INGENIERÍA GENÉTICA

La ingeniería genética es una rama de la biotecnología que se centra en manipular los

genes de organismos vivos para lograr cambios específicos en sus características o
comportamientos. Implica la modificación de la información genética de un organismo al
introducir, eliminar o modificar genes en su ADN.

Existen varios términos que pueden ser utilizados para describir las tecnologías implicadas
en la manipulación de genes:

▪ Manipulación genética
▪ Clonación genética.
▪ Tecnología del DNA recombinante.
▪ Modificación genética.
▪ Edición genética.

Áreas en las que la manipulación genética tiene un impacto significativo:

➢ Investigación básica en estructura y funciones de genes.
➢ Producción de proteínas útiles.
➢ Generación de plantas y animales transgénicos.
➢ Diagnóstico y tratamientos médicos.
➢ Análisis forense.
➢ Antropología molecular y estudios de evolución.
➢ Análisis de genomas y edición genética.

La piedra angular de la manipulación

genética es la capacidad de aislar y
multiplicar una secuencia de DNA única
del genoma.

Al finalizar el proceso tenemos una

secuencia específica de DNA que puede
ser utilizada para una gran variedad de
propósitos.

Las técnicas empleadas para la manipulación de genes aparecieron en los años 70 sin
embargo para el desarrollo de estas técnicas fue esencial el trabajo que químicos,
bioquímicos y genetistas microbianos desarrollaron mucho antes.
 En 1865, el monje austríaco
Gregor Mendel publicó en una
desconocida revista de su país los
resultados de sus años de
investigación con el guisante
(Pisum sativum L.) con respecto a
la herencia de caracteres
dominantes y recesivos (Leyes de
Mendel) .

Entre 1840 y 1890, científicos como K. W. von Nágeli, Edouard Van Beneden y Walter
Flemming descubrieron la presencia de estructuras visibles bajo el microscopio durante la
división celular, a las que llamaron cromosomas.

Walter Sutton y Theodor Bovery postularon en 1902 la Teoría Cromosómica de la

Herencia, que amplió y complementó las Leyes de Mendel.

➢ Similitud entre la segregación de cromosomas durante la meiosis y la segregación

de alelos según las leyes de Mendel.

➢ Demostración de que los genes están ubicados en los cromosomas, y de que la

recombinación genética durante la meiosis es la responsable de la variación genética.

Friedrich Miescher, en la década de 1860, descubrió la nucleína. Él investigaba varias

cepas de neumococo (Streptococcus pneumoniae), inyectó en ratones la cepas virulentas y
no virulentas de la bacteria.

➢ Estudiando los
glóbulos blancos
descubrió que en su
núcleo había dos
sustancias:
- Proteínas.
- Algo que se comportaba
como un ácido (ácido
nucleico).

➢ Primer aislamiento de
ácidos nucleicos (la
nucleína estaba formada
por H, O, N y P).

Los ácidos nucleicos son el principio transformador.

En 1952 Hershey y Chase aportaron más pruebas al respecto.

Ese mismo año, Rosalind Franklin tomó la famosa “Foto 51” del
patrón de difracción de rayos X de la molécula de DNA.
En 1953, James Watson y Francis Crick propusieron como modelo
de la molécula de DNA una hélice doble.

Propusieron además que esta molécula funcionaba como material

heredable, y era la responsable de la síntesis de proteínas.

En los años 60, un amplio grupo de investigadores, entre

los que sobresalen Har Gobin Khorana, Marshall W.
Nirenberg y Robert W. Holley, descifran el código
genético.

En 1970, Francis Crick publica en la revista Nature el

Dogma Central de la Biología Molecular.

ADN - ARN - PROTEÍNA

A finales de los años 60 se produce un estancamiento en

los avances a causa de la falta de herramientas para
seguir trabajando.

➢ Aislamiento DNA Ligasa (1967): enzima capaz de unir covalentemente dos cadenas de
DNA.

➢ Aislamiento de la primera enzima de restricción (1970): enzima capaz de cortar el DNA

en secuencias específicas.
A principios de los 70 se crea la primera molécula de DNA recombinante.
▪ 1972 → Paul Berg
Combinación de fragmentos de ADN bacterifago lambda (virus) y el virus del mono SV40.

▪ 1973 → Stanley Cohen y Herbert Boyer

Introducción de un gen de resistencia a Kanamicina en el plásmido pSC101 (DNA
extracromosómico de Salmonella typhimurium). Estas moléculas se comportaban como
replicones (se podían replicar al introducirlas en células de E. coli).

▪ 1974 → Stanley Cohen, Annie Chang y Paul Berg

Inserción del primer gen humano (somatostatina) en un plásmido utilizando técnicas de
DNA recombinante.

Aparición de la tecnología que pasó a conocerse como clonación genética.

¿Qué es un modelo experimental?

Es una representación simplificada de un sistema más complejo o de un fenómeno natural
que se utiliza en investigación científica para estudiar, comprender o simular aspectos
específicos de ese sistema o fenómeno.

Modelos In Vitro: Utilizan sistemas aislados fuera del organismo, como cultivos celulares o
tejidos, para estudiar procesos biológicos en un entorno controlado.

Modelos Celulares y Biológicos: Utilizan células o sistemas biológicos para estudiar

procesos biológicos específicos. Los modelos celulares pueden incluir cultivos celulares,
tejidos y organismos más complejos.

Modelos Animales y Plantas: Utilizan organismos vivos, como ratones, ratas, primates o
plantas, para estudiar procesos biológicos, enfermedades o probar terapias potenciales.
Estos modelos son fundamentales en la investigación biomédica.
TEMA 2 - HERRAMIENTAS HABITUALES EN INGENIERÍA GENÉTICA

● CREACIÓN DE ADN RECOMBINANTE

¿Qué herramientas necesitamos para crear una molécula de ADN?

▪ Herramientas para cortar el ADN: enzimas de restricción

▪ Herramientas para unir fragmentos de DNA: DNA Ligasas

Enzimas:
▪ Complejos proteicos grandes y complejos.
▪ Se han aislado de diferentes organismos.
▪ Están disponibles comercialmente.

Las enzimas de restricción son proteínas capaces de cortar el DNA en sitios definidos.
Este tipo de enzimas se descubrieron en bacterias, donde forman parte de un sistema de
defensa contra virus llamado sistema de restricción-modificación.
Las enzimas de restricción cortan el DNA del virus cuando entra en las células. Cortan el
esqueleto azúcar-fosfato en 2 puntos (uno en cada hebra del DNA). Las enzimas de
reconocen secuencias específicas en el DNA y cortan cerca de estas secuencias.

La enzima de modificación del sistema de defensa (una metilasa), modifica el DNA de la

bacteria en las secuencias diana impidiendo que las enzimas de restricción corten este
DNA. En muchos casos, la metilación de una de las dos cadenas del DNA es suficiente para
impedir el corte.

En función de su mecanismo de acción y/o de la estructura del sitio de corte podemos

clasificar las enzimas de restricción en 3 tipos:
Las enzimas de restricción más utilizadas en manipulación genética son las de Tipo II P o
sencillamente Tipo II.
▪ Tienen el mecanismo de acción más simple: cortan el DNA justo en el sitio de
reconocimiento.
▪ Son nucleasas (cortan el DNA), y más concretamente endonucleasas (de
restricción del tipo II) (cortan en medio de una cadena de DNA).

Las enzimas de restricción se nombran:

➢ con tres letras tomadas del género y especie de la bacteria de la que se aislaron
originalmente.
➢ seguidas a veces por una letra más, que identifica el serotipo (variante antigénica de la
bacteria).
➢ y finalmente por un número romano que las identifica en caso de que en una misma
variante se hayan encontrado varias enzimas con distinta especificidad.

Una de las características más útiles de las enzimas de restricción es su especificidad.

▪ Cada enzima de restricción reconoce una secuencia particular de bases en el DNA
llamada secuencia de reconocimiento (o secuencia diana).
▪ Esta secuencia suele tener entre 4-6 bp de longitud.
▪ La enzima de restricción rompe los enlaces fosfodiéster que mantienen unidos los
nucleótidos en las cadenas de DNA.

➢ El DNA está formado por 4 tipos de nucleótidos (T, C, A y G).

➢ La probabilidad de encontrar cualquier secuencia es 4n (donde n es la longitud de la
secuencia a encontrar).

➢ Sitio de reconocimiento de 4 bp (ATGC) → 4 4 = 256 bp

➢ Sitio de reconocimiento de 5 bp (GCTAT) → 4 5 = 1.024 bp
➢ Sitio de reconocimiento de 6 bp (CATGTT) → 4 6 = 4.096 bp

Existe mucha variación respecto a estos valores pero el tamaño de los fragmentos
generados al digerir DNA se asemeja mucho a estos valores.

Las secuencias de reconocimiento son

generalmente palíndromas.

➢ Son secuencias que se leen exactamente igual

en un sentido y en otro.

- Una de las enzimas de restricción más

utilizadas en BamHI.

Algunas enzimas tienen las mismas dianas de reconocimiento:

➢ Sac I y Sst I son isoesquisómeros (cortan el DNA en las mismas posiciones).
➢ Sma I y Xma I son neoesquisómeros (cortan el DNA en diferentes posiciones).
USO DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

➢ Se mezcla el DNA a cortar con la cantidad apropiada de enzima de restricción en una

solución tampón.

➢ Se incuba (normalmente a 37 ˚C) durante el tiempo necesario para que la reacción tenga
lugar.

La actividad de la enzima se expresa en U; 1 U = cantidad de enzima que cortará por

completo 1 μg de DNA en 1 h a 37 ˚C.

Los tipos de fragmentos que se generan dependen de:

➢ La secuencia de reconocimiento de la enzima.
➢ La localización de los sitios de corte dentro de esta secuencia.

▪ Extremos romos.
▪ Extremos cohesivos o protuberantes.
➢ Protuberantes en sentido 3’.
➢ Protuberantes en sentido 5’.

Esto es una de las

aplicaciones de los
enzimas de restricción
más habituales en la
manipulación genética.

De esta forma, en 1982

se produjo por primera
vez la insulina humana
(llamada humulina) en
bacterias (Genetech con
Eli Lilly Co.).

Con la posición relativa de algunos sitios de restricción podemos hacer un “mapa físico” de
un fragmento de DNA esto es lo que se conoce como mapeo de restricción. Digerimos el
fragmento de DNA con varias enzimas de restricción (solos o en combinación) y analizamos
el tamaño de los fragmentos obtenidos (electroforesis de DNA).
 Cuando cortamos sólo con BamHI, se
producen 2 fragmentos de 14 kb y 1 kb.

Cuando cortamos sólo con EcoRI, se

producen 2 fragmentos de 12 kb y 3 kb
Tenemos 2 posibilidades (i y ii).

La posición correcta de los sitios

BamHI y EcoRI es la que vemos en (c).
- Están en sus respectivos lados del
ADN (5‘ - 3’).

Cuando cortamos sólo con PstI, se

producen 2 fragmentos de 8kb y 7 kb.

Con la triple digestión confirmamos el

resultado: 3 kb + 5 kb + 6 kb + 1 kb.

NUCLEASAS - Enzimas que degradan ácidos nucleicos rompiendo los enlaces fosfodiéster
que mantienen unidos los nucleótidos.
➢ Cuando desde los extremos de la molécula se llaman exonucleasas (5’ o 3’).

La nucleasa BAL31 es un complejo con una actividad rápida 3’-exonucleasa acoplada a

una actividad lenta endonucleasa.

Exo III es una 3’-exonucleasa genera moléculas de DNA con extremos protuberantes en 5’.

La Dnase I corta tanto cadenas de DNA dobles como sencillas en sitios aleatorios.

La nucleasa S1 sólo corta cadenas sencillas de DNA o RNA.

Todas estas nucleasas tienen un modo de acción bastante simple.

➢ Reconocen una secuencia específica de DNA (enzimas de restricción).
➢ Reconocen un grupo funcional como el grupo fosfato (5’-exonucleasas) o el grupo – OH
(3’-exonucleasas).

Sin embargo, existen otras nucleasas con mecanismos de corte mucho más sofisticados.

▪ Nucleasas con dedos de Zn: Combinan los dominios de dedos de Zn (unión a DNA) con la
actividad endonucleasa.

▪ TALENs (Transcription Activator-Like Effector Nuclease): El reconocimiento de las

secuencias se hace por medio de TALEs (transcription activator-like effectors).
↪ Son más fáciles de desarrollar que los dedos de Zn, por ende, se utilizan más.
▪ Sistema CRISPR-Cas9: Basado en una especie de “sistema inmunitario” que poseen las
bacterias.

POLIMERASAS - Enzimas que sintetizan copias de las moléculas de ácidos nucleicos.

Pueden ser:
➢ Dependientes de ADN: hace copias de DNA a DNA.
➢ Dependientes de RNA: hace copias de RNA a DNA.

▪ DNA polimerasa I - además de la función polimerasa tiene actividad exonucleasa 3’→5’ y

5’→3’. Esta enzima puede utilizarse para marcar moléculas de DNA que nos interese
estudiar.

▪ Fragmento Klenow - se obtiene modificando la DNA polimerasa I para quitarle la

actividad exonucleasa 5’→3’ (mantiene la actividad polimerasa y exonucleasa 3’→5’).
Se utiliza para:
▪ Síntesis de DNA de doble cadena a partir de muestras de cadena simple.
▪ Relleno de extremos 3' de fragmentos de DNA.
▪ Digerir extremos 3' protuberantes.
▪ Marcar fragmentos de DNA.

▪ Transcriptasa en reverso (RT): es una DNA polimerasa dependiente de RNA (produce

cadenas de DNA a partir de RNA).

Hay otras enzimas que actúan en los extremos de las moléculas de DNA.

▪ Fosfatasa alcalina - elimina grupos fosfato del extremo 5’ de las cadenas de DNA
dejando un grupo 5’-OH. Podemos evitar que el vector se recircularice sin coger el inserto
deseado.

▪ Quinasa polinucleótido - añade grupos fosfato del extremo 5’-OH de las cadenas de
DNA. Se puede utilizar para marcar fragmentos de DNA en los extremos.

▪ Transferasa terminal - añade muchas repeticiones de un nucleótido al extremo 3’ de una

cadena de DNA. Se puede utilizar para clonar, facilitar clonajes o para aprovechar la
ligación in vivo.

La DNA-Ligasa es una enzima muy importante en las células repara enlaces fosfodiéster
rotos que se producen de forma aleatoria o como consecuencia de la replicación o la
recombinación.
En ingeniería genética se usa principalmente para unir los huecos que quedan en los
esqueletos de las cadenas azúcar-fosfato cuando unen diferentes moléculas de DNA para
crear un rDNA.
La ligasa más usada es la T4 DNA Ligasa.
➢ Se purifica de células de E. coli infectadas con el bacteriófago T4 (es una proteína del
virus, no de la bacteria).

La T4 DNA ligasa es un mecanismo de defensa que tiene el virus para intentar evitar la
acción del sistema de restricción-modificación de la bacteria.

Aunque la T4 DNA ligasa se obtenía originalmente de E. coli, hoy en día, versiones

recombinantes y purificadas de esta enzima son producidas y comercializadas por diversas
empresas biotecnológicas para su uso en laboratorios de investigación.

➢ Estas versiones purificadas suelen ser altamente eficientes y se emplean en una

variedad de aplicaciones en biología molecular.

➢ Aunque es más eficiente sellando huecos en fragmentos que se mantienen

unidos por extremos cohesivos también puede unir fragmentos con extremos romos.

➢ Esta enzima tiene una temperatura óptima de funcionamiento de 37 ˚C, pero se

usa a temperaturas más bajas (4-15 ˚C) para evitar la desnaturalización de las
regiones apareadas que mantienen unidas las moléculas de DNA con extremos
cohesivos.

HACER ESQUEMA A MANO DE LA DIAPO 47

TEMA 3 - CÉLULAS HOSPEDADORAS Y VECTORES

La construcción de un rDNA es un proceso que se lleva a cabo in vitro para amplificar este
rDNA tenemos que empezar a usar las propiedades y características de las células vivas.

La clonación genética se consigue usando un vector para propagar la secuencia deseada

en una célula hospedadora. Elegir la combinación adecuada de vector/hospedadora es uno
de los pasos más importantes del proceso.

La elección de las células hospedadoras depende del propósito que tengamos:

- Aislamiento de un gen para realizar un estudio estructural → Sistema lo más simple

posible (fácil de usar).
- Expresar un gen en un organismo superior (p.e. una planta o un animal) → Sistema
más específico (complicado).
Normalmente:
➢ Hospedadora Primaria para aislar y multiplicar una secuencia.
➢ Introducción de esta secuencia en un sistema más complejo para su expresión.

TIPOS DE CÉLULAS HOSPEDADORAS:

Una célula hospedadora ideal debe:

▪ Ser fácil de manejar y propagar.
▪ Está disponible como una amplia variedad de cepas genéticamente definidas.
▪ Aceptar un amplio rango de vectores.

- Escherichia Coli

La bacteria E.coli cumple todos estos requisitos y se utiliza en muchos protocolos de

clonaje. Es además una de las células hospedadoras más simples que existen.

➢ Bacteria Gram-negativa.
➢ Tiene un solo cromosoma en una estructura compacta llamada nucleoide.
➢ Genoma de 4.6 Mb con unos 4.200 genes.
➢ Contiene además plásmidos de DNA (pequeños DNAs circulares).
➢ Su genoma está completamente secuenciado.
➢ Transcripción y traducción acopladas, y sin modificaciones post-transcripcionales.
➢ Tiempo de duplicación de 20 minutos.

Además de E. coli existen otras bacterias que también pueden usarse como hospedadoras
en experimentos de clonación:
➢ Bacillus.
➢ Pseudomonas.
➢ Streptomyces.

Estas bacterias suelen presentar limitaciones

normalmente se hace una clonación inicial en E.
coli para aislar y multiplicar la secuencia deseada
y luego se introduce en la célula hospedadora de
destino.
Vectores lanzadera: Funcionan tanto en la célula Hospedadora final como en E. coli.

Los organismos procariotas como E. coli no tienen núcleo u otros orgánulos que podemos
encontrar en las células eucariotas.

➢ Muchos genes eucariotas no funcionaran tan bien en bacterias como lo harían en su

propio ambiente (especialmente aquellos que requieren procesamiento del RNA).

➢ Si el objetivo del clonaje es producir una proteína eucariota debemos asegurarnos

de que una hospedadora procariota es capaz de producirla antes de usarlo.

Existe una gran variedad de células eucariotas:

▪ Microbios como levaduras o algas. Presentan muchas de las ventajas de las células
procariotas:
➢ Facilidad de crecimiento.
➢ Disponibilidad de mutantes.
➢ Facilidad de edición génica.

▪ Células de organismos superiores. Presentan problemas a la hora de la edición

genética que suelen requerir soluciones específicas.
➢ Tienen un crecimiento bastante más lento.

La levadura Saccharomyces cerevisiae es uno de los organismos eucariotas unicelulares

más usados en ingeniería genética.

Es un organismo utilizado en biotecnología desde hace siglos:

➢ Ha sido muy estudiado (se conoce perfectamente su biología y su genoma).
➢ Es relativamente fácil de editar genéticamente.
➢ Hay una amplia variedad de mutantes disponibles.

▪ Tiene las estructuras propias de las células eucariotas.

▪ Tiene un genoma de unas 12 Mb (aprox 3.5 veces el de E. coli) repartido en 16
cromosomas.
▪ No tiene apenas DNA no codificante (puede complicar mucho el trabajo con organismos
superiores).
▪ Es capaz de recombinar secuencias de DNA lineales.
▪ Duplica aproximadamente cada 90 minutos (a 30 ˚C).

Desventajas:
▪ Regiones intergénicas muy reducidas.
▪ Muy pocos intrones y muy cortos.
▪ Muy poco DNA no codificante.
Otros ejemplos de hongos que se pueden utilizar son:

▪ Aspergillus nidulans.
➢ Gran capacidad para producir enzimas industriales,
como amilasas y proteasas.
➢ Organismo modelo para estudios genéticos y
biológicos (investigación sobre el desarrollo y la
diferenciación celular en hongos).
➢ Se puede utilizar como anfitrión para la expresión de
proteínas recombinantes.

▪ Neurospora crassa.
➢ Muy utilizado en la investigación de ritmos circadianos.
➢ Utilizado en estudios de fototropía y fotomorfogénesis
(responde a la luz).
➢ Como otros hongos puede producir enzimas y
metabolitos de interés.

Las células de plantas y animales normalmente se usan en forma de cultivos celulares o

líneas celulares (mucho más fáciles de manipular que los organismos enteros).

▪ Líneas celulares de mamíferos: aislamos el tipo celular que nos interesa de un tejido y
las crecemos en condiciones controladas de cultivo.
➢ Cultivo primario (directamente del animal).
➢ Cultivo secundario (a partir de un cultivo primario).

➢ Son genéticamente muy complejas.

➢ Podemos modificar su genoma o añadirles DNA exógenos.
➢ Su tiempo de duplicación suelen ser de aprox. 24 h (depende de la línea celular).
➢ Tienen el ambiente más parecido posible a nuestras células.

LÍMITE DE HAYFLICK - Una célula en cultivo puede dividirse unas 50 veces, para
después entrar en estado de senescencia y morir.

➢ Las células de mamíferos

pueden inmortalizarse (adquirir la
capacidad de dividirse y crecer
indefinidamente).

Inmortalización de líneas celulares:

➢ Virus Oncogénicos como el
VPH.
➢ Inactivación de Genes
Supresores de Tumores.
➢ Inducción de Telomerasa.
➢ Fusión Celular (células normales + células cancerosas o células inmortales).
▪ Utilizaremos hospedadoras procariotas para:
➢ Aislar y multiplicar un gen para su análisis.
➢ Producir una gran cantidad de ciertas proteínas.

▪ Utilizaremos hospedadoras eucariotas para:

➢ Producir proteínas que requieren un ambiente eucariota.
➢ Producir un organismo superior modificado genéticamente (planta o animal transgénico).

¿Qué es un vector?
- Un vector es una molécula
de DNA (o RNA) que actúa como
vehículo para transportar y replicar
material genético insertado en él.
Se introduce en el vector con el
propósito de transferirlo a una
célula hospedadora.

- Este material genético

puede ser
➢ un gen específico.
➢ una secuencia de DNA.
➢ un genoma completo.

¿Qué características debe tener un vector?

▪ Son moléculas pequeñas para facilitar su aislamiento y manejo.

▪ Tienen que tener un origen de replicación para que puedan ser replicados y mantenidos
por las células hospedadoras.
▪ Tienen que tener marcadores de selección para poder detectar su presencia.
▪ Tienen que tener al menos un sitio de reconocimiento para una enzima de restricción que
sea único.

¿Qué son los plásmidos?

Los plásmidos son moléculas de DNA circulares relativamente pequeñas (comparadas con
el genoma de la célula hospedadora).

▪ Se mantienen generalmente en estado extracromosómico.

▪ Se encuentran en la naturaleza en bacterias y algunas levaduras.

Normalmente los plásmidos no son

esenciales (la célula puede vivir sin ellos)
pero suelen conferir algunos rasgos como
resistencia a antibióticos a los organismos
hospedadores.

Los plásmidos pueden ser:

▪ Conjugativos: pueden mediar su propia
transferencia entre bacterias mediante un
proceso llamado conjugación.
▪ No conjugativos: no pueden mediar su
propia transferencia entre bacterias.

Los plásmidos pueden ser también:

▪ Plásmidos con bajo número de copias.

Su replicación está sometida a un control estricto, con niveles muy próximos a los de la
replicación del genoma de la célula hospedadora.

▪ Plásmidos multicopia (o con alto número de copias).

Su replicación no depende de la del genoma de la célula hospedadora, y suelen

encontrarse en grandes cantidades en las células.

➢ Los conjugativos suelen ser más grandes y con pocas copias.

➢ Los no conjugativos suelen ser más pequeños y con más copias.

Los plásmidos normalmente se describen mostrando un mapa del plásmido. Que nos
muestran el contenido o las características del plásmido, y puede ser más o menos
detallado.

Requerimientos de los plásmidos:

▪ Tienen que tener marcadores de selección para poder detectar su presencia.
El proceso de transformación es muy poco eficiente de miles de millones de bacterias sólo
unas pocas cogerán los plásmidos. Ayudan a evitar que las bacterias pierdan los plásmidos.

▪ Tienen que tener al menos un sitio de reconocimiento

para una enzima de restricción que sea única.

La mayoría de los sitios de corte únicos están

concentrados en una región del plásmido llamada MCS
(multi-cloning-site) o polylinker.

▪ Deben tener un origen de replicación para que puedan ser replicados y mantenidos por
las células hospedadoras.

➢ Un origen de replicación es la secuencia de DNA dónde se inicia la replicación.

➢ Es responsable de reclutar a toda la maquinaria proteica necesaria para la
replicación.
➢ Determina el número de copias del plásmido que se hará.
➢ Son específicos para cada organismo.
➢ Son secuencias ricas en A y T.

PLÁSMIDO PBR322:

➢ pBR322: pBolivar & Rodríguez (1974).

➢ Primer plásmido usado ampliamente en la tecnología del rDNA.

▪ ori = origen de replicación.

▪ amp = resistencia a
ampicilina.
▪ tet = resistencia a
tetraciclina.
▪ En azul = dianas para
enzimas de restricción.

¿Qué te hace pensar en la posición de los sitios de restricción? - Interrumpir un

marcador de selección puede ayudarnos a seleccionar células en las que se ha insertado un
fragmento de DNA.

¿Qué te hace pensar en la posición del MCS?

Al clonar un gen en este plásmido podemos fusionarlo a GFP (fluorescente) y podemos
visualizar la proteína de fusión que se produce.
 SHUTTLE VECTORS

Los plásmidos lanzadera se pueden expresar en dos organismos diferentes. P.e.

plásmidos para usar en E.coli y levadura.

- Contienen marcadores de selección y orígenes de replicación para E. coli y

levadura (monocopias y multicopias).

- Contiene regiones de homología que permiten integrar un fragmento de DNA en el

genoma de la célula hospedadora.

En levadura utilizamos las auxotrofias como marcadores de selección. Son la

incapacidad de un organismo para sintetizar un determinado compuesto orgánico que es
esencial para su crecimiento. Los marcadores de selección más usados en levadura son:
URA3, LEU2, HIS3 o TRP1.

Vectores virales - Introducir fragmentos grandes de DNA (> 15 Kb) en un plásmido no es

muy eficiente (p.e. cuando queremos crear una biblioteca genómica). Se desarrollaron
vectores basados en virus bacteriófagos (especialmente en el fago λ y M13) Los
bacteriófagos son virus que dependen de bacterias para sobrevivir.

Ciclo de vida del bacteriófago λ

No todo el genoma del fago λ es esencial para su

función por lo que una parte del genoma puede
reemplazarse por los genes que queramos introducir
en la célula hospedadora.

Cuando el virus se empaqueta e infecta a las

células, les introduce el fragmento de DNA que le
habíamos colocado. Se pueden usar para infectar un
amplio rango de organismos o células en cultivo.
En este tipo de vectores, el tamaño del inserto depende de la cantidad de DNA que puede
incorporarse a la cápsida durante el ensamblamiento de las partículas virales (unas 52 Kb).
Se modifica el genoma del virus y puede llegar a albergar fragmentos de hasta 23 Kb.

Existen otros virus que pueden ser usados como vectores:

▪ Retrovirus - vectores basados en lentivirus o el MLV (virus leucemia murina).

➢ Son virus de RNA.

➢ Se integran aleatoriamente en el genoma (expresión a largo plazo).
➢ Necesitan una RT para hacer una copia de su genoma a DNA.
➢ Tienen una capacidad de unas 8 Kb.
➢ Generalmente se integran en células en división (los lentivirus pueden integrarse en
células no proliferativas).

Los humanos estamos muy en contacto con adenovirus tenemos anticuerpos que pueden
neutralizarlos. Usamos adenovirus de otras especies, por ejemplo el adenovirus de
chimpancé se usó como vector para transportar la proteína SARS-CoV-2 spike en la vacuna
de AstraZeneca.

▪ Virus adenoasociados (AAV)

➢ Son pequeños virus de ssDNA pequeños que infectan a humanos y otros primates.
➢ No suelen ser patogénicos y generan poca respuesta inmune.
➢ Se incorporan al genoma del hospedador como episomas (se replican, pero no se
integran) lo que permite una expresión duradera y estable.
➢ Son muy útiles para terapia génica.

Algunas características de los vectores virales:

▪ Seguros: se eliminan los genes de patogenicidad para mejorar su seguridad.

▪ Estables: genéticamente estables y predecibles.
▪ Selectivos en cuanto al tipo celular: las células que puedan infectar están determinadas
por su proteína de cubierta.

▪ Cósmidos

Los cósmidos son un híbrido entre plásmidos y virus bacteriófagos.

➢ Son pequeños (4-6 Kb) y pueden acomodar fragmentos de hasta 47 Kb.

➢ Como no tienen los genes del fago, se comportan como plásmidos cuando se introducen
en E. coli.
➢ Aprovechan el mecanismo de empaquetamiento e infección de los vectores virales.

▪ Cromosomas artificiales de levadura (YACs)

Los genomas de organismos sencillos como Saccharomyces cerevisiae se secuenciaron
utilizando cósmidos pero para genomas más grandes como en el Proyecto Genoma
Humano insertos de 40- 50 Kb siguen siendo demasiado pequeños.
➢ Los cromosomas artificiales permiten clonar fragmentos en el rango de Mb (son los de
mayor capacidad hasta el momento).

➢ Contienen regiones centroméricas y teloméricas, por lo que el rDNA se mantiene de la

misma forma que un cromosoma natural de levadura.

Actualmente se están desarrollando HACs (cromosomas artificiales humanos).

Una vez creado el rDNA en el tubo de ensayo debe ser transportado a la célula
hospedadora para su propagación. La eficiencia de este paso es crucial para determinar el
éxito de un proceso de clonación molecular.

Métodos para transportar el DNA dentro de las células

Utilizamos técnicas como:

▪ Transformación - cuando trabajamos con E. coli, transformación hace referencia a la
toma de un DNA plasmídico. La transformación bacteriana se demostró en 1928 con los
experimentos de Griffith. Es una respuesta a condiciones ambientales extremas y
fenómenos como la recombinación requieren de varias copias del material genético. En
1970 se demostró la transformación en E. coli.

Transformación química de E. Coli - El proceso consiste básicamente en mezclar las

células con el rDNA y desestabilizar la membrana con un choque térmico. Para hacer las
células competentes se incuban con CaCl2

▪ Transfección - en general hace referencia a la toma de un DNA procedente de un vector

viral.

En el contexto de células animales se denomina transformación al proceso por el que una

célula pasa a ser cancerosa por ello se usa el término transfección para cualquier toma de
DNA exógeno. Utilizamos las propiedades de los virus (vectores virales) para insertar el
DNA en las células hospedadoras. Los mecanismos de infección pueden variar en función
del tipo de vector viral utilizado.

Ambos procesos son muy poco eficientes de millones y millones de células, sólo unas
pocas cogen el plásmido (correcto).
Posibles problemas:
➢ Células no transformadas.
➢ Células transformadas con el plásmido vacío.

Utilizamos las propiedades de los virus (vectores virales) para insertar el DNA en las células
hospedadoras. Los mecanismos de infección pueden variar en función del tipo de vector
viral utilizado.

Transfección por lipofección

El DNA se introduce en las células provocando la formación de liposomas mediante agentes
de transfección.
Los agentes de transfección pueden ser:
➢ Lípidos catiónicos.
➢ Fosfato de calcio.
➢ Polímeros catiónicos.
➢ Nanopartículas.

Un liposoma es una vesícula esférica con una membrana compuesta de una doble capa de
fosfolípidos. Puede entrar en las células por procesos de endocitosis.

▪ Microinyección

Métodos para transportar el DNA dentro de las células El DNA exógeno es físicamente
inyectado en las células (se ha usado con éxito en células animales y vegetales).

➢ La célula se fija con una leve succión.

➢ Se usa una micro aguja para atravesar la membrana.
➢ Requiere un micromanipulador, un microscopio y muchísima práctica.
➢ Es una técnica muy lenta y con un bajo rendimiento.

Se utiliza muy frecuentemente en tratamientos de fecundación in vitro

▪ Biolística

Consiste en literalmente disparar el DNA exógeno dentro de las células.

➢ Se impregnan micropartículas de oro o tungsteno con el DNA exógeno

(microproyectiles). ➢ Estas partículas se aceleran utilizando gas comprimido y un
macroproyectil.
➢ Al final una pequeña abertura deja pasar los microproyectiles y detiene el macroproyectil.

Los microproyectiles llevan el DNA exógeno a las células hospedadoras.