La grfica muestra los datos del equilibrio de sedimentacin para esta
molcula (empleando 10 g totales) en la que se representa la concentracin de la
protena (como A
230
) en funcin de la posicin en la celda de muestra, tras la
centrifugacin durante 16000 rpm durante 18 horas.

La masa molecular del monmero es de 17000 y el volumen especfico
parcial (), estimado a partir de los volmenes especficos parciales de los
aminocidos constituyentes (n
i
m
i

i
/n
i
m
i
, donde n
i
, m
i
y
i
son el nmero, la
masa molecular y el volumen especfico parcial de cada tipo de aminocido
presente en la protena, respectivamente), de 0,731 mL/g
Es la protena recombinante un trmero, al igual que la forma natural? Si la
respuesta es s, representa de forma aproximada el perfil de equilibrio de
sedimentacin en la figura adjunta, y tambin en cualquier otra grfica que hayas
empleado, asumiendo una forma monomrica. Si la respuesta es no, realiza estas
representaciones asumiendo una estructura trimrica.
Datos: R (cte gases)= 8,3 J/molK= 8,310
7
erg/molK (1erg= 1gcm
2
/s
2
)
Temperatura 20C. Densidad del medio 1,053 g/mL
S: Obtener de la grfica varios valores A
230
y sus valores de x (radio desde el eje). En un
experimento de equilibrio de sedimentacin debe cumplirse: ln C= [M
2
(1-
d
)x
2
]/2RT +
cte. En este caso es equivalente lnC y lnA
230
, por la proporcionalidad entre concentracin y
absorbancia. Asi obtenemos lnA
230
y x
2
, los representamos y obtenemos la pendiente, en este
caso 0,675 cm
-2
. La pte= M
2
(1-
d
)/RT, aplicando y
d
del enunciado y despejando: M=
50900 que corresponde muy cercanamente 3 veces 17000. Se trata por tanto de un trmero.

5.85 5.90 5.95 6.00 6.05 6.10
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a
2
3
0
n
m
Radio desde eje, cm
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
0.1