VALIDACIÓN DE

METODOS
ANALITICOS

YESID JAVIER GARCIA SANTAMARIA

PROFESIONAL ESPECIALIZADO
LABORATORIO FISICOQUIMICO DE ALIMENTOS Y
BEBIDAS - INVIMA
 BIBLIOGRAFIA

• The United States Pharmacopeia USP.

• DECISIÓN DE LA COMISIÓN EUROPEA 2002/657/CE.

• International Conference on Harmonisation of technical requeriments for

registration of pharmaceutical for human use. ICH Harmonised tripartite
guideline.

• VIM: Vocabulario Internacional de metrología, 2012

• The Fitness for Purpose of Analytical Methods – Guia Eurachem 1998

 DEFINICION

Es la confirmación mediante el suministro de evidencia

objetiva de que se han cumplido los requisitos para
una utilización o aplicación específica prevista..
[ISO 9000:2005]
SISTEMAS DE GESTIÓN DE LA CALIDAD - FUNDAMENTOS Y VOCABULARIO

El proceso para establecer las características de

rendimiento y limitaciones de un método y la
identificación de las influencias que pueden cambiar
estas características y en qué medida.
GUIA EURACHEM.
 DEFINICION

La Validación de un método de ensayo es

la demostración de que un método de
ensayo es apto para un uso previsto.
Protocolo FAPAS
 ALCANCE
El alcance de la validación debe definir:

 Características de las muestras (matriz). En el ejemplo de la

matriz agua, deberá especificarse por ejemplo: potable, uso
industrial, efluentes de desecho, etc.

 Tipo de información: cuantitativa y/o cualitativa.

 Requerimientos del cliente sobre la calidad de los resultados

(Normativa local o internacional).

 Condiciones del laboratorio.

 Los parámetros a evaluar, estadísticos de prueba y sus valores

críticos de acuerdo a los requerimientos establecidos.
 OBJETIVOS
Método de Ensayo Objetivos

Caso 1: método Comprobación de que el laboratorio domina el

normalizado ensayo y lo utiliza correctamente

Caso 2: modificación de Comprobación de que la repetibilidad, la

un método normalizado reproducibilidad, la precisión intermedia y la
exactitud del método original no dependen de la
modificación introducida y que el laboratorio
domina el ensayo y lo utiliza correctamente.
Caso 3: método Comprobación de que el método tiene la
Interno repetibilidad, la reproducibilidad, la precisión
intermedia y la exactitud
Suficientes para el objetivo de aplicación y que el
laboratorio domina el ensayo y lo realiza
correctamente.
 PARAMETROS
Caso 1 – Método Normalizado

1. Comprobación del cumplimiento de los parámetros

estadísticos, p. ej. incertidumbre de los resultados,
repetibilidad, exactitud, límite de detección (siempre
y cuando se indiquen en la norma).

2. Participación en ensayos interlaboratorios.

 PARAMETROS
Caso 2 – Modificación Método
Normalizado
1. Comprobación del cumplimiento de los parámetros estadísticos,
p. ej. incertidumbre de los resultados, repetibilidad, exactitud, límite
de detección (siempre y cuando se indiquen en la norma), además:
Intervalo de trabajo / linealidad
Recuperación
Robustez
Especificidad
Reproducibilidad

2. Participación en ensayos interlaboratorios.

 PARAMETROS
Caso 3 – Método Interno
1. Los parámetros son.
Intervalo de trabajo / linealidad
Recuperación
Robustez
Especificidad
Estabilidad
Reproducibilidad
Selectividad
Repetibilidad,
Precisión intermedia
Límite de detección
Límite de cuantificación
Sensibilidad cruzada frente a las interferencias provenientes de la matriz de la
muestra o del objeto de ensayo.
2. Participación en ensayos interlaboratorios.
 PARÁMETROS
Requerimientos analiticos Elementos relacionados
Que tipo de respuesta se
requiere? Cuantitativa -
Cualitativa
Esta el analito presente en
mas de una forma?
En que niveles esta
presente o se necesita
cuantificar?
Identidad – Selectividad
/Especificidad
Limite de detección
Limite de cuantificación
Identidad
Recuperación
Limite de detección
Limite de cuantificación
 SELECTIVIDAD - ESPECIFICIDAD
DEFINICIONES
•La selectividad da una indicación de cuan fuertemente un
resultado es afectado por otros componentes de la muestra.

•EURACHEM: La capacidad de un método para determinar

con precisión y específicamente el analito de interés en la
presencia de otros componentes en una matriz de la muestra

•VIM: Propiedad de un sistema, empleando un

procedimiento especificado, por la que el sistema
proporciona valores medidos para uno o varios
mensurandos, que son independientes de otros
mensurandos o de otras magnitudes existentes en el
fenómeno, cuerpo o sustancia en estudio
 SELECTIVIDAD - ESPECIFICIDAD
PARÁMETRO DESCRIPCIÓN CRITERIOS DE
ACEPTACION
1. Interferencias Verificar con matriz blanco, adicionada La cuantificación no se
conocidas con sustancias de naturaleza similar al debe ver afectada por la
similares al analito estudiado que puedan presencia de
analito. encontrarse en la matriz. interferentes.
Realizar el análisis mínimo por triplicado
comparando matriz blanco, matriz
fortificada con analito y matriz fortificada
con analito adicionada con interferentes
 SELECTIVIDAD - ESPECIFICIDAD
PARÁMETRO DESCRIPCIÓN CRITERIOS DE ACEPTACION
2. Componentes que Verificar con matriz blanco La cuantificación no se debe ver
interfieren en el adicionada con componentes afectada por la presencia de
análisis. que puedan estar presentes componentes que puedan estar
en el análisis, aunque su presentes en el análisis.
naturaleza no sea similar a la
del analito.
Realizar el análisis mínimo
por triplicado comparando
matriz blanco, matriz
fortificada con analito y
matriz fortificada con analito
adicionada con interferentes
 SELECTIVIDAD - ESPECIFICIDAD
PARÁMETRO DESCRIPCIÓN CRITERIOS DE ACEPTACION
3. Productos de Si no se cuenta en el Verificar en que condiciones no
degradación. laboratorio con sustancias se afecta la cuantificación, las
para evaluar los casos 1 y condiciones que afecten serán
2, es recomendable críticas y se documentaran en la
verificar como se afecta la validación.
cuantificación con
productos de degradación
teniendo en cuenta los
siguientes ensayos:
1. Termólisis.
2. Hidrólisis
3. Hidrólisis alcalina
4. Hidrólisis ácida
5. Fotólisis
6. Oxidación
7. Condiciones normales.
 EXACTITUD
DEFINICIONES

• EURACHEM: El grado de concordancia entre el resultado y

el valor de referencia aceptado.

• VIM: Proximidad entre un valor medido y un valor

verdadero de un mensurando
 EXACTITUD
PARAMETRO No DE MUESTRAS ESTADISTICOS CRITERIOS DE
ACEPTACION
EXACTITUD 10 mediciones de un blanco y Valor obtenido Sujeto al material
(EURACHEM) un material de referencia comparado con el usado.
certificado real.

EXACTITUD 6 Lotes conformados por: 1 Decisión 657 UE

(INVIMA) Blanco, 3 matriz blanco, 3
matriz blanco más adicionado. % de Recuperación.
(tres niveles).
Realizar las determinaciones
por triplicado
 PRECISIÓN
DEFINICION - EURACHEM

'El grado de concordancia entre los resultados de pruebas independientes

obtenidos en condiciones especificas. '

Nota: La precisión depende sólo de la distribución de los errores aleatorios y

no se relaciona con la verdadero valor o el valor especificado…. "Pruebas
Independientes“ significa que el resultado obtenido no esta influenciado de
ninguna manera por el resultado anterior de la misma prueba. Las medidas
cuantitativas de precisión dependen de forma crítica de las condiciones
estipuladas. La repetibilidad y reproducibilidad constituyen conjuntos
particulares de condiciones extremas.
 PRECISIÓN
DEFINICION - VIM

Proximidad entre las indicaciones o los valores medidos obtenidos en

mediciones repetidas de un mismo objeto, o de objetos similares, bajo
condiciones especificadas

NOTA 1 Es habitual que la precisión de una medida se exprese

numéricamente mediante medidas de dispersión tales como la desviación
típica, la varianza o el coeficiente de variación bajo las condiciones
especificadas.

NOTA 2 Las “condiciones especificadas” pueden ser condiciones de

repetibilidad, condiciones de precisión intermedia, o condiciones de
reproducibilidad.
 REPETIBILIDAD
DEFINICIONES

• EURACHEM: Capacidad de un instrumento de medición para

proporcionar indicaciones muy similares para aplicaciones repetidas
del mismo mesurando en las mismas condiciones de medición.

VIM: Precisión de medida bajo un conjunto de condiciones de

repetibilidad (condición de medición, dentro de un conjunto de
condiciones que incluye el mismo procedimiento de medida, los
mismos operadores, el mismo sistema de medida, las mismas
condiciones de operación y el mismo lugar, así como mediciones
repetidas del mismo objeto o de un objeto similar en un periodo corto
de tiempo).
 REPETIBILIDAD
PARAMETRO No DE MUESTRAS ESTADISTICOS CRITERIOS DE
ACEPTACION
REPETIBILIDAD 10 mediciones de una matriz Desviación estándar. Desviación estándar
(EURACHEM) fortificada o un material de de la repetibilidad.
referencia certificado en varias
concentraciones del rango de
trabajo
REPETIBILIDAD 6-10 Determinaciones de la CV de Horwitz.
(INVIMA) matriz fortificada en los tres CV
niveles de interes.
 P. INTERMEDIA
DEFINICIONES

• EURACHEM: La precisión intermedia expresa la precisión con

variaciones internas de los laboratorios: diferentes días, diferentes
analistas, diferentes equipos, etc.

VIM: Precisión de medida bajo un conjunto de condiciones de

precisión intermedia (condición de medición, dentro de un
conjunto de condiciones que incluye el mismo procedimiento de
medición, el mismo lugar y mediciones repetidas del mismo objeto u
objetos similares durante un periodo amplio de tiempo, pero que
puede incluir otras condiciones que involucren variaciones).
 P. INTERMEDIA
PARAMETRO No DE MUESTRAS ESTADISTICOS CRITERIOS DE
ACEPTACION
P INTERMEDIA 10 mediciones de una matriz Desviación estándar. Desviación estándar
(EURACHEM) fortificada o un material de de la reproducibilidad
referencia certificado en varias intralaboratorio.
concentraciones del rango de
trabajo, variando los analistas,
equipos en un rango de
tiempo amplio
P INTERMEDIA 6 Lotes conformados por: 1
(INVIMA) Blanco, 3 matriz blanco, 3 ANOVA TEST DE FISHER
matriz blanco más adicionado.
(tres niveles).
Realizar las determinaciones
por triplicado
 REPRODUCIBILIDAD
DEFINICIONES

• EURACHEM: "Precisión en condiciones de reproducibilidad, es

decir, condiciones en las que se obtienen resultados de ensayos con
el mismo método a elementos de ensayo idénticos, en laboratorios
distintos, con distintos operadores utilizando diferentes
equipos.

VIM: Precisión de medida bajo un conjunto de condiciones de

reproducibilidad (condición de medición, dentro de un conjunto de
condiciones que incluye diferentes lugares, operadores, sistemas de
medida y mediciones repetidas de los mismos objetos u objetos
similares).
 LINEALIDAD - RANGO LINEAL
DEFINICIONES

• EURACHEM: Define la capacidad del método para obtener resultados de

la prueba proporcionales a la concentración de analito.
•Nota: El rango lineal es, por deducción, el rango de concentraciones de
analito en la que el método proporciona resultados de la prueba proporcional
a la concentración del analito.

• VIM: Intervalo de medida:

Conjunto de los valores de magnitudes de una misma naturaleza que un
instrumento o sistema de medida dado puede medir con una
incertidumbre instrumental especificada, en unas condiciones
determinadas
NOTA 1 En ciertas magnitudes, se utilizan los términos “rango de medida” o
“campo de medida”.
NOTA 2 No debe confundirse el límite inferior de un intervalo de medida con
el límite de detección.
 LINEALIDAD
PARAMETRO No DE MUESTRAS ESTADISTICOS CRITERIOS DE
ACEPTACION

LINEALIDAD Blanco y muestras Graficar la Una distribución

(EURACHEM) fortificadas a diferentes respuesta del aleatoria de los
concentraciones (mínimo equipo en función residuales confirma
6) de la la linealidad;
concentración; tendencias
calcular y graficar sistemáticas
los residuales, indican carencia de
linealidad,
LINEALIDAD 4 a 7 concentraciones Coeficiente de r 0.98
(INVIMA) correlación ( r )
Replicados:3 a 6
Test de Hipótesis: Test de Fisher
-pendiente
-intercepto

ANOVA
 LIMITE DE DETECCIÓN
DEFINICIONES
•ISO “mínima concentración neta detectable”
•IUPAC “mínimo valor verdadero detectable”
•PROCEDIMIENTO “la menor concentración de analito
que puede detectarse, pero no necesariamente
cuantificarse en una muestra, en las condiciones
establecidas y se expresa en unidades de concentración.
• ICH: “indicación del nivel a partir del cual la detección
se vuelve problemática.
 LIMITE DE DETECCIÓN

PARAMETRO No DE ESTADISTICOS CRITERIOS DE

MUESTRAS ACEPTACION
LIMITE DE 4 a 7 LD SISTEMA<LD METODO
DETECCION concentraciones,
en el rango inferior
de la curva de
calibración
Replicados:3

• Se calcula graficando la ecuación de la recta de bajas concentraciones y

extrapolando cuando la concentración es igual a cero (X=0), obteniendo el valor
de la respuesta: Ybl
•Se calcula graficando la ecuación de la recta correspondiente a concentración vs
desviación estándar (s) y se extrapola la desviación estándar a concentración
cero, obteniéndose el estimado Sb, correspondiente a la desviación estándar del
blanco
 LIMITE DE DETECCIÓN
ALDRIN Desviación
Ybl
Área 1400,00
(ug/ml) est. 1200,00 y = 466,22x + 0,1776
0,5 292,38 1000,00 R20,9792 =
0,5 294,10 800,00

0,5 288,24 600,00

31,11523
400,00
0,5 244,93
200,00
0,5 225,06
0,00
0,5 238,27 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3
1,0 457,02

1,0 449,03
Sbl
1,0 465,99 17,3372761 80
1,0 425,82 70
y = 11,047x + 24,876
1,0 453,96 60 R20,1926 =
50
1,0 477,13
40
1,5 575,89
30
1,5 591,39
20
1,5 624,22 67,8951209 10

1,5 687,26 0
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3
1,5 720,35

1,5 735,55

2,5 1128,97

2,5 1166,15

2,5 1186,08 43,9165091

2,5 1192,13

2,5 1209,10

2,5 1260,47
 LIMITE DE DETECCIÓN
Pendiente Linealidad 728,72 (mV*ml/ug)
Ybl  3Sbl 1
Ybl 0,1776 mV

Sbl
n
24,876 mV
24
b n
raíz n 4,90

0.1776mV  3  24.876mV 1
 
728.72 mV  ml 24
ug

= 0.021ug/ml
 LIMITES (RELACION SEÑAL - RUIDO)
“La determinación de la relación señal ruido es realizada
comparando mediciones de estándar a bajas concentraciones del
analito y blancos. Una relación 3:1 es considerada aceptable para
estimar el limite de detección”

“para calcularlo se toman no menos de 10 réplicas del blanco y se

evalúa la desviación estándar del blanco expresándose el LD como
el valor de la señal del blanco + 3,3 Sb”.

LD= B + 3,3 Sb
 LIMITE DE DETECCIÓN

Resultado de blancos expresado en mg/mL

1 2 3 4 5 6
0,79 0,80 0,79 0,80 0,78 0,79
0,77 0,81 0,80 0,81 0,79 0,76

B= 0.79 mg/ml
Sb=0.015 mg/ml
LD= B + 3,3 Sb = 0.84 mg/ml
 LIMITES (linealidad)
PARAMETRO No DE ESTADISTIC CRITERIOS
MUESTRAS OS DE
ACEPTACION

LIMITE DE 4 a 7 LD SISTEMA<LD
METODO
DETECCION DEL concentracion
SISTEMA es, en el
rango lineal.
LIMITE DE Replicados:4- LC SISTEMA<LC

CUANTIFICACION 6 METODO

DEL SISTEMA
 LIMITE DE DETECCIÓN
CONCENTRACIÓN
Área lote 1 Área lote 2 Área lote 3 Área lote 4
(ug/ml)
10,0 5476,78 3700,65 5846,78 5601,44
15,0 7036,94 9225,15 9072,56 9350,38
25,0 16350,65 17410,21 15780,88 15070,98
50,0 36605,68 37206,07 34703,64 34439,21
75,0 54619,74 57682,65 55461,87 55380,50
100,0 74641,91 78587,48 75997,11 71499,13
150,0 111961,27 113516,38 111581,06 110957,60
200,0 146061,41 149333,24 144674,52 144270,73
250,0 178549,48 179502,38 176567,57 175453,72
 LIMITE DE DETECCIÓN
LINEALIDAD ALDRIN

200000

180000 y = 728,72x - 592,97

160000 R2 = 0,9979
140000

120000
AREA (mV)

100000

80000

60000

40000

20000

0
0 50 100 150 200 250 300
CONCENTRACIÓN (ug/m l)
 LIMITE DE DETECCIÓN
LINEALIDAD SISTEMA - TETRADIFON

8000
7500
7000
AREA

6500
6000
5500
5000
22 23 24 25 26 27 28
CONCENTRACIÓN (ug/ml)
 LIMITE DE DETECCIÓN

Observación Pronóstico para Y Residuos

S
LD  3 
1 6694,24 -1217,46
2 10337,85 -3300,91
3
4
17625,06
35843,10
-1274,42
762,59
b
5 54061,13 558,61
6 72279,16 2362,74
7 108715,23 3246,04
153.03
8
9
145151,30
181587,37
910,11
-3037,88 LD  3   0.63 ug ml
10 6694,24 -2993,59 728.72
11 10337,85 -1112,70
12 17625,06 -214,85
13 35843,10 1362,97
***
Desv. Est. 153.03
 ROBUSTEZ
DEFINICION

• EURACHEM: La robustez de un procedimiento analítico es una medida de

su capacidad para permanecer inalterado por variaciones pequeñas pero
deliberadas en parámetros del método y brinda una indicación de su
confiabilidad durante el uso normal.
 ROBUSTEZ
CALCULO

• EURACHEM
Muestras Cantidad Estadistico

Identificar las variables Analizar en cada condición un set Determinar el efecto de

que podrían tener un de muestras cada cambio en la media.
efecto significativo en el Clasifique las variables en
rendimiento del método. orden de mayor a menor
planear experimentos con: según el efecto sobre
materiales de referencia, funcionamiento del
muestras de composición método
conocida o materiales de
referencia certificados, y
verificar su efecto en la
precisión, cambiar
sistemáticamente las
variables
 ROBUSTEZ
CALCULO

• M INTERNO – Youden Steiner

Factor Ensayos
1 2 3 4 5 6 7 8
A/a A A A A a a a a
B/b B B b b B B b b
C/c C c C c C c C c
D/d D D d d d d D D
E/e E e E e e E e E
F/f F f f F F f f F
G/g G g g G g G G g
Resulta s t u v w x y z
 ROBUSTEZ
La comparación de las medias de los resultados revela el efecto de cambiar
el valor “normal” por el alternativo. A continuación se presenta el modelo
para el cálculo de la diferencia de la respuesta para cada parámetro.
Parámetros Diferencia
A-a VA = ( s+t+u+v)/4- (w+x+y+z)/4
B-b VB = (s+t+w+x)/4 - (u+v+y+z)/4
C-c VC = (s+u+w+y)/4- (t+v+x+z)/4
D-d VD = (s+t+y+z)/4 – (u+v+w+x)/4
E-e VE = (s+u+x+z)/4 – (t+v+w+y)/4
F-f VF = (s+v+w+z)/4 – (t+u+x+y)/4
G-g VG = (s+v+x+y)/4 – (t+u+x+z)/4

Para decidir si un parámetro tiene influencia significativa sobre el resultado, se

compara la diferencia obtenida para el cambio efectuado sobre este parámetro y el
productos de s (desviación estándar del estudio de precisión) y raíz de 2 por
ejemplo,
Si | VB| > s √ 2 entonces la diferencia es significativa,es un factor critico.