MASTER UNIVERSITARIO EN BIOMEDICINA EXPERIMENTAL

GENÉTICA MÉDICA
EXPERIMENTAL

MANUAL DE PRÁCTICAS CURSO 2017/18

LABORATORIO DE GENÉTICA MOLECULAR HUMANA

FACULTAD DE MEDICINA DE ALBACETE (UCLM)

PROFESORADO:
Dr. Julio Escribano Martínez (julio.escribano@uclm.es)
Dr. Francisco Sánchez Sánchez (francisco.ssanchez@uclm.es)
Dr. Jose Daniel Aroca Aguilar (josedaniel.aroca@uclm.es)
2
 ÍNDICE

ÍNDICE DE CONTENIDOS

CRONOGRAMA DE LAS PRÁCTICAS A REALIZAR…………………………………………………………………..… 4

PRÁCTICA 1: PURIFICACIÓN DE ADN GENÓMICO A PARTIR DE MUESTRAS DE SANGRE Y

SALIVA…………………………………………………………………………………………………………………….…………….7

PRÁCTICA 2: DETECCIÓN DE MUTACIONES DESCONOCIDAS MEDIANTE SECUENCIACIÓN

SANGER…………………………………………….………………………………………………………………………………..11

PRÁCTICA 3: ANÁLISIS DE VARIANTES POLIMÓRFICAS HUMANAS Y MUTACIONES CONOCIDAS

MEDIANTE SONDAS TAQMAN Y ELECTROFORESIS CAPILAR. …..…………………………………..………15

PRÁCTICA 4: PRODUCCIÓN DE CONSTRUCCIONES MUTANTES DE cDNA MEDIANTE

MUTAGÉNESIS DIRIGIDA…………………………………………………………………….………………………………..19

PRÁCTICA 5: ANÁLISIS FUNCIONAL DE VERSIONES MUTANTES DE MIOCILINA. RELACIÓN

GENOTIPO-FENOTIPO…………………………………………………………………………………………………………..24

ANEXOS:

ANEXO 1: PROTOCOLO DE PREPARACIÓN DE LISADOS CELULARES Y FRACCIONAMIENTO

BÁSICO………………………………………………………………………………………………………………….…………….36

ANEXO 2: WESTERN BLOT, DIAGNOSTICO DE PROBLEMAS Y POSIBLES SOLUCIONES…………….37

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CRONOGRAMA
Práctica 1. Purificación de ADN genómico a partir de muestras de sangre y saliva.

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 Práctica 1. Purificación de ADN genómico a partir de muestras de sangre y saliva.

PRÁCTICA 1

PURIFICACIÓN DE ADN GENÓMICO A PARTIR DE MUESTRAS DE

SANGRE Y SALIVA

OBJETIVOS:
1.-Conocer los fundamentos del proceso de aislamiento de ADN genómico humano para llevar a
cabo estudios genéticos a partir de diferentes muestras biológicas.
2.-Caracterizar el ADN genómico obtenido mediante el análisis de su concentración, pureza e
integridad.

INTRODUCCIÓN:

El aislamiento de ADN genómico humano constituye el primer paso para la realización de

una gran cantidad de determinaciones clínicas y forenses. El análisis de este ADN permite el
diagnóstico de enfermedades de base genética (por ejemplo, identificación de variantes alélicas
asociadas con una enfermedad o con riesgo de padecerla, identificación de oncogenes, etc.),
hace posible determinar la huella genética para identificar individuos, realizar pruebas de
paternidad, estudiar el epigenoma, etc. Además, el aislamiento de ADN también tiene mucho
interés para la realización de trabajos de investigación.

Como fuente de ADN cromosómico puede emplearse cualquier muestra que contenga
células nucleadas (biopsias, sangre, pelo, células del epitelio de la boca, etc.). En esta práctica
utilizaremos como material de partida sangre periférica humana y saliva, ya que son la fuente
más común de material genético en los entornos clínicos e investigador por la facilidad con que
estas muestras pueden ser obtenidas. En el caso de la sangre, el ADN cromosómico se localiza
exclusivamente en los núcleos de los glóbulos blancos ya que los eritrocitos y las plaquetas
carecen de esta estructura celular. En el caso de la saliva, el ADN está presente en las células
epiteliales de la mucosa bucal que aparecen en la saliva. Como ya sabe el alumno, el ADN
cromosómico se encuentra asociado a una gran cantidad de proteínas (histonas, polimerasas,
topoisomerasas, etc.) que es necesario eliminar para obtener una muestra lo más pura posible
de ADN. Además, cada cromosoma está formado por una única molécula de ADN lineal y de doble
cadena, enormemente larga. Es precisamente su gran longitud, la característica que dificulta el
aislamiento intacto de estas moléculas, ya que durante su manipulación se ven sometidas a
fuerzas que las fragmentan. Aun así, las preparaciones que se obtienen siguiendo este protocolo
son útiles para la mayor parte de los usos a los que se destinan.

7
 Práctica 1. Purificación de ADN genómico a partir de muestras de sangre y saliva.

Los pasos necesarios para aislar el ADN genómico libre de proteínas a partir de muestras de
sangre son:

1. Eliminación del plasma mediante centrifugación.

2. Lisis específica de los eritrocitos y eliminación, mediante centrifugación, de la
hemoglobina liberada.
3. Lisis de los leucocitos para que liberen el ADN cromosómico.
4. Tratamiento con disolventes orgánicos para eliminar las proteínas (asociadas y no
asociadas con el DNA) y los compuestos apolares (lípidos fundamentalmente).
5. Concentración del ADN mediante precipitación.
6. Análisis de la calidad y la concentración del ADN obtenido.

Aunque los pasos anteriormente mostrados corresponden a un protocolo estándar de

purificación de ácidos nucleicos a partir de muestras de sangre, durante los últimos años
diferentes empresas biotecnológicas han desarrollado diferentes kits de purificación de ADN a
partir de diferentes muestras biológicas. Estos kits permiten homogeneizar la calidad del ADN
obtenido a partir de diferentes muestras, no requieren la utilización de sustancias nocivas (como
por ejemplo el fenol), y conllevan un ahorro sustancial de tiempo. En la práctica emplearemos
uno de estos kits, que nos permite la purificación de ADNg tanto a partir de muestras sanguíneas,
como de saliva.

PRÁCTICA 1, 1ª SESIÓN (Martes 5 de diciembre):

El protocolo que seguiremos en esta práctica es el siguiente:

1. Transferir 250 l de sangre un tubo ésteril de 1,5 ml. Para las muestras de saliva, depositar
la muestra de saliva en un tubo de 2 mls, centrifugar brevemente, eliminar el
sobrenadante, y añadir 250 l de PBS.
2. Añadir 25 l de Proteasa OB, y 250 l del buffer BL.
3. Agitar vigorosamente la muestra (15 seg), e incubar a 65ºC durante 10 min.
(durante esta incubación podemos realizar el paso 6)
4. Añadir 260 l de etanol (96-100%) al lisado.
5. Agitar vigorosamente 20 seg, dar un pulso de centrífuga, con el fin de recuperar parte del
lisado que se haya quedado en el interior de la tapadera.
6. Introducir la mini columna en un tubo de 2 ml. Añadir 100 l de buffer para equilibrar la
columna. Incubar 4 min, y centrifugar al máximo durante 20 seg.
7. Depositar la muestra del lisado celular en una columna de purificación.

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 Práctica 1. Purificación de ADN genómico a partir de muestras de sangre y saliva.

8. Centrifugar 1 min, a 10.000 g.

9. Eliminar el líquido que ha atravesado la columna.
10. Añadir 500 l de tampón HB.
11. Centrifugar 1 min, a 10.000 g.
12. Eliminar el líquido que ha atravesado la columna.
13. Añadir 700 l de tampón de lavado.
14. Centrifugar 1 min, a 10.000 g.
15. Eliminar el líquido que ha atravesado la columna.
16. Centrifugar a 13.000g durante 2 min., para eliminar cualquier resto de buffer de lavado.
17. Cambiar la columna a un tubo limpio de 1,5 ml.
18. Añadir 200 l de tampón de elución, atemperado a 65ºC.
19. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
20. Centrifugar 1 min, a 13.000 g.
21. Analizar y cuantificar el ADN obtenido.
22. Almacenar a -20ºC.

PRÁCTICA 1, 2ª SESIÓN (Lunes 11 de diciembre):

Una vez concluido el aislamiento del ADN, el estudiante lo analizará mediante

electroforesis en gel de agarosa para comprobar su integridad. Cómo veremos en esta práctica,
el análisis del ADN mediante electroforesis en agarosa permite conocer características
importantes de la muestra biológica utilizada, tales como su concentración e integridad.

Los geles de agarosa permiten el análisis de grandes moléculas, especialmente ácidos

nucleicos, ya que forman una estructura microscópica con poros de gran tamaño a través de los
cuales pueden pasar las moléculas de ADN. La agarosa es un polisacárido lineal de derivados de
galactopiranosa que se extrae de algas marinas. La movilidad de los ácidos nucleicos en estos
geles depende de su carga eléctrica, tamaño molecular, de la concentración de agarosa, la fuerza
iónica, y la conformación del ácido nucleico. Las concentraciones de agarosa que normalmente
se emplean oscilan entre el 0,3% (p/v) y el 2,0% (p/v). A continuación se indica el rango efectivo
de separación de moléculas de ADN en función del porcentaje de agarosa:

Rango efectivo de
% Agarosa (p/v)
separación (kbases)
0.3 5-50
0.5 2-25
0.7 0.8-10
1.2 0.4-5
1.5 0.2-3
2.0 0.2-2

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 Práctica 1. Purificación de ADN genómico a partir de muestras de sangre y saliva.

Para la detección de los ácidos nucleicos en un gel de agarosa se pueden emplear

diferentes tinciones, aunque la más habitual es bromuro de etidio, un compuesto que emite luz
fluorescente cuando se ilumina con luz ultravioleta. El bromuro de etidio se intercala entre los
pares de bases del ADN mientras éste se desplaza a lo largo del gel de agarosa. Cuando termina
la separación, el gel se ilumina con una lámpara de luz ultravioleta de tal manera que la
fluorescencia emitida por el bromuro de etidio unido al ADN permite su visualización. Durante
los últimos años, diferentes empresas de biotecnología han desarrollado y comercializado
tinciones de ADN memos tóxicas que el bromuro de etidio.

La concentración de las muestras de ADN obtenidas se determinará mediante la medida

de absorbancia a 260 nm y 280 nm, longitudes de onda en la que absorben principalmente los
ácidos nucleicos y las proteínas. A partir de la Abs260 obtendremos la concentración
(normalmente expresada en ngr/l), mientras que la relación Abs260/Abs280 nos indica la
calidad de la muestra, al estimar su contaminación por proteínas, esta relación debe estar cerca
de 2 para que la pureza sea apropiada para la mayor parte de las técnicas.

Una vez caracterizado el ADN genómico obtenido, es conveniente preparar diferentes

alícuotas de cada muestra, con el fin de evitar numerosos ciclos de congelación-descongelación,
que puede provocar la fragmentación del ADN obtenido, y evitar también posibles
contaminaciones de las muestras. Las muestras obtenidas se conservarán a -80ºC hasta su
utilización.

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 Práctica 2. Detección de mutaciones desconocidas mediante secuenciación Sanger.

PRÁCTICA 2

DETECCIÓN DE MUTACIONES DESCONOCIDAS MEDIANTE

SECUENCIACIÓN SANGER.

OBJETIVOS:
1.-Conocer el fundamento y la aplicación de la secuenciación Sanger para la identificación de
mutaciones en genes humanos.
2.-Aprender los principios del diseño de cebadores para la amplificación de fragmentos
genómicos de interés mediante PCR.
3.-Interpretar el análisis de la amplificación PCR mediante electroforesis en geles de agarosa.
4.-Identificar distintos tipos de cambios nucleotídicos (SNP, inserciones y deleciones) en los
electroferogramas resultantes de la secuenciación Sanger.

INTRODUCCIÓN:

Como se ha visto durante las sesiones teóricas, en la actualidad existen numerosas

técnicas diferentes que permiten la identificación de cambios en nuestro genoma. En esta
práctica nos centraremos en una de las técnicas empleadas para la detección de mutaciones
desconocidas cuando el gen en el que estamos interesados estudiar presenta distintas
mutaciones (heterogeneidad alélica), y un número pequeño de exones. En esta práctica, a modo
de ejemplo, vamos a llevar a cabo la detección de una mutación puntual localizada en el gen
MYOC, y que provoca un cambio en el codón 370 que pasa de codificar un residuo de Prolina a
un residuo de Leucina, a través de la secuenciación directa del gen, debido que se trata de un gen
pequeño, compuesto únicamente de 3 exones. Esta mutación provoca el desarrollo de glaucoma
juvenil, y está asociada a unas manifestaciones severas de esta enfermedad, y una mala
respuesta al tratamiento farmacológico. Para ello emplearemos las muestras de ADN genómico
obtenidas a partir de diferentes muestras de sangre en la práctica anterior, y muestras de ADN
procedentes de pacientes con glaucoma.

PRÁCTICA 2, 1ª SESIÓN (Martes 5 de diciembre):

A continuación se muestra el protocolo que vamos a seguir para preparar la reacción de

amplificación del exón 3 del gen MYOC, y las condiciones del termociclador. Durante la sesión
práctica se analizarán los diferentes parámetros y condiciones que se deben tener en cuenta a la
hora de estandarizar una reacción de amplificación.

11
 Práctica 2. Detección de mutaciones desconocidas mediante secuenciación Sanger.

Reactivos Volumen (μl) Tª tiempo

Tampón polimerasa (10X) 5 1X 94ºC 5 min.
NTPs (10 mM) 1 94ºC 30 seg.
Cebador UP (10 pmol/μl) 2 40X 55ºC 30 seg.
Cebador DW (10 pmol/μl) 2 72ºC 30 seg.
Taq polimerasa (1 U/μl) 1 1X 72ºC 5 min.
ADN (50 ngr/μl) 2 1X 4ºC 
Agua 37

PRÁCTICA 2, 2ª SESIÓN (Lunes 11 de diciembre):

En primer lugar, analizaremos el resultado de las reacciones de PCR realizadas en la sesión

anterior, mediante electroforesis en gel de agarosa, y tinción con bromuro de etidio. Para ello
utilizaremos 5 l de cada una de las reacciones, y les añadiremos 1 l de tampón de carga (LB6X).
Utilizaremos además un marcador de pesos moleculares, con el fin de conocer el tamaño
aproximado del producto de amplificación obtenido, y confirmar así la correcta amplificación de
la región genómica deseada.

PRÁCTICA 2, 3ª SESIÓN (Martes 12 de diciembre):

En esta sesión se llevará a cabo la purificación de las reacciones de PCR, con el fin de
eliminar principalmente los restos de cebadores que hayan podido quedar sin ser usados tras la
reacción de PCR. Para ello se empleará el kit de purificación de PCR en placas de 96 pocillos de
Millipore, que realiza la purificación mediante filtración en membrana. La membrana situada en
la columna permite el paso de moléculas pequeñas de ADN (cebadores), y retiene las moléculas
mayores, en este caso el producto de PCR.

El protocolo a seguir será el siguiente:

-Añadir 100 l de H2O ultrapura (MilliQ) a cada tubo de PCR.

-Pasar el contenido de cada tubo a un pocillo de la placa.
-Eliminar liquido mediante succión de vacío (8-10 min, 15 inHg en manómetro).
-Añadir otros 100 l de H2O ultrapura (MilliQ) a cada pocillo.
-Eliminar liquido mediante succión de vacío (8-10 min, 15 inHg en manómetro).
-Añadir 20-40 l de H2O ultrapura (MilliQ) a cada pocillo (Dependiendo de la intensidad
de la banda).
-Recoger PCRs purificadas en tubos limpios.
-Guardar a 4ºC hasta su utilización para la reacción de secuenciación.

Una vez obtenido el ADN molde prepararemos la reacción de secuenciación. La

metodología de secuenciación que usaremos está basada en la reacción inicial desarrollada por
Sanger, en la que se emplean nucleótidos modificados (didesoxinucleótidos) con el fin de detener
el crecimiento de la cadena de ADN de nueva síntesis cada vez que se incorpora uno de estos

12
 Práctica 2. Detección de mutaciones desconocidas mediante secuenciación Sanger.

nucleótidos. La modificación, respecto del método original, más importante del proceso es la
utilización de diferentes fluoróforos (uno para cada una de las 4 bases), lo que permite analizar
la reacción de Sanger en una única calle. Durante estos últimos años, y como consecuencia del
desarrollo del Proyecto Genoma Humano, diferentes empresas (principalmente Applied
Biosystems) han desarrollado kits de secuenciación que permiten obtener secuencias limpias y
analizar fragmentos largos de ADN. Prepararemos la reacción de secuenciación mezclando en un
tubo Eppendorf de 200 μl los siguientes componentes:
Volumen (μl)
ADN molde (ADN plasmídico, o producto de PCR) 1-4
Cebador (10 pmoles) 1
Mix kit (fluoróforos, polimerasa, dNTPs, tampón…) 2
H2O ultrapura (MilliQ) Completar hasta 7

Por cada producto de PCR obtenido se prepararán dos reacciones de secuenciación, en una
se utilizará el cebador UP y en la otra el cebador DOWN con la finalidad de obtener secuencias
solapantes que permitan la lectura completa del producto de PCR. La reacción de secuenciación
tipo Sanger se realizará en un termociclador programado según el siguiente protocolo:

Temperatura (Cº) tiempo

94--------------30 seg.
95 ------------- 30 seg.
65-70 50 ------------- 15 seg.
ciclos 60 -------------- 4 min
4 ----------------- 

PRÁCTICA 2, 4ª SESIÓN (Miércoles 13 de diciembre):

En esta sesión se realizará la purificación de las reacciones de secuenciación, para eliminar

principalmente los nucleótidos marcados no incorporados y los restos de cebadores que hayan
podido quedar tras la reacción. Existen diferentes formas de realizar este paso (precipitación,
afinidad, filtración). Al igual que en la purificación de las reacciones de PCR, también utilizaremos
un sistema de filtración en columna (Millipore) específico para la purificación de reacciones de
secuenciación (Placa azul). El protocolo a seguir será el siguiente:

-Añadir 40 l de Injection solution (Millipore) a cada tubo de PCR.

-Pasar el contenido (47 l) de cada tubo a un pocillo de la placa.
-Eliminar liquido mediante succión de vacío (8-10 min, 15 inHg en manómetro).
-Añadir otros 40 l de Injection solution (Millipore) a cada pocillo.
-Eliminar liquido mediante succión de vacío (8-10 min, 15 inHg en manómetro).
-Añadir 40 l de Injection solution (Millipore) a cada pocillo
-Recoger reacciones de secuenciación purificadas y pasar a placa de secuenciación.
-Desnaturalizar 2 minutos a 94ºC antes de introducirla en el secuenciador.

13
 Práctica 2. Detección de mutaciones desconocidas mediante secuenciación Sanger.

La disolución Injection solution (Millipore) contiene formamida para evitar la formación

de estructuras secundarias y permitir la separación electroforética de los fragmentos de ADN
marcados en el secuenciador.

Los alumnos asistirán a una demostración del proceso de programación del secuenciador ABI
Prism 3130 para la lectura de las secuencias.

PRÁCTICA 2, 5ª SESIÓN (Jueves 14 de enero):

Se analizarán electroferogramas coincidentes con los análisis realizado por los alumnos,
mediante su visualización con el programa “Chromas” (versión gratuita disponible en Moodle).
Para ello se obtendrá la secuencia del gen MYOC de cada paciente mediante el solapamiento de
los dos electroferogramas (UP y DOWN) obtenidos. Ésta será comparada con la secuencia
silvestre del gen MYOC obtenida de la base de datos online “Ensembl” con la finalidad de detectar
cualquier cambio. En caso de detectar cambios en la secuencia se utilizará la base de datos online
para determinar si se trata de una mutación nueva, una conocida, o un polimorfismo presente
en la población.

14
 Práctica 3. Análisis de variantes polimórficas humanas. Detección de mutaciones conocidas
mediante sondas TaqMan y electroforesis capilar.

PRÁCTICA 3

ANÁLISIS DE VARIANTES POLIMÓRFICAS HUMANAS. DETECCIÓN DE

MUTACIONES CONOCIDAS MEDIANTE SONDAS TAQMAN Y
ELECTROFORESIS CAPILAR.

OBJETIVOS:
1.-Conocer y emplear diferentes técnicas de detección de mutaciones conocidas sobre genes
humanos.

RESUMEN TRABAJO PRÁCTICO:

-Diseño de cebadores, y reacción de amplificación.
-Análisis de la reacción de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa.
-Genotipado mediante Sondas Taqman. PCR en tiempo real.
-Análisis de microsatélites en un producto de PCR mediante electroforesis capilar.

INTRODUCCIÓN:

Durante los últimos años se ha producido una revolución en el desarrollo de las técnicas
de detección en nuestro genoma de variantes polimórficas o mutaciones ya conocidas. Algunas
de estas nuevas técnicas permiten detectar millones de cambios en nuestro genoma de una
manera rápida y eficaz.

Sondas Taqman:

Una de estas técnicas se desarrolló a partir de la técnica de PCR a tiempo real con sondas
Taqman. El empleo de dos sondas Taqman, una para cada alelo, marcadas con fluoróforos
diferentes (FAM y VIC, por ejemplo) permite genotipar una mutación patogénica conocida, o un
polimorfismo SNP, durante la misma reacción de amplificación, con el empleo de un
termociclador de PCR en tiempo real. A continuación se muestra un esquema del proceso:

15
 Práctica 3. Análisis de variantes polimórficas humanas. Detección de mutaciones conocidas
mediante sondas TaqMan y electroforesis capilar.

Fig. 1: Esquema de genotipado mediante sondas TaqMan.

Para el desarrollo del este análisis de mutaciones, analizaremos el polimorfismo Pro72Arg

del gen P53, factor de riesgo de diferentes enfermedades humanas.

Análisis de microsatélites mediante electroforesis capilar:

Con el fin de completar el conjunto de técnicas más utilizadas actualmente, realizaremos

además el estudio de mutaciones dinámicas, es decir, mutaciones en secuencias microsatélite,
implicadas en numerosas enfermedades humanas, principalmente afectando al sistema
nervioso, como la Corea de Hungtinton. Para ello analizaremos una secuencia microsatélite
localizada en el exón 1 del gen FOXC1, y que constituye un factor de riesgo para el desarrollo de
glaucoma primario de ángulo abierto. El análisis se realizará mediante PCR fluorescente, y
posterior análisis del producto de amplificación mediante electroforesis capilar, empleando un
equipo de secuenciación automática.

Fig.3: Esquema del microsatélite analizado en el gen FOXC1.

16
 Práctica 3. Análisis de variantes polimórficas humanas. Detección de mutaciones conocidas
mediante sondas TaqMan y electroforesis capilar.

PRÁCTICA 3, 1ª SESIÓN (Lunes 11 de diciembre):

Genotipado con sondas Taqman. PCR a tiempo real.

Para ello analizaremos muestras de ADN de diferentes individuos. Los componentes de la
reacción son los siguientes:

ADNg ------- 1 l
Mix ---------- 5 l (cebadores, polimerasa, nucleótidos)
Sondas ------ 0,3 l
Agua -------- 3,6 l

Tras mezclar bien los reactivos, y dar un spin (centrifugación rápida con el objetivo de
bajar las gotas que puedan haber quedado en la tapa del tubo de reacción), se introducirían los
tubos con los reactivos en la máquina de PCR a tiempo real. La programación de la reacción se
indicará sobre la misma máquina.

Detección del polimorfismo R72P del gen TP53 mediante HRM.

Los componentes de la reacción son los siguientes:

Master mix melting (2x) ------------ 10 µl

Cebador Fw (5 µM) ------------------ 1,2 µl
Cebador Rv (5 µM) ------------------ 1,2 µl
ADN (50 ng/µl) ------------------------ 1 µl
Agua ------------------------------------- 6,6 µl

Las condiciones de amplificación serán las siguientes:

5 min. 94ºC
15 seg. 94ºC
30 seg. 55ºC 40 ciclos
10 seg. 72ºC

Una vez concluida la reacción de amplificación, la curva de disociación del producto de

amplificación generado en la reacción anterior, se obtendrá mediante el incremento de la
temperatura desde 75ºC hasta 90ºC con monitorización continua de la fluorescencia.

17
 Práctica 3. Análisis de variantes polimórficas humanas. Detección de mutaciones conocidas
mediante sondas TaqMan y electroforesis capilar.

PRÁCTICA 3, 2ª SESIÓN (Martes 12 de diciembre):

Análisis de los resultados obtenidos en el genotipado del gen p53.

PRÁCTICA 3, 3ª SESIÓN (Miércoles 13 de diciembre):

Preparación y análisis de fragmentos del microsatélite del gen FOXC1 mediante electroforesis
capilar.

A continuación se muestra el protocolo para preparar la reacción de amplificación del exón

1 del gen FOXC1, y las condiciones del termociclador. Durante la sesión práctica se analizarán los
diferentes parámetros y condiciones que se deben tener en cuenta a la hora de estandarizar una
reacción de amplificación.

Reactivos Volumen (μl) Tª tiempo

Tampón polimerasa (10X) 2 1X 94ºC 4 min.
NTPs (10 mM) 0,4 94ºC 30 seg.
Cebador UP (10 pmol/μl) 1 35X 63ºC 30 seg.
Cebador DW (10 pmol/μl) 1 72ºC 30 seg.
Taq polimerasa (1 U/μl) 0,5 1X 72ºC 5 min.
ADN (50 ngr/μl) 1 1X 10ºC 
Agua 14,1

Uno de los cebadores empleados en la reacción de PCR está marcado con un fluoróforo,
por lo que el producto de amplificación podrá ser detectado directamente por el láser del equipo
de secuenciación automática. Los resultados serán analizados en el laboratorio al día siguiente.

PRÁCTICA 3, 4ª SESIÓN (Jueves 14 de diciembre):

Análisis de los resultados obtenidos en el genotipado del microsatélite del gen FOXC1.

18
 Práctica 4. Producción de construcciones mutantes de cDNA mediante mutagénesis dirigida.

PRÁCTICA 4

PRODUCCIÓN DE CONSTRUCCIONES MUTANTES DE cDNA MEDIANTE

MUTAGÉNESIS DIRIGIDA

OBJETIVOS:
1.-Conocer el proceso que nos permite producir construcciones de cDNA que incorporen
mutaciones detectadas en pacientes y sus aplicaciones.
2.-Conocer los fundamentos del diseño de cebadores y la aplicación de la PCR para mutagénesis
dirigida.
3.-Comprender el fundamento y proceso manual de la obtención de la construcción mutante
mediante la digestión de la hebra molde con enzimas de restricción y su clonación en bacterias.
4.-Aprender y realizar el proceso de identificación de clones positivos mediante la técnica de “PCR
de colonias”.

INTRODUCCIÓN:

Una vez detectado un cambio de nucleótido en una región concreta del gen de interés
que se está analizando en una determinada patología humana, debemos conocer si este cambio
nucleotídico provoca alguna alteración sobre la actividad de la proteína, o sobre la expresión de
dicho gen. En la mayoría de los casos en los que el cambio nucleotídico genera un sitio de parada
prematuro, el efecto de la mutación suele estar claro, ya que en estos casos el ARNm mutante es
degradado por la célula (mecanismo Nonsense Mediated Decay), y no se obtiene proteína
truncada (existen excepciones). Sin embargo, en determinadas ocasiones no es sencillo conocer
el efecto directo que produce el cambio detectado sobre la función proteica, y por lo tanto no se
puede concluir que este cambio nucleotídico sea el responsable de la patología en el individuo
analizado. En estos casos es necesario llevar a cabo ensayos de actividad que permitan analizar
el efecto del cambio nucleotídico detectado. Existen numerosas formas de llevar a cabo estos
estudios, pero para la mayoría de ellos es necesario generar en primer lugar una construcción de
ADN recombinante que contenga la mutación que se desea analizar.

PRÁCTICA 4, 1ª SESIÓN (Viernes 15 de diciembre):

La reacción de mutagénesis dirigida nos permite sustituir de manera precisa cualquier

nucleótido del cDNA del gen que estamos analizando. En esta práctica modificaremos los
codones 370 y 380 de la proteína miocilina (gen MYOC), con el fin de analizar si estas mutaciones
modifican la actividad de esta proteína, y confirmar o descartar así su carácter patogénico.

19
 Práctica 4. Producción de construcciones mutantes de cDNA mediante mutagénesis dirigida.

Diseño de los cebadores:

El diseño de los cebadores es esencial para tener éxito en este tipo de técnicas. La longitud
suele estar comprendida entre 27-45 nucleótidos, aunque va a depender del % CG y del número
de cambios nucleotídicos que deseemos incorporar. Deben ser complementarios al 100%, y los
cambios que deseamos incorporar deben estar centrados en el cebador. Se deben preparar
alícuotas de estos cebadores a una concentración de trabajo de 125 ng/l.

La temperatura de fusión (Tm) de los cebadores debe ser superior a 80ºC, y se calcula
según la siguiente fórmula:
Tm = 81.5 + 0.41 (%GC) – 675/(N-%mismatch)
N: nº de nucleótidos del cebador

Fig. 3: Esquema del sistema de mutagénesis dirigida del kit QuikChange.

20
 Práctica 4. Producción de construcciones mutantes de cDNA mediante mutagénesis dirigida.

Proceso de mutagénesis (reacción de PCR):

Los componentes empleados en la reacción de mutagénesis son los siguientes:

Volumen final de la reacción (50 l)

X l de DNA molde (aprox. 30 ng de plásmido)
1 l de cebador 5’ (125 ng)
1 l de cebador 3’ (125 ng)
5 l de buffer 10X de pfu polimerasa
1 l de dNTP’s 10mM
2 l de pfu polimerasa (posee prueba de lectura)
Agua destilada estéril hasta 50 l.

Condiciones de amplificación:
Temperatura (ºC) tiempo
95 ----------- 3 min.
95 ---------- 30 seg.
20-25 55 ---------- 30 seg.
ciclos 72 ---------- 2,5 min/kilobase de longitud del plásmido (la Pfu es más lenta que la
72 ---------- 10 min. polimerasa normal)
4 ------------ 

PRÁCTICA 4, 2ª SESIÓN (Lunes 18 de diciembre):

Una vez concluida la reacción de PCR de mutagénesis dirigida, se debe:

* Analizar el producto de PCR en gel de agarosa (10-15 l), para confirmar que la reacción
ha funcionado.

* Tratar el producto de PCR con la enzima Dpn I, para eliminar el ADN plasmídico que se
ha empleado como molde de la reacción de PCR, y que contiene la secuencia wild-type del gen.
Para ello se utilizarán unos 10-15 l de PCR, a los que se le añade directamente 1 l de Dpn I (10
U/l), e incubar durante 3-5 horas a 37ºC. Mediante este tratamiento degradaremos el ADN
molde empleado en la reacción de PCR, que por tratarse de ADN plasmídico sintetizado por E.coli,
se encuentra metilado. La enzima Dpn I es sensible a metilación, por lo que únicamente será
degradado el ADN molde.

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 Práctica 4. Producción de construcciones mutantes de cDNA mediante mutagénesis dirigida.

PRÁCTICA 4, 3ª SESIÓN (Martes 19 de diciembre):

* Transformar células E.coli competentes directamente con el producto de digestión,

mediante un protocolo de electroporación.
1. Descongelar las alícuotas de 40 µl de células electrocompetentes en hielo.
2. Añadir 2 µl del producto de la digestión, e incubar 2 minutos en hielo.
3. Seleccionar en el aparato de electroporación (Sistema de Electroporación Gene
Pulser II Bio-Rad) las siguientes condiciones:

25 µF, 2.5 KV y 200 ohms

4. Incorporar las células+ADN dentro de la cubeta de electroporación de 0,1 cm

(previamente enfriada en hielo y secar la condensación que se forma fuera de la
cubeta).
5. Aplicar un pulso con un tiempo constante de 4-5 milisegundos. El pitido indica que
el pulso se ha realizado correctamente.
6. Inmediatamente después añadir a la cubeta 1 ml de LB suplementado con glucosa
(20mM esterilizada por filtración [0,180gr en 50ml de LB]).
7. Transvasar el contenido a un eppendorf de 1,5 ml e incubar las células a 37ºC
durante una hora a 250 rpm de agitación.
8. Centrifugar 30 sec., y eliminar el sobrenadante.
9. Plaquear el paquete celular.

PRÁCTICA 4, 4ª SESIÓN (Miercoles 20 de diciembre):

Si la transformación bacteriana ha funcionado, a la mañana siguiente deberíamos tener
clones creciendo en las placas. Éstos deberían corresponder a bacterias con el plásmido
resultante de la mutagénesis, pero también podrían haber quedado restos del plásmido usado
como molde y producir clones no mutagenizados. Para identificar los clones correctamente
mutagenizados procederemos a su secuenciación. Para ello cada grupo seleccionará dos clones
de sus placas y amplificará la región del gen MYOC en la que se ha introducido la mutación. Una
opción rápida de análisis consiste en la amplificación de PCR de esta región directamente a partir
de las bacterias, sin purificación de ADN previa. A este protocolo se le llama PCR de colonias.
Se preparará un tubo de PCR con 5 l de agua, se recogerá la colonia con una punta
amarilla y se depositará en éste intentando disgregar las bacterias. Utilizando la misma punta se
hará una siembra en estría en una placa nueva intentando no rasgar el agar. De esta forma
dispondremos de colonias de los clones analizados de las que partir una vez que se confirme
cuáles de ellas han incorporado la mutación.
El proceso se esquematiza en la figura siguiente:

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 Práctica 4. Producción de construcciones mutantes de cDNA mediante mutagénesis dirigida.

Fig. 4: Esquema del procedimiento seguido en la realización de la PCR de colonias.

Se preparará una mezcla de PCR según el protocolo indicado y se introducirá en el

termociclador para producir el fragmento amplificado, utilizando una temperatura de annealing
de 50ºC.

Mezcla de reacción:
Volumen final 50 ul.
-Buffer pol: 5 µl
-dNTPs: 4 µl
-primer TIGRC2: 2,5 µl
-primer TIGRint3: 2,5 µl
-Agua mQ: 29 µl
-Taq Pol: 2 µl
-Añadir 45 µl a los 5ul de agua con la colonia suspendida.

PRÁCTICA 4, 5ª SESIÓN (Jueves 21 de diciembre):

En esta sesión analizaremos el ADN amplificado mediante las PCR de colonias. Las
muestras producidas a partir de PCR de colonias tienden a ser más sucias que las amplificadas a
partir de preparaciones de ADN plasmídico (minipreps), pero en la mayoría de los casos permiten
determinar si la mutación está o no presente y evitan el paso de crecimiento y purificación de los
ADNs. Para ello se emplearía también el kit de purificación de PCR de Millipore, que realiza la
purificación mediante filtración en membrana. El protocolo es idéntico al empleado en la práctica
2. A partir de estas PCR purificadas se realizaría la secuenciación según el mismo protocolo ya
empleado en la práctica 2. A los alumnos se les proporcionarán archivos de secuenciación para
su análisis y confirmación de la correcta introducción de las mutaciones deseadas.

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 Práctica 5. Análisis funcional de versiones mutantes de Miocilina. Relación Fenotipo-Genotipo.

PRÁCTICA 5

ANÁLISIS FUNCIONAL DE VERSIONES MUTANTES DE MIOCILINA.

RELACIÓN GENOTIPO-FENOTIPO

OBJETIVOS:
1.-Analizar el carácter patogénico de las mutaciones del gen MYOC identificadas en pacientes
mediante ensayos funcionales de las proteínas mutantes.
2.-Desarrollo de habilidades de siembra de células y manejo de cultivos celulares.
3.-Realizar la transfección de células con construcciones mutantes de miocilina.
4.-Visualizar e interpretar las señales fluorescentes obtenidas mediante la transgénesis de
construcciones quiméricas miocilina-GFP.
5.-Realizar un análisis básico de fraccionamiento subcelular mediante transferencia Western e
inmunodetección y analizar los resultados obtenidos.

INTRODUCCIÓN:

El análisis funcional de las mutaciones detectadas en cada estudio dependerá en gran

medida de la función de la proteína codificada por el gen que estemos analizando. Para proteínas
que actúen regulando el ciclo celular, como factores de transcripción, kinasas, etc, puede usarse
por ejemplo citometría de flujo. Cuando se trata de enzimas, podemos medir su actividad
mediante una reacción in vitro, en la que el producto de la reacción presente color, y medir la
velocidad de aparición del color de las forma mutantes, y compararlas con la forma nativa.

PRÁCTICA 5 1ª SESIÓN (Viernes 15 de diciembre):

En el caso concreto que vamos a ver en esta práctica, desconocemos la función biológica
de la proteína miocilina. Esta proteína está codificada por el gen MYOC, el primer gen descrito
asociado al desarrollo de glaucoma primario de ángulo abierto. Los datos bibliográficos indican
que se trata de una proteína de secreción, y que las formas mutantes tienen inhibida su
secreción, por lo que podemos utilizar este dato para analizar las diferentes formas mutantes
detectadas en nuestro estudio poblacional (P370L y D380A). Para ello utilizaremos ensayos de
transfección de la línea celular humana 293T, y mediante microscopía de fluorescencia y
Western Blot analizaremos la distribución de la proteína recombinante producida por estas
células intentando detectar diferencias de comportamiento. Como ya habréis visto en cursos
anteriores, existen diferentes soportes para cultivar las células que vamos a emplear en esta
práctica (placas Petri, placas multipocillo, frascos, etc). En función de la expresión del gen que
estemos estudiando, y de la sensibilidad de la técnica de análisis que empleemos, necesitaremos

24
 Práctica 5. Análisis funcional de versiones mutantes de Miocilina. Relación Fenotipo-Genotipo.

más o menos células para realizar el ensayo. En este caso, emplearemos placas multipocillo P6
(seis pocillos) con 1 millón de células 293T.
Las condiciones de medio de cultivo, frecuencia de pase, método de congelación y
descongelación, etc, son específicas de cada línea celular. En el caso de las líneas celulares
comerciales existen abundantes recursos en Internet para obtener esta información, como la
página web de la ATCC (Colección americana de cultivos tipo o American Type Culture Collection).
www.atcc.org/.
Mostramos un ejemplo de la información que nos ofrece sobre de la línea celular 293-T
que usaremos en prácticas, se enmarca el procedimiento de subcultivo que emplearemos para
sembrar las células en la sesión 1.

Fig. 6: Resumen de información disponible en ATCC sobre el manejo de la línea celular 293-T.

25
 Práctica 5. Análisis funcional de versiones mutantes de Miocilina. Relación Fenotipo-Genotipo.

PRÁCTICA 5, 2ª SESIÓN (Lunes 18 de diciembre):

Al día siguiente de la siembra, realizaremos la transfección con diferentes construcciones

de miocilina, tanto la forma silvestre como las formas mutantes Q368X (forma truncada), P370L
y D380A. Se prepararán mezclas de transfección para producir la expresión transitoria de estas
construcciones marcadas con el epítopo c-myc destinadas a su análisis mediante Western Blot,
así como de construcciones quiméricas unidas a la proteína verde fluorescente GFP destinadas a
la observación de las proteínas recombinantes mediante microscopía de fluorescencia para
determinar su distribución subcelular. Existen diferentes técnicas de transfección
(electroporación, microproyectiles, precipitación con fosfato cálcico, etc). En este caso
emplearemos Superfect, un reactivo comercial desarrollado específicamente para transfección,
y que permite obtener buenas eficacias de transfección.
Siguiendo el protocolo del fabricante (mostrado a la
izquierda de este texto), en el caso de una placa de 6 pocillos
utilizaremos 1 μg de ADN (el alumno recibirá una preparación
cuantificada del plásmido correspondiente a cada
construcción y tendrá que determinar la cantidad a añadir)
diluido en 100 μl de medio de cultivo DMEM sin suero y 5 μl de
Superfect. Una vez preparadas las mezclas de transfección se
añadirán a los pocillos en los que se sembraron las células 293-
T siguiendo el esquema siguiente:

Fig. 7: Esquema de utilización del kit de

transfección Superfect.
Fig. 8: Esquema de la siembra de células 293-T y construcciones transfectadas.

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 Práctica 5. Análisis funcional de versiones mutantes de Miocilina. Relación Fenotipo-Genotipo.

Una vez realizada la transfección, se incubarán las células durante toda la noche con los
complejos Superfect/ADN y se cambiará el medio de cultivo por medio fresco. Dejaremos
expresar nuestro gen durante el tiempo necesario para poder detectar la proteína sintetizada,
antes de proceder a analizar la actividad de dicha proteína. Dependiendo del tipo de ensayo que
hayamos decidido emplear, este análisis puede llevarse a cabo con las células vivas (microscopía
de fluorescencia) o con lisados celulares (Western Blot).

En nuestro caso, lo que pretendemos analizar es si la mutación identificada en nuestro

paciente afecta a la secreción y distribución subcelular de miocilina. Así, por una parte
analizaremos la presencia, cantidad y tamaño de miocilina silvestre y las formas mutantes en el
medio de cultivo y dos fracciones celulares (soluble e insoluble) mediante Western Blot, mientras
que por otra visualizaremos directamente la distribución de miocilina dentro de las células
utilizando microscopía de fluorescencia con GFP como gen “reporter”.

Para el estudio de miocilina mediante Western Blot, tras 48 horas de expresión de nuestro
gen en las células 293T, recogeremos el medio de cultivo en un tubo, lavamos las células dos
veces con PBS (solución tamponada isotónica, Phosphate Buffer Saline), eliminamos el PBS, y
congelamos las células a -80ºC (30 min.) para favorecer su lisis. Transcurrido este tiempo,
resuspendemos las células en tampón de lisis (al cual hemos incorporado diferentes inhibidores
de proteasas, con el fin de evitar al máximo la degradación de nuestra proteína), y llevaremos a
cabo la lisis celular (agitación, centrifugación, politrón, etc). Una vez lisadas las células,
analizaremos mediante western blot tanto los medios de cultivo, como los lisados celulares.
Tenéis colgado el archivo del artículo de investigación “Myocilin Mutations Causing Glaucoma
Inhibit the Intracellular Endoproteolytic Cleavage of Myocilin between Amino Acids Arg226 and
Ile227 (Aroca-Aguilar et al., 2005) como ejemplo de análisis de la relación genotipo-fenotipo en
mutaciones en el gen MYOC asociadas a glaucoma. Al final del manual de prácticas adjuntamos
un protocolo general de preparación de lisados y fraccionamiento básico de cultivos celulares
como Anexo 1.
La cuantificación de la cantidad de proteína total en los lisados celulares obtenidos es un
paso tremendamente importante cuando nuestro interés sea determinar si hay variación en la
cantidad de proteína recombinante producida por las células. Aunque no es el objetivo de esta
práctica se adjunta un protocolo de determinación de proteínas mediante el método de Bradford
por si fuera de utilidad futura a los alumnos (Ver anexo 2 del manual de prácticas).

PRÁCTICA 5, 3ª SESIÓN (Martes 19 de diciembre):

La transfección de construcciones mutantes y silvestres acopladas a proteínas
fluorescentes como GFP permite la visualización directa de la localización subcelular de las
proteínas in vivo. Para ello utilizaremos un microscopio de epifluorescencia invertido y
trataremos de detectar cambios de localización subcelular provocados por la presencia de
mutaciones.

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 Práctica 5. Análisis funcional de versiones mutantes de Miocilina. Relación Fenotipo-Genotipo.

PRÁCTICA 5, 4ª SESIÓN (Miércoles 20 de diciembre):

INMUNODETECCIÓN DE PROTEÍNAS MEDIANTE WESTERN BLOT

En las sesiones finales de esta práctica realizaremos una inmunodetección de proteínas

separadas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y transferidas a una membrana de
nitrocelulosa. En concreto detectaremos la proteína miocilina, tanto la forma silvestre como dos
formas mutantes, Q368X (mutación sin sentido) y P370L (mutación de cambio de sentido), con
el fin de analizar la naturaleza patogénica de estas mutaciones, detectadas en pacientes con
glaucoma. La detección se llevará a cabo en fracciones celulares soluble e insoluble y en medio
de cultivo.
Se pretende que el alumno desarrolle un protocolo completo de inmunodetección
conociendo los fundamentos de la técnica. En la guía aparecen señalados los puntos en los que
es posible una optimización del protocolo para adaptarlo a las características concretas de los
análisis Western blot que el alumno pueda realizar en el futuro. Por haberse estudiado la
electroforesis en otras asignaturas, nos centraremos en los apartados propios de la
inmunodetección.

Materiales:
-Tampón de transferencia 10X: Tris base 30,3 gr. + Glicina 144 gr. Llevar a 1 litro con
H20 destilada.
-Tampón de transferencia 1X: llevar 100 ml de tampón de transferencia 10X a 1 litro
con H20 destilada.
-TBS 10X: Tris base 30,3 gr. + NaCl 84,2 gr. (pH 7.5) llevar a 1 litro con H20 destilada.
-TBS-Tween 1X: llevar 100 ml de TBS 10X a 1 litro con H20 destilada y añadir 1 ml de
Tween-20.
-Blotto: TBS-Tween + Leche desnatada al 5% (5g x cada 100 ml). El resultado depende
de la marca de leche, Central Lechera Asturiana funciona bien.
-Anticuerpos:
-Anti-HA monoclonal procedente de ratón (Santa Cruz). Dilución 1:3000 en
Blotto.
-Anti-ratón monoclonal de cabra (Pierce). Dilución 1:1000 en Blotto.
-Reactivo de quimioluminiscencia ECL West Dura (Pierce).
-Marcador de proteínas Prestained Molecular Weight Marker (Fermentas).
-Aparato de transferencia semi-seca (Bio-Rad)
-Papel semi-grueso M1301/500 (Afora)
-Membrana nitrocelulosa Hybond ECL (Amersham)
-Sistema de foto-detección LAS3000 Mini (FUJIFILM)

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 Práctica 5. Análisis funcional de versiones mutantes de Miocilina. Relación Fenotipo-Genotipo.

A.- TRANSFERENCIA de las proteínas a membrana de inmunodetección:

La transferencia de las proteínas del gel, en el que se produce la migración y separación,

a una membrana es el primer paso específico de un protocolo de Western blot. Este paso es
necesario por varios motivos:
-Facilita el acceso de los anticuerpos a las proteínas.
-Inmoviliza las proteínas sobre la membrana evitando la difusión que se produciría al
realizar las incubaciones directamente sobre el gel.
-Evita la retención inespecífica de los anticuerpos en la matriz del gel que produciría un
altísimo nivel de ruido fondo en la detección.
Suelen utilizarse dos tipos de membranas para la transferencia de proteínas, la primera es
de nitrocelulosa, que posee una buena capacidad de unión de proteínas y hay variedades con
diferentes grados de porosidad según el tamaño de las proteínas a transferir. Su única desventaja
es que son frágiles, sobre todo cuando están secas. Las proteínas quedan unidas a la membrana
de forma no covalente, mediante interacciones electrostáticas e hidrofóbicas. Son las
membranas que utilizaremos en esta práctica.
Un segundo tipo son las membranas de PVDF (difluoruro de polivinilideno) que presentan
algunas ventajas frente a las de nitrocelulosa, ya que retienen mayor cantidad de proteínas, son
compatibles con la mayoría de los sistemas de detección y mecánicamente son más estables. No
obstante, su naturaleza hidrofóbica dificulta el manejo al no poder equilibrarlas (humedecer
hasta sustituir el aire que llena los poros de la membrana por el tampón a utilizar) directamente
en soluciones acuosas, siendo necesario un paso previo de equilibrado en metanol, y a la mayor
posibilidad de formarse zonas secas que interfieran con la detección por la presencia de alguna
burbuja.
La transferencia consiste en conseguir que las proteínas migren perpendicularmente al
plano del gel hacia la membrana. Esta migración puede conseguirse mediante distintos métodos,
como por capilaridad, estableciendo un flujo de tampón en la dirección de la migración deseada
por medio de papel absorbente aunque ésta es más utilizada para transferencia de ácidos
nucleicos. Para transferir proteínas suele usarse la aplicación de un campo eléctrico
perpendicular al plano del gel, las proteínas poseen carga negativa por el SDS usado en la
electroforesis, así que en presencia de un campo eléctrico migrarán hacia el polo positivo o
ánodo. Este sistema puede ser húmedo (gel y membrana están inmersos en tampón) o semi-
seco (gel y membrana colocados entre papel empapado en tampón). El segundo es más rápido y
sencillo, pero el primero puede ser más apropiado para ciertas proteínas de difícil transferencia.

Así pues, se partirá de un gel de poliacrilamida al 10% (1,5 mm de espesor) migrado a

amperaje constante (30 mA) durante 80 minutos. En el gel se han migrado fracciones celulares y
medios de cultivo correspondientes a las transfecciones de la sesión anterior de la práctica, junto
con marcadores de proteínas preteñidos (Fermentas). El protocolo que seguiremos para
transferir las proteínas del gel a una membrana de nitrocelulosa es el siguiente:

29
 Práctica 5. Análisis funcional de versiones mutantes de Miocilina. Relación Fenotipo-Genotipo.

1.- Equilibrar los geles y las membranas de nitrocelulosa en tampón de transferencia 1X

durante 10 minutos a temperatura ambiente y en agitación suave.
2.-Empapar también en tampón de transferencia 1X el papel de transferencia del tamaño
de los geles (1 papel grueso de Bio-Rad o 2 papeles semi-gruesos M1301/500 de Afora) a
cada lado de la membrana).
3.-Montar el sandwich de transferencia, según el esquema adjunto, en un aparato de
transferencia semi-seca de Bio-Rad (máximo 2-3 membranas por aparato), ir eliminando
burbujas durante el montaje (con rodillo y con abundancia de tampón). No eliminar las
posibles burbujas originaría zonas en las que no habría flujo de corriente y produciría la
transferencia defectuosa en algunas partes del gel. La placa inferior del transferidor
tendrá carga positiva, por lo que las proteínas migrarán hacia ella, por eso el gel se pone
sobre la membrana.

Fig.9.- Esquema de montaje del sandwich de transferencia.

4.- Eliminar tampón sobrante con papel y cerrar el transferidor.

5.-Transferencia 60 minutos a un voltaje constante de 15 V. Usar una fuente de

alimentación Bio-Rad Power-Pack 200 o 3000 (el amperaje comienza en valores altos y
luego desciende mucho). Es muy importante no invertir la polaridad al conectar el
transferidor a la fuente de alimentación ya que puede dañarse el aparato.

6.-Al terminar la transferencia comprobar que los marcadores preteñidos se hayan

transferido bien (en estas condiciones puede quedar en el gel algo del marcador de mayor
peso molecular). Si la proteína de interés es grande (mayor de 100 kDa) puede
aumentarse el tiempo o el voltaje pero sin superar los 20 V.

B.- INCUBACIÓN CON ANTICUERPOS:

Una vez transferidas las proteínas a la membrana, ya disponemos de un soporte sobre el que
realizar la inmunodetección de las proteínas de interés. Esta inmunodetección se basa
principalmente en la especificidad de reconocimiento e interacción entre un anticuerpo y un

30
 Práctica 5. Análisis funcional de versiones mutantes de Miocilina. Relación Fenotipo-Genotipo.

epítopo de la proteína a detectar.

Hay muchas variables que pueden afectar a este reconocimiento y a su especificidad,

como son la configuración de la proteína transferida, la naturaleza monoclonal o policlonal del
anticuerpo, la presencia de otras proteínas con epítopos similares, etc. Todas estas posibilidades
deben ser tenidas en cuenta a la hora de interpretar el resultado de una inmunodetección, pero
no son el objetivo de ésta práctica, así que nos centraremos en el caso más sencillo, proteínas
con un epítopo recombinante reconocido por un anticuerpo monoclonal bien caracterizado.

Si este anticuerpo primario es el que produce la señal a registrar, se tratará de una

detección directa, no obstante la mayoría de las veces se usa una detección indirecta en la que
además usaremos un anticuerpo secundario que tiene unida covalentemente la enzima que va a
producir la señal. Este anticuerpo secundario reconoce la parte constante (específica de cada
especie) de las cadenas pesadas de los anticuerpos primarios. Esta detección indirecta en dos
etapas tiene la ventaja de aumentar la sensibilidad y de ser económicamente ventajoso.

Fig. 10.- Diagrama en que se observan las principales moléculas implicadas en una inmunodetección
directa (A) e indirecta (B).

El protocolo de incubación con los anticuerpos comprende las siguientes etapas, en negrita
se indican las condiciones que usaremos en esta práctica:

1.- Bloqueo. Para evitar interacciones inespecíficas de anticuerpos con la membrana, se

incuba durante una hora a temperatura ambiente en agitación suave con Blotto. Esta incubación
hace que la lactoalbúmina de la leche se una a los sitios inespecíficos de unión de proteínas que
queden libres en la membrana, y los bloqueen, evitando así que los anticuerpos con los que
posteriormente incubaremos la membrana (que también son proteínas) sean retenidos
inespecíficamente y luego nos den ruido de fondo durante la detección. Dependiendo de la
proteína a detectar y los anticuerpos a utilizar, este bloqueo puede optimizarse desde 30 minutos
a varias horas (30 minutos).

2.-Incubación con anticuerpo primario. Poner las membranas en bolsitas de incubación

hechas con plástico de archivadores recortado y termo-sellado. Preparar el anticuerpo primario

31
 Práctica 5. Análisis funcional de versiones mutantes de Miocilina. Relación Fenotipo-Genotipo.

a la dilución optimizada en Blotto (2-3 ml por membrana) y añadir a la bolsita. Eliminar las
burbujas que puedan haberse formado y termo-sellar. Dejar en agitación en la noria de 2 horas
a toda la noche a 4ºC (Anti-myc 1:500 toda la noche).

3.-Lavados. Para eliminar el Ac. 1º sobrante, lavar con TBS-Tween 3 veces durante 5
minutos con agitación suave y a temperatura ambiente.

4.-Incubación con anticuerpo secundario. De igual forma que se hizo con el anticuerpo
primario, pero usando el secundario correspondiente a la especie en la que se desarrolló el
primario utilizado a la dilución indicada, e incubar en noria a temperatura ambiente el tiempo
que se haya determinado como óptimo (1-4 horas). (Ac. PIERCE Dura Anti-mouse a 1:1000
durante una hora).

Fig. 11.- Esquema que muestra sobre una membrana la secuencia de interacciones entre proteínas en el
proceso de la inmunodetección.

PRÁCTICA 5, 5ª SESIÓN (Jueves 21 de diciembre):

C.- DETECCIÓN:

Una vez finalizada la incubación con los anticuerpos, pasamos a la fase de detección, que
puede realizarse mediante varias aproximaciones, como quimioluminiscencia, formación de un
sustrato coloreado, radiactividad,… Una de las que más sensibilidad tiene (evitando la
manipulación de sustancias radiactivas) es la quimioluminiscencia, que es la que usaremos en
esta práctica.

32
 Práctica 5. Análisis funcional de versiones mutantes de Miocilina. Relación Fenotipo-Genotipo.

La quimiolumniscencia se fundamenta en el
hecho de que la enzima unida al anticuerpo
secundario es capaz de catalizar la
transformación de un sustrato en un producto
asociada con la emisión de luz.
La enzima unida al anticuerpo secundario
suele ser la peroxidasa de rábano (HRP por su
nombre en inglés HorseRadish Peroxidase) y
cataliza la oxidación del luminol en presencia de
peróxido de hidrógeno. Inmediatamente
después de la oxidación, el luminol se encuentra
en un estado excitado del que pasa a la situación
basal, reducida, más estable, emitiendo luz. La luz
emitida tiene una longitud de onda de 425 nm y
una emisión que se puede prolongar de 2 a 3
Fig. 12.- Esquema general de la inmunodetección.
horas, esta señal luminosa es apenas perceptible
a simple vista, por lo que es registrada sobre una
película fotosensible o en una cámara CCD (digital). Para lograr señales claras hay que optimizar
el tiempo de exposición para conseguir nitidez y sensibilidad.

Fig. 13.- Reacción de oxidación del luminol por la enzima HRP.

El protocolo para la fotodetección, partiendo de la membrana incubada en anticuerpo

secundario, es el siguiente:

1.-Lavados. Para eliminar el Ac. 2º sobrante, lavar con TBS-Tween 3 veces durante 3-8
minutos y con agitación lenta. De lo intenso de este lavado depende mucho la señal final que
obtengamos; si se deja mucho puede perder mucha señal mientras que si se lava poco puede dar
mucho ruido de fondo (3 lavados de 3 minutos).

2.- Tras el último lavado poner las membranas en plástico de archivador y termo-sellar
dejando un lado abierto y sin pegarse mucho a la membrana.

3.- Preparar la mezcla de reactivo de quimioluminiscencia (ECL) (1-2 ml por membrana).

(1ml ECL Pierce Dura enhancer + 1ml luminol reagent mezclados inmediatamente antes de usar).

33
 Práctica 5. Análisis funcional de versiones mutantes de Miocilina. Relación Fenotipo-Genotipo.

4.- Depositar en la bolsita, eliminando bien las burbujas y termo-sellarla.

5.- Mezclar bien el líquido de la bolsita para que se empape bien la membrana y dejar 5
minutos con el reactivo moviéndolo cada rato. Durante estos 5 minutos podemos hacer una
exposición breve (10-20 seg) para hacernos una idea de la intensidad de la señal que vamos a
obtener y planificar las exposiciones que haremos.

6.- Recortar tres de los bordes termo-sellados y eliminar el ECL pasando un papel sobre la
bolsita y desplazando el líquido sobrante hacia los extremos abiertos con cuidado para evitar que
queden burbujas.

7.- En este momento la membrana está lista, y las bandas detectadas están emitiendo luz,
el siguiente paso dependerá del sistema de fotodetección que usemos.

7.a.- Películas fotosensibles:

Sin sacarla del plástico, colocamos la membrana en el interior de un cassette de
exposición con la cara más intensa hacia arriba, la inmovilizamos y superponemos películas
vírgenes (siempre en oscuridad) durante el tiempo apropiado para obtener señales sin llegar a la
saturación. El rango dinámico de las películas es estrecho (hay pocas tonalidades de gris) por lo
que tendremos que acertar especialmente con la exposición, sobre todo si queremos obtener
cuantificaciones fiables. Una forma de optimizar esta exposición es superponer dos o tres
películas en cada exposición de forma que para cada tiempo tendremos un gradiente de señales.

7.b.- Cámara CCD:

El sistema de fotodetección que usaremos en esta práctica es el modelo LAS3000 Mini de
FUJIFILM. Sin sacar tampoco la membrana del plástico, la depositamos en la bandeja y
comprobamos que está centrada y enfocada (opción FOCUSING). Nos aseguramos de que el
diafragma está abierto y cerramos la puerta. Si la membrana queda algo ondulada podemos
ponerle encima un cristal que la mantendrá plana dejando pasar la luz.

Una vez lista la membrana, salimos de la opción FOCUSING y seleccionamos la exposición

a realizar. Una opción muy interesante es el modo INCREMENT, en el que podemos selección un
tiempo de exposición y la cámara irá haciendo exposiciones sucesivas de ese valor y sumando las
señales obtenidas, así si seleccionamos increment de 1 minuto tendremos una exposición
correspondiente a la luz emitida durante 1 minuto, otra durante 2 minutos, durante 3 minutos,
etc.
Otra opción que tenemos con la cámara CCD es seleccionar una resolución o una
sensibilidad distinta de la Standard. El único factor a tener en cuenta si deseamos hacer eso es
que son variables inversas, cuanta mayor resolución pongamos menor sensibilidad tendremos, y
si queremos aumentar mucho la sensibilidad será a costa de que las bandas sean menos

34
 Práctica 5. Análisis funcional de versiones mutantes de Miocilina. Relación Fenotipo-Genotipo.

definidas.
Una vez que tenemos la colección de imágenes, las grabamos en el disco duro, y ya
podemos llevarlas en formato digital archivos tif o img (formato propio del programa con más
información que el tif).

Bibliografía.-

Referencias principales:

-Sambroock and Russell

Molecular Cloning. A laboratory manual. 3ª Edición. Apéndices 8 y 9.
-Anexo 1 del manual de prácticas.

Otras Fuentes:

-Laemmli UK.
Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature.
1970 Aug 15;227(5259):680-5.

-Burnette WN.
"Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-
polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and
radioiodinated protein A. Anal. Biochem. 1981 Apr;112(2):195-203.

-Caroline Daus and David Burden.

Optimizing Western blots for chemiluminescent detection with cooled CCD camera imaging
system. American Biotechnology Laboratory Oct, 2000.

35
 ANEXOS

ANEXO 1:
Protocolo general de preparación de lisados celulares y fraccionamiento básico:
Células adherentes:
1.- Recoger sobrenadante de la placa y centrifugar 4 min. a 16.000 g 4ºC.
2.- Descartar sedimentos celulares.
3.- Lavar células con PBS
4.- Añadir 200 μl de tampón de lisis para placas de 6 pocillos.
5.- Despegar con rascador de células, recoger en tubo de 1,5 ml y poner en hielo.
6.- Agitar en vortex 30’’ y poner en hielo. (Repetir una vez más). Dejar en hielo 30 min.
7.- Sonicar 10’’ (Ciclo 0’5 sg) en hielo. (Repetir una vez más).
8.- Centrifugar lisado 4 min. a 16.000 g 4ºC.
9.- Recoger sobrenadante del lisado y etiquetar como fracción celular soluble.
10.- Llevar el sedimento a 200 μl con agua y tampón de carga de electroforesis.
11.- Agitar en vortex 30’’ y hervir 10 min. 100ºC para resuspender.

Células despegables o en suspensión:

1.- Resuspender células en sobrenadante y recoger a hielo.
2.- Centrifugar 4 min. a 16.000 g a 4ºC.
3.- Recoger sobrenadante y etiquetar.
4.- Añadir al paquete celular 200 μl de tampón de lisis y poner en hielo.
5.- Continuar con el Paso 6 para células adherentes.

Reactivos:

Tampón de lisis
50 mM Tris HCl pH 7.4
1% IGEPAL
150 mM NaCl
1 mM EDTA
1 mM PMSF
1 ug/ml Leupeptina
1 mM Na3VO4
1 mM NaF

Para hacer 1 ml de tampón de lisis

50 μl Tris-HCl pH 7.4 1M
10 μl IGEPAL 100%
30 μl NaCl 5 M
2 μl EDTA 0’5 M
1 μl de Leupeptina 1 mg/ml
10 μl PMSF 100 mM
1 μl de Na3VO4 1 M
1 μl de NaF 1 M
895 μl H20

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 ANEXOS

ANEXO 2:
Diagnóstico de problemas y posibles soluciones relativos a Western Blot
(Obtenido de Western Blotting Handbook and Troubleshooting Guide de PIERCE)

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ANEXOS

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ANEXOS

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ANEXOS

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