El virus de la hepatitis C (VHC) es un virus de ARN de cadena positiva [ARN (+)] responsable de

infecciones crónicas en casi 200 millones de personas en todo el mundo. Los pacientes con HCV
positivo tienen un alto riesgo de desarrollar cirrosis y carcinoma hepatocelular (1).

Como un parásito obligado, el VHC usurpa las funciones celulares y las vías para completar su ciclo
de replicación, y algunas de estas rutas están relacionadas con el control del ciclo celular (2). La
familia Akt / proteína quinasa B (PKB) de serina / treonina proteína quinasas está involucrada en
varias vías de señalización que pueden afectar el resultado de las infecciones virales. Akt/PKB
reside en el citosol en una conformación inactiva. La estimulación inicial de la célula provoca la
activación de un receptor de la superficie celular y, posteriormente, la fosforilación de la
fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K).

La PI3K activada es responsable de la formación del segundo mensajero fosfatidilinositol (3,4,5) -

trisfosfato. Akt interactúa con estos fosfoinosítidos y se recluta a la membrana, donde PDK1 y
otras quinasas pueden activarlo completamente. La vía Akt/PKB está involucrada en procesos tan
dispares como el metabolismo de los nutrientes, la regulación de la síntesis proteica, la autofagia y
el equilibrio de la apoptosis versus la supervivencia y proliferación celular, siendo esta última
crítica para el resultado de las infecciones virales (3-6).

Akt/PKB puede influir en la interacción virus-huésped mediante varios mecanismos. Los represores
de traducción 4E-BP son proteínas de unión a factor de iniciación de traducción eucariótico 4E
(eIF4E) que evitan la traducción dependiente de cap de los ARNm celulares.

Akt / PKB es necesaria para la inactivación de 4E-BPs, que ocurre a través de una reacción de
fosforilación que requiere FRAP / objetivo mamífero de rapamicina (mTOR) y da como resultado la
activación de la traducción celular (7).

Akt/PKB es el objetivo posterior de la lípido quinasa PI3K, y ambos están implicados en la

proliferación celular y la apoptosis. En infecciones de células neuronales por el virus dengue
serotipo 2 (dengue-2) y el virus de la encefalitis japonesa, PI3K desempeñó un papel
antiapoptótico, y el bloqueo de la activación de PI3K aumentó la citopatología inducida por virus
sin efecto sobre la producción de virus (8). Estos efectos múltiples de Akt / PKB pueden modular la
traducción dependiente del sitio de entrada del ribosoma interno frente a la entrada de ribosoma
(IRES) así como la supervivencia de células infectadas, lo que puede facilitar la persistencia del
virus. Por lo tanto, no es sorprendente que varias proteínas virales puedan modular las vías de
señalización dependientes de PI3K / Akt (9-12).

Estamos interesados en los factores virales y celulares que pueden modificar la aptitud replicativa
del VHC, lo que permite la persistencia del VHC, un sello distintivo de la infección por este virus in
vivo. No se ha derivado ninguna imagen unificada de descripciones previas de la interacción de las
vías dependientes de HCV y Akt / PKB.

Una activación temprana y transitoria de la vía PI3K / Akt / mTOR por parte de la glucoproteína E2
del VHC dio como resultado una mejora de la entrada del VHC en la célula (13). Esta activación
tuvo lugar 15 minutos después de la infección (p.i.), pero a las 24 h p.i. los niveles de Akt / PKB
activada ya no eran significativos. Desde la inactivación de PI3K / Akt virus infeccioso requerido, se
postuló la participación de los productos génicos del VHC en la inactivación (13).

La inhibición química de Akt/PKB con inhibidores de Akt-II y Akt-V, así como la inhibición genética
con ARN pequeños de interferencia (ARNip) dieron como resultado una reducción de la
infectividad (13). Además, dicha inactivación y la inhibición posterior de la vía PI3 / Akt / mTOR dio
como resultado la autofagia inducida por el VHC (14), que puede contribuir a los reordenamientos
de la membrana para acomodar los complejos de replicación (15, 16). Resultados similares se han
observado recientemente usando inhibidores de mTOR (17). No se conoce cómo se produce la
transición de Akt / PKB desde una forma unida a la membrana plasmática activada
tempranamente a una ubicación del citoplasma.

En el presente informe, describimos una nueva actividad funcional de la HCV polimerasa NS5B que
consiste en la interacción con Akt / PKB, lo que resulta en la translocación de esta quinasa clave
del citoplasma a la región perinuclear, donde las dos proteínas se colocalizan. Esta relocalización
de Akt / PKB puede ser un mecanismo adicional de modulación temporal de su actividad
citoplásmica y reclutamiento para ayudar en funciones replicativas. Reubicación de Akt / PKB en
virtud de su interacción con NS5B podría tener consecuencias adicionales para el VHC, desde la
limitación de la entrada de células a la fosforilación de los componentes virales de los complejos
replicativos. Varios inhibidores de Akt / PKB están actualmente en ensayos clínicos,y esta vía de
señalización también podría ser dirigida para el tratamiento de la infección por VHC.

MATERIALES Y MÉTODOS

Reactivos, plásmidos de expresión e inhibidores.

Plásmido pDest14-NS5B∆21-FP que codifica NS5B de HCV fusionado a citrina y plásmido

pRSETcitrina, que codifica citrina, así como vectores para sobreexpresar Akt/PKB etiquetados con
el epítopo de hemaglutinina (HA) y NS5B marcados con citrina (pcDNA- Dest40-NS5B-citrina), se
han descrito anteriormente (18, 19). La Akt / PKB recombinante se adquirió de Biaffin (Biaffin
GmbH & Co.), inhibidor de Akt/PKB MK2206 de Selleckchem, Lipofectamine 2000 de Invitrogen y
G418 de Lonza. Las células Huh7.5 y el replicón subgenómico del VHC pI389 / NS3-3 = /
LucUbiNeo-ET fueron amablemente proporcionados por R. Bartenschlager (Universidad de
Heidelberg, Heidelberg, Alemania) (20). Se utilizaron los siguientes anticuerpos: anti-HA (BAbCo),
proteína fluorescente antigreen (anti-GFP, Covance), anti-NS5B (ab35586; Abcam), anti-Akt y anti-
pAkts473 (Cell Signaling Technology), y antitubulina (Santa Cruz Technology). Se usaron
anticuerpos conjugados con Alexa Fluor 488 y 546 (Invitrogen) como anticuerpos secundarios
fluorescentes.
HCV NS5B∆21-FP y purificación de GFP.

Los mutantes puntuales en NS5B\delta 21 fusionados a citrina se generaron mediante

mutagénesis dirigida al sitio de acuerdo con las instrucciones del fabricante (QuikChange site-
directedmutagenesis, Agilent Technologies). Los oligonucleótidos sintéticos usados para la
generación de mutantes puntuales se describen en la Tabla S1 en el material suplementario, y los
cromatogramas de los resultados de la secuenciación se muestran en la Fig. S1B en el material
suplementario. NS5B∆21 de tipo silvestre y mutantes de NS5B∆21 fusionados a citrina así como a
citrina recombinante se sobreexpresaron y purificaron como se describió previamente (19, 21).

Brevemente, las células de Escherichia coli Rosetta (Novagen) se transformaron con la

construcción pDest14-NS5B∆21-FP, que codifica la proteína de fusión NS5B-FP, o con pRSET-
citrina, que codifica la proteína citrina recombinante. Se recogieron las células que expresaban la
proteína de interés, y la proteína se purificó por cromatografía de afinidad.

Se realizaron SDS-PAGE y tinción con azul de Coomassie para evaluar los pasos de purificación. Las
fracciones que muestran la proteína más pura y la más concentrada se combinaron, se dializaron
frente a tampón de diálisis (Tris-HCl 20 mM [pH 7,0], NaCl 1 M, glicerol al 10%) y se almacenaron a
4°C. Se usaron SDSPAGE y tinción con azul de Coomassie para controlar todos los pasos de
purificación. Las proteínas purificadas finales se cuantificaron por densitometría. Solo las proteínas
con al menos un 95% de pureza según se juzgó mediante SDS-PAGE y tinción con azul de
Coomassie se usaron para experimentos adicionales.

Ensayo de quinasa in vitro.

HCV NS5B-FP, NS5B-FP mutantes puntuales, o proteína de citrina (1,6 μg) se incubó en tampón de
cinasa caliente (20 mM de HEPES [pH 7,4], 10 mM de MgCl2, 10 mM de MnCl2, 1 µCi de [ -32P]
ATP, Ditiotreitol [DTT] 1 mM) en presencia de 0,5 \ mu g de Akt / PKB recombinante (BiaffinGmbH
& Co). Los productos se separaron en un gel SDS-PAGE. Después de la electroforesis, el gel se secó
y los productos radiomarcados se detectaron por autorradiografía. Alternativamente, los geles
secados se expusieron a pantallas de fosforimager y se escanearon con Typhoon9600 (Molecular
Dynamics)

Ensayos de replicación de ARN polimerasa dependiente de ARN in vitro (RdRP).

Los ensayos de RNA polimerasa se realizaron utilizando el sustrato simétrico LE-19 (secuencia 5 =
UGUUAUAAUAAUUGUAUAC 3 =), que es capaz de iniciación de novo (DN), extensión de cebador
(PE) y cambio de plantilla (TS) como se describió previamente (19) . Excepto cuando se indique lo
contrario, se preincubó NS5B 200 nM durante 30 min en una mezcla de reacción que contiene
MOPS 20 mM (ácido morfolinapropanosulfónico) (pH 7,3) y MnCl2 5 mM, en presencia o ausencia
de Akt (0,5 \ mu g de Akt / PKB recombinante [BiaffinGmbH & Co]), y complementado o no con
ATP (500? M), como se indica en la leyenda de la figura. Las reacciones se iniciaron al agregar 500?
M de GTP, 100? M de ATP y UTP, y 1? Ci [? -32P] CTP (3.000 Ci / mmol; PerkinElmer Life Sciences).
Las reacciones se detuvieron con tampón de carga de EDTA / formamida en diferentes puntos de
tiempo como se indica.
Los productos se separaron usando electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante (ácido
fosfonoacético al 23% [PAA], 7Murea). Los geles se expusieron a pantallas de Phosphorimager y se
escanearon con Typhoon (Molecular Dynamics).

La cuantificación se obtuvo ejecutando muestras en geles paralelos y determinando los volúmenes

de las bandas utilizando el software ImageQuant (GE Healthcare).

Transcripción in vitro, electroporación y formación de colonias.

Después de la digestión con ScaI, replicon DNA se extrajo con fenol-cloroformo.

La transcripción in vitro se realizó con 1 μg de ADN digerido y el kit Megascript T7 (Ambion) de

acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN obtenido se purificó con el kit MegaClear
(Ambion), se cuantificó y se almacenó a - 80 ° C hasta su uso. Las células Huh7.5 se electroporaron
con ARN transcrito del replicón utilizando el kit Electrobuffer (Cell projects, Iberlabo, Madrid,
España), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células que crecían
exponencialmente se cosecharon y se lavaron con medio de electroporación. Cuatro microgramos
de replicón ARN y 6µg de transportador Huh7.5 ARN se mezclaron con el medio de
electroporación y se agregaron a 4 X 10 6 celdas. La suspensión celular se pulsó una vez con Gene
Pulser II (ajustes, 975 µF y 270 V, Bio-Rad).

Después de la electroporación, 2 X 10 6 Se sembraron de células (y diluciones 1/10 y 1/20) sobre

placas de Petri en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Sigma-Aldrich Química,
Madrid, España) con suero bovino fetal al 10% (HyClone, Fisher Scientific, Madrid, España),
suplementado con HEPES 1M (Sigma), glutamina al 1%, aminoácidos no esenciales, antibióticos
(penicilina, estreptomicina) y piruvato de sodio. Las células se mantuvieron al 5% de CO2 y a 37 °
C. Veinticuatro horas más tarde, el medio de cultivo DMEM se reemplazó por medio nuevo que
contenía G418 (Labclinics, Barcelona, España), después de lo cual el medio se renovó dos veces
por semana durante 2 semanas.

Infección de virus de cultivo celular.

El origen de la línea celular Huh-7.5, los procedimientos para el crecimiento celular en DMEM, el
virus utilizado en los experimentos rescatados del plásmido Jc1FLAG2 (p7-nsGluc2A) (una quimera
de J6 y JFH-1 del genotipo 2a) y los procedimientos utilizados para preparar el stock de virus inicial
HCVp0, para valorar partículas infecciosas virales, y para cuantificar el ARN viral se han descrito
previamente (23, 24). Para realizar infecciones por inmunofluorescencia y ensayos de
cuantificación de ARN, 1x105 Se infectaron células Huh7.5 con HCVp0 a una multiplicidad de
infección (MOI) de 0,5 50% de dosis infectiva de cultivo tisular (TCID50) / célula. Después de 5 h de
adsorción del virus, los sobrenadantes se reemplazaron por medio nuevo con o sin el inhibidor
MK-2206. Las células infectadas se incubaron adicionalmente a 37 ° C durante 2 h y 43 h. Para
realizar infecciones con HCVp0 para ensayos de coinmunoprecipitación, 4 x10 6Se infectaron
células Huh7.5 con HCVp0 a una MOI de 0,5 TCID50 / célula. Después de 5 h de adsorción del
virus, los sobrenadantes se reemplazaron con 10 ml de medio nuevo. Las células infectadas se
incubaron adicionalmente a 37 ° C durante 72 h. La ausencia de contaminación se comprobó
manteniendo y titulando las células infectadas de manera simulada y sus sobrenadantes en
paralelo con los cultivos infectados. No se detectó infectividad en los cultivos infectados de
manera simulada en ninguno de los experimentos.

Coinmunoprecipitación.

Se recogieron células Huh7.5 de transfección o experimentos de infección 48 h después de la

transfección o posinfección en tampón de lisis HNTG (HEPES 25 mM [pH 7,5], NaCl 0,3 M, MgCl2
1,5 mM, EDTA 0,2 mM, Triton X-100 al 1%, 0,1% SDS, ácido desoxicólico al 0,5%, B-glicerofosfato
20 mM) que contiene inhibidores de proteasa y fosfatasa (2µg/ml de leupeptina, 2 µg/ml de
aprotinina, 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo [PMSF] y 0.1mMNa3VO4). Los lisados celulares
se centrifugaron a 12,000 X g durante 1 minuto a 4ºC. Los sobrenadantes se recuperaron, se
mezclaron con 1 μg de anticuerpo primario y se incubaron durante 2 h a 4ºC. Después de esto, las
mezclas de reacción se incubaron durante 3 h con proteína G (Gamma Bind Sepharose,
Amersham) y se lavaron una vez en tampón de lisis HNTG. Los inmunocomplejos unidos a la
proteína G agarosa se recogieron por centrifugación a 12,000 X g durante 1 minuto y se lavaron
una vez con tampón de lisis, y las proteínas se detectaron por transferencia de Western.

Análisis de Western Blot.

La cuantificación de la proteína se realizó utilizando el kit de ensayo de proteína bicinchoninic

(BCA) (Pierce, Madrid, España) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las muestras se
separaron en geles de SDS-PAGE al 10% y se transfirieron a membranas de Immobilon-P
(Millipore). Las membranas se probaron con anticuerpos primarios como se indica en las figuras
correspondientes. Las proteínas se visualizaron usando anticuerpos secundarios adecuados
conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Santa Cruz Biotechnology). La detección de
anticuerpos se logró mediante quimioluminiscencia mejorada (Amersham, GE Health Care) en un
sistema LAS-3000 (FujiFilm, Japón). Tubulina fue utilizado como un control de carga.

RT-PCR en tiempo real para la cuantificación de ARN.

El ARNm de Akt / PKB se cuantificó mediante PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) usando un
sistema de detección de secuencia FAST ABIPrism 7500 (Applied Biosystems). El ADNc se amplificó
usando la mezcla maestra SYBR1 Green PCR (Applied Biosystems) en presencia de los
oligonucleótidos específicos Akt_sense (5 = -ACATCTGTCCTGGCACAC-3 =; orientación de
detección) y Akt_antisense (5 = -GCCAGTGCTTGTTGCTTG-3 =; orientación antisentido). Las
condiciones para la amplificación por RT-PCR y la cuantificación del ARN fueron como se describió
previamente (25). Los cebadores para qPCR se diseñaron utilizando el software Primer Express,
que se proporcionó con el sistema de detección de secuencia 7000 (Applied Biosystems).

Los oligonucleótidos se adquirieron en Thermo Scientific (Madrid, España). La RT-PCR cuantitativa

en tiempo real del ARN del VHC se llevó a cabo utilizando el kit Light Cycler RNA Master SYBR
green I (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La región no codificante 5 = -
traducida (5 = -UTR) del genoma del VHC se amplificó usando oligonucleótidos VHC-5UTR-F2 (5 =
TGAGGAACTACTGTCTTCACGCAGAAAG, orientación de sentido) y VHC-5UTR-R2 (5 = -
TGCTCATGGTGCACGGTCTACGAG; orientación antisentido) . La cuantificación se realizó en relación
con una curva patrón obtenida con cantidades conocidas de ARN de VHC, sintetizadas mediante
transcripción in vitro del ADN de ADN de plásmido. La especificidad de las qRT-PCR se controló
determinando las curvas de desnaturalización de los ADN amplificados. Los controles negativos
(sin plantilla de ARN y / o con ARN de células infectadas de manera simulada) se corrieron en
paralelo con cada reacción de amplificación para determinar la ausencia de contaminación con
plantillas no deseadas.

Ensayos de inmunofluorescencia.

El protocolo de inmunocitoquímica fue el mismo para las células Huh7.5 infectadas con HCVp0 y
transfectadas. Brevemente, en los puntos de tiempo deseados, las células situadas en
cubreobjetos que se trataron previamente con poli-L-lisina (Sigma) se fijaron en paraformaldehído
al 4% durante 10 min, se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,2% durante 10 min, se lavaron con
fosfato solución salina tamponada (PBS), y bloqueada con 5% de albúmina de suero bovino (BSA;
Sigma). Las muestras se incubaron durante la noche en BSA al 0,5% con anticuerpos primarios (1:
1000) en diversas combinaciones, como se indica en las figuras correspondientes. Después de
lavar con PBS, las muestras se incubaron con anticuerpos secundarios fluorescentes.

Los núcleos se visualizaron con 4’6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; Invitrogen). Las imágenes de las
muestras se tomaron usando un microscopio confocal Zeiss LSM-710.

Análisis estadístico.

Las comparaciones estadísticas entre los grupos se realizaron con pruebas t de Student. Se indican
diferencias significativas (P< 0.05) entre los conjuntos de datos. Aquellos con valores P de< 0.01 se
consideraron altamente significativos.
Resultados

Fosforilación in vitro de NS5B por Akt / PKB.

Akt / PKB fosforila los residuos Ser y Thr dentro del consenso mínimo

secuencia ArgXArgXX (Ser / Thr) h, donde X es cualquier aminoácido y h es un aminoácido

hidrófobo voluminoso (22, 26). Escaneamos la secuencia de aminoácidos de la poliproteína del
VHC usando el software Scansite (27) y observamos una acumulación de sitios de fosforilación
conducidos por Akt putativos expuestos en NS5B (Fig. 1A y B). La accesibilidad relativa de la
superficie de residuos se investigó utilizando el programa NetSirfP (28) y la herramienta de "área
de superficie accesible y cálculo de accesibilidad para proteínas" (Centro de Biología
Informacional, Universidad de Ochanomizu; http://cib.cf.ocha.ac.jp/bitool). /COMO UN/). Nueve
residuos NS5B fueron reconocidos como posibles dianas de Akt / PKB (Fig. 1A).

Los aminoácidos Thr227 y Thr389 fueron enterrados, con baja accesibilidad superficial relativa de
9% y 10%, respectivamente, mientras que los residuos Ser453, Thr53, Thr520, Ser84, Ser506,
Ser46 y Ser513 mostraron accesibilidades relativas de superficie que van del 14% al 79% (Fig. .1A y
B).

Además, los residuos expuestos se encuentran en subdominios flexibles que pueden alterar su
exposición durante el ciclo catalítico (29). Por lo tanto, la mayoría de los supuestos sitios de
fosforilación de Akt / PKB en NS5B están suficientemente expuestos a la superficie como sustrato
para esta quinasa.

Cuando se investiga la fosforilación in vitro de NS5B de HCV por Akt / PKB, es importante distinguir
entre la fosforilación de NS5B y la autofosforilación de Akt / PKB porque las dos proteínas tienen
una masa molar similar de aproximadamente 65 kDa (figura 1C). Por esta razón, se realizó un
ensayo de fosforilación in vitro utilizando un NS5B recombinante fusionado al citrino derivado de
GFP (NS5B-FP) que produce una proteína de fusión de 90 kDa (19). El ensayo reveló

fosforilación de ambas proteínas, pero la fosforilación de NS5B-FP dependía de la presencia de Akt

/ PKB (Fig. 1D).

El inhibidor de Akt / PKB MK-2206 inhibió la fosforilación de NS5B de una manera dependiente de
la concentración (Fig. 1D). No se observó fosforilación de citrina recombinante (27 kDa) (figura 1C)
por Akt / PKB (figura 1E). Concluimos que Akt / PKB fosforila el VHC NS5B in vitro.

Los restos Ser o Thr en las posiciones 53, 84, 227 y 543 se conservaron totalmente entre los
genotipos 1 a 7 (véase la Fig. S1A en el material suplementario). Thr en la posición 389 se conservó
casi totalmente para los genotipos 1, 2, 3 y 7, y Ser en la posición 506 se conservó solo para el
genotipo 1 (véase la Fig. S1A en el material suplementario). Estas seis posiciones con diferentes
niveles de conservación entre los genotipos se mutaron a Ala en el contexto de la proteína de
fusión NS5B-FP (véase la Fig. S1B en el material suplementario). También construimos y
purificamos el doble mutante T53A / S506A, porque ambas posiciones están involucradas en

Las interacciones NS5B-NS5B y las modificaciones en sus cadenas laterales podrían afectar los
contactos proteína-proteína (29). Las proteínas resultantes se sobreexpresaron, y las proteínas
purificadas se sometieron al ensayo de quinasa in vitro como se describió anteriormente. Ninguno
de estos mutantes perdió su capacidad de ser fosforilado por Akt (Fig. 1F).

Este resultado indica que Akt fosforila más de un residuo o que Akt fosforila NS5B en secuencias
no canónicas o no conservadas

Efecto de la inhibición de Akt / PKB en la replicación del VHC.

Para confirmar la implicación de Akt / PKB en el ciclo de replicación del VHC, se realizaron
experimentos usando nuestro sistema experimental in vivo (23). Estudios previos han establecido
que algunos inhibidores de Akt / PKB como Akt-II y Akt-V, así como los ARNic que se dirigen a Akt,
afectan a la replicación del VHC (13, 14). MK-2206 es un inhibidor altamente selectivo de Akt
actualmente en ensayos clínicos (https://clinicaltrials.gov). MK-2206 tiene una concentración
inhibitoria del 50% (IC50) en el rango nanomolar bajo, y no muestra actividades inhibidoras contra
otras 250 proteínas quinasas. Por estas razones y porque este inhibidor no era

usado en experimentos de propagación de VHC antes, se probó MK-2206 en células Huh7.5

infectadas con HCVp0, como se describe en Materiales y Métodos. El ARN viral de células tratadas
y no tratadas con MK-2206 se cuantificó en diferentes puntos de tiempo posteriores a la infección
(figura 2). La infectividad viral en el sobrenadante del cultivo celular mostró poca variación a las 7
h p.i. Sin embargo, disminuyó de una manera inhibidora dependiente de la dosis a las 48 h p.i. (Fig.
2A). El ARN viral intracelular aumentó ligeramente con concentraciones elevadas de inhibidor a las
7 h p.i., mientras que permaneció invariante a las 48 h p.i. (Fig. 2B). Comparamos los valores
obtenidos a las 48 hy 7 con una medida de cómo se estaba desarrollando la infección en células
tratadas y no tratadas para cada condición experimental.

Ambas relaciones de infectividad del VHC y ARN del VHC mostraron disminuciones
estadísticamente significativas de una manera dependiente de la dosis del inhibidor (Fig. 2C y D).
La viabilidad celular no se alteró significativamente (Fig. 2E).

Efecto de la fosforilación de NS5B sobre la actividad de la polimerasa.

NS5B es fosforilado por Akt (Fig. 1C y D), y la inhibición de Akt indujo una disminución en la
infectividad de HCV (Fig. 2). Para analizar el efecto de la fosforilación de NS5B sobre la actividad de
ARN polimerasa dependiente de ARN, se preincubó NS5B de VHC a temperatura ambiente con Akt
recombinante o con Akt en combinación con ATP como se describe en Materiales y Métodos.
Después de esto, la reacción de síntesis de ARN se inició mediante la adición de nucleótidos y
radioisótopos y se detuvo después de 15 o 30 minutos (Fig. 3A y B). Akt es capaz de fosforilar NS5B
en estas condiciones (Fig. 3C). La presencia de Akt y especialmente Akt más ATP inhibió la
actividad de ARN polimerasa de NS5B. Este efecto fue más fuerte a los 30 minutos de reacción.
Todas las reacciones llevadas a cabo por HCV NS5B, es decir, iniciación de novo (DN), extensión del
cebador (PE) y cambio de plantilla (TS), se vieron afectadas (Fig. 3A y B). Por lo tanto, la presencia
de Akt en la mezcla de reacción, y especialmente la fosforilación de NS5B por Akt, disminuyó la
actividad de la polimerasa.

A continuación, probamos una posible interacción in vivo entre NS5B y Akt / PKB. Un lisado de
células transfectadas transitoriamente con plásmidos que codifican Akt / PKB (marcado con un
epítopo de HA en el plásmido pcFEL) y NS5B-FP (pcDNA-Dest40-NS5B-citrina) se inmunoprecipitó
con anti-GFP (para precipitar NS5B-FP) y borrado con anti-HA (para visualizar Akt / PKB). Se obtuvo
una banda de masa molar compatible con Akt / PKB (figura 4A). Para confirmar este resultado, el
lisado celular se inmunoprecipitó con anti-HA y se transfirió con anti-GFP. Se obtuvo una banda de
una masa molar compatible con NS5B-FP (véase la Fig. S2 en el material suplementario). Para
examinar la interacción en el contexto de la poliproteína del VHC, se realizaron experimentos de
coinmunoprecipitación usando células Huh7.5 infectadas con VHC como se describe en Materiales
y Métodos. En extractos de células infectadas con HCVp0, se detectó una banda con el tamaño
esperado de la Akt / PKB endógena en la fracción inmunoprecipitada

con anti-NS5B (figura 4B). Por lo tanto, NS5B también interactúa con Akt / PKB en células
infectadas. A continuación, examinamos si la interacción de NS5B con Akt / PKB inducía cambios
en Akt / PKB celular a nivel de mRNA o proteína y también en el estado de fosforilación de Akt /
PKB. La transfección de células Huh7.5 con un plásmido que codifica NS5B-FP (pcDNA-Dest40-
NS5B-citrina) no modificó los niveles de proteína Akt / PKB, la activación de Akt / PKB ni los niveles
de mRNA de Akt / PKB (figura 5).

Por lo tanto, NS5B interactúa con Akt / PKB sin afectar el ARNm o la proteína Akt / PKB

Localización intracelular de Akt / PKB y NS5B.

Para identificar el sitio intracelular de la interacción entre Akt / PKB y HCV

Se transfectaron células NS5B, Huh7.5 con plásmidos que codifican Akt / PKB (pcFEL) y NS5B-FP
(pcDNA-Dest40-NS5B-citrina), y las proteínas expresadas se localizaron mediante microscopía
confocal. En reposo, las células Huh7.5 no estimuladas, Akt / PKB se distribuyeron uniformemente
en el citoplasma, como se describió previamente (30), y la distribución NS5B fue perinuclear,
también como se esperaba de los resultados previos.

(31) (Fig. 6A, paneles Akt-HA y NS5B-FP). Por el contrario, en células Huh7.5 cotransfectadas con
plásmidos que expresan las dos proteínas, la localización subcelular de Akt / PKB cambió
drásticamente, y se colocalizó con NS5B en la región perinuclear (Fig. 6A). La distribución
subclínica de Akt / PKB dependió de la expresión de NS5B de HCV (comparar flechas sólidas y
discontinuas), y se observó la ubicación perinuclear en el 95% de las células analizadas (n = 150)
(Fig. 6B). La misma colocación perinuclear de Akt / PKB y HCV NS5B ocurrió en células Huh7.5 que
expresaban establemente proteínas no estructurales de VHC a partir del replicón subgenómico
pI389 / NS3-3 = / LucUbiNeo-ET (Fig. 7), con colocalización perinuclear en el 87% de las células
analizadas (n 150) (Fig. 7B).

Para excluir que la colocalización perinuclear podría ser un mero efecto secundario de la
sobreexpresión de las proteínas relevantes, la inmunocitoquímica se realizó con células Huh7.5 no
infectadas o infectadas con HCVp0 (figura 8). Las células no infectadas mostraron Akt / PKB
distribuidas homogéneamente en el citoplasma y la ausencia de NS5B, como se esperaba (Figura
8A, paneles Akt-C y NS5B-C). Sin embargo, en células infectadas con HCVp0, Akt / PKB y HCV NS5B
colocalizaron en la región perinuclear (Fig. 8A).

La relocalización de Akt / PKB del citoplasma a la región perinuclear se relacionó con la expresión
de NS5B (Fig. 8A, compare flechas sólidas y punteadas). La colocalización perinuclear se observó
en el 82% de las células analizadas (n = 150) (Fig. 8B).

Por lo tanto, la interacción NS5B-Akt / PKB dio como resultado la relocalización subcelular de Akt /
PKB de regiones citoplásmicas a perinucleares, independientemente del sistema utilizado para la
expresión intracelular de estas proteínas.