Enzimas Presentación II

5) Cinética enzimática

6) Factores que alteran la actividad enzimática

7) Mecanismos de inhibición de la actividad enzimática

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5) Cinética enzimática

2
5) Cinética enzimática

Velocidad de reacción ( ) Velocidad inicial de reacción (V0) ( ----- )

V = [P] / tiempo * Técnica disponible

para la medida
V = - [S] / tiempo

[S] Vel inicial (pendiente)

S1 Vo 1
S2 V0 2
S3 V0 3 3
5) Cinética enzimática – Modelo de Michaelis Menten
[S] Vel inicial (pendiente)
S1 Vo 1
S2 V0 2
Km = (k2 + k-1)/k1 (constante) // Unidades
S3 V0 3

Saturación: característica distintiva de la Vmáx = k2 [E]total (no es constante) // Unidades

catálisis enzimática.
5) Cinética enzimática – representación de Lineweaver-Burk (doble recíproca)

Transformación algebraica de la ecuación de MM en una forma que nos permite calcular

los valores de Vmáx y Km.por extrapolación de una recta.

5
 Gráfico para determinar la Vo
¿ Cómo hacer un experimento para determinar Km y Vmáx ?
Tubo 3
Buffer (pHóptimo)

Tubo 2
E

S1 S2 S3 Tubo 1

Gráfico para calcular Km y Vmáx

[S] Vel inicial (pendiente)

m S1 Vo 1
S2 V0 2
S3 V0 3
m

Gráfico para determinar si la E es michaeliana

Usar Regresión No lineal
para calcular Km y Vmax
1 / [S] 1 / Vel inicial (pendiente)
O realizar la transformación de
la doble recíproca para calcular
1 / S1 1 / Vo 1 gráficamente a Km y Vmax
1 / S2 1 / V0 2
1 / S3 1 / V0 3
6
5) Cinética enzimática – Unidades

Unidad de actividad enzimática (AEnz): cantidad de P formado o de S consumido por unidad de tiempo
Por ejemplo, 1 UAE puede definirse como:
✓ la cantidad de enzima que transforma un µmol de sustrato por minuto (µmol / min)
✓ la cantidad de enzima que sintetiza 1 mol de P por segundo
* Se determinan en condiciones óptimas (pH, T y [S])

Unidad Internacional (UI): cantidad de enzima que cataliza la transformación de 1 umol de producto por
minuto en condiciones óptimas (pH, T, [S])

Actividad específica (AEsp): número de unidades de enzima por miligramo de proteína (µmol/ min x mg
proteína o AEnz/ mg proteína)

Número de recambio o Kcat: número de moléculas de S convertidas en P por unidad de tiempo y por
molécula de enzima en condiciones de saturación

Kcat= Vmáx/ [E] total

 Velocidad de formación de productos
Velocidad de formación de productos

[S] mM

[cofactores] mM
Velocidad de formación de productos
0

Velocidad de formación de productos

0
10

3
30

5
pH
50

7
Temperatura
70

9
6) Factores que alteran la actividad enzimática

8
7) Mecanismos de inhibición de la actividad enzimática

Inhibidor

Reversible Irreversible

- Competitivo
- Acompetitivo Distintos mecanismos:
- Mixto - Inhibidores suicidas
- No competitivo
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 A) Inhibidores reversibles

Inhibidores competitivos:

✓ Se unen al sitio activo del E, compitiendo

por el mismo con el sustrato.
✓ No modifican la Vmáx.
✓ Disminuyen la afinidad aparente de la
enzima por el sustrato (KmI > Km)

Inhibidores acompetitivos, mixtos y no competitivos:

✓ Se unen a un lugar distinto del sitio activo, pero cambian

la conformación de E y del sitio activo interfiriendo con
la reacción.
✓ Todos disminuyen la Vmáx y se diferencian entre si por su
efecto sobre la afinidad aparente (KmI).
✓ Si KmI > Km es un inhibidor acompetitivo
✓ Si KmI < Km es un inhibidor mixto
✓ Si KmI = Km es un inhibidor no competitivo

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Inhibición reversible competitiva

Inhibidor (I) se une a la enzima libre (E), pero no al

complejo ES

Los I competitivos producen una disminución en la KmI > Km KmI = Km (1+ [I]/KI)
afinidad aparente por el S (aumento en Km) sin
modificar Vm VmI = Vm
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 Inhibición reversible acompetitiva

Inhibidor (I) se une al complejo ES pero no

a enzima libre (E)

Km  KmI < Km
Vm  VmI < Vm
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Inhibición reversible mixta

KI ≠ KI´

Inhibidor (I) se une a la enzima libre (E) y al Km  KmI > Km

complejo ES con diferente afinidad
Vm  VmI < Vm

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Inhibición reversible no competitiva

KI = KI´

Inhibidor (I) se une a la

enzima libre (E) y al complejo
Km = KmI = Km
ES con igual afinidad
Vm  VmI < Vm

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Resolver para el TP:

Nombre Mecanismo Parámetros cinéticos Gráfico doble recíproca

Competitivo
Km 
Vm =

Acompetitivo

Km 
Vm 

Mixto

Km 
Vm 
KI ≠ KI´
No
Competitivo
Km =
Vm 
KI =
KI´
B) Inhibidores Irreversibles - Inhibidores suicidas (sustratos suicidas)
Inhibidores de B-lactamasas

O CH2OH O
O
b-Lactamasa
C C CH2OH
N H C
O- HN H
O
-
COO
COO-
Ác.clavulánico
O
C
O CH2OH El ácido clavulánico
CH CH2 O
C reacciona con una
HN
Ser
H serina del sitio activo
COO- de la b-lactamasa,
produciendo su
inactivación.

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