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Artículo

Co-Fermentación de Mezclas de Glucosa-Xilosa a partir de Residuos

Agroindustriales por EtanologénicoEscherichia coli: Un estudio sobre
la falta de represión de catabolitos de carbono en la cepa MS04

Estefania Sierra-Ibarra1, Alejandra Vargas Tah1, Cessna L. Moss-Acosta1, Berenice Trujillo-Martinez1, Eliseo R.
Molina-Vazquez1, Alberto Rosas-Aburto2,Aangeles valdivia-lopez2, Martain G. Hernandez-Luna2, Eduardo
Vivaldo-Lima2 y Alfredo Martíinez1,*

1 Departamento de IngenieríaiCelular y Biocatalisis, Instituto de Biotecnologíaia, Universidad Nacional Aut.o

nombre de México. AV. Universidad 2001, Col. Chamilpa, Cuernavaca 62210, México Departamento de Ingenieríai
2 un quimica, Facultad de Quimica, Universidad Nacional Aut.onombre de México, Ciudad de México 04510, México

* Correspondencia: alfredo.martinez@ibt.unam.mx ; Teléfono: +52-7773291601

Citación:Sierra-Ibarra, E.; Vargas-
Tah, A.; Moss-Acosta, CL; Trujillo-
Martínez, B.;
Molina-Vázquez, ER; Rosas-Aburto, A.;
Valdivia-López, Á.;
Hernández-Luna, MG;
Vivaldo-Lima, E.; Martínez, A. Co-
Fermentación de Mezclas de Glucosa-
Xilosa a partir de Residuos
Agroindustriales por Etanologénico
Escherichia coli: Un estudio sobre la falta de
represión de catabolitos de carbono en la
cepa MS04.Moléculas2022,27, 8941. https://
doi.org/10.3390/
moléculas27248941
Abstracto:La producción de biocombustibles, como el bioetanol a partir de biomasa lignocelulósica, es una
tarea importante dentro del concepto de energía sostenible. Entender el metabolismo de los microorganismos
etanologénicos para el consumo de mezclas de azúcares contenidos en hidrolizados lignocelulósicos podría
permitir mejorar el proceso de fermentación. En este estudio, la cepa etanologénicaEscherichia coli MS04 se
utilizó para fermentar hidrolizados de cinco residuos agroindustriales lignocelulósicos diferentes, que contenían
diferentes concentraciones de glucosa y xilosa. Las tasas volumétricas de consumo de glucosa y xilosa y la
producción de etanol dependen de la concentración inicial de glucosa y xilosa, las concentraciones de
inhibidores y el efecto positivo del acetato en la fermentación a etanol. Rendimientos de etanol superiores al
80% y productividades de hasta 1,85 gEtOH/Lh se obtuvieron. Además, en todas las evaluaciones se observó un
consumo simultáneo de glucosa y xilosa. El efecto de eliminar elxyIRSe estudió el regulador, concluyendo que
juega un papel importante en el metabolismo de los monosacáridos y en el consumo de xilosa. Además, se
confirmó la importancia del acetato para la cepa etanologénica, mostrando el efecto positivo del acetato sobre
las tasas de co-consumo de glucosa y xilosa en medios de cultivo e hidrolizados que contienen mezclas de
azúcar.

Editores académicos: Alejandro

Rodríguez Pascual, Eduardo Espinosa Palabras clave:hidrolizados lignocelulósicos;Escherichia coli; bioetanol; co-consumo de monosacáridos;
Victor y carlos martinorte represión catabólica

Recibido: 28 de octubre de 2022

Aceptado: 13 de diciembre de 2022

Publicado: 15 de diciembre de 2022

1. Introducción
Nota del editor:MDPI se mantiene neutral
El etanol es un producto importante en el transporte y la industria, ya que se considera una fuente
con respecto a reclamos jurisdiccionales en
de energía sostenible, renovable y ecológica.1]. A diferencia de los combustibles fósiles derivados del
mapas publicados y afiliaciones
petróleo, el etanol se puede producir a partir de biomasa lignocelulósica renovable mediante
institucionales.
fermentación microbiana; en particular, la síntesis de etanol utilizando lodos de residuos agroindustriales
como medios de cultivo tiene beneficios económicos y ambientales adicionales [2]. Por ello, se han
aplicado varias metodologías para el pretratamiento de estas materias primas para obtener purines

Derechos de autor:© 2022 por los

autores. Licenciatario MDPI, Basilea,
Suiza. Este artículo es un artículo de
acceso abierto distribuido bajo los
términos y condiciones de la licencia
Creative Commons Attribution (CC BY)
(https:// creativecommons.org/
licenses/by/ 4.0/).
enriquecidos con azúcares fermentables [3]. Es importante señalar que la lignocelulosa tiene tres
componentes principales: celulosa, hemicelulosa y lignina. Estos componentes se organizan en
macrofibrillas que confieren estabilidad estructural a la pared celular de la planta.4]. Cuando estas
fibrillas se pretratan con ácido diluido, liberan jarabes que contienen azúcares fermentables,
principalmente glucosa y xilosa.
La lignocelulosa se encuentra en los desechos agrícolas, que se considera un problema mundial
importante, ya que se infrautiliza y se produce en grandes cantidades, lo que la convierte en un contaminante
de difícil eliminación. Los países latinoamericanos, como México y Colombia, son conocidos

Lunar cules2022,27, 8941. https://doi.org/10.3390/molecules27248941 https://www.mdpi.com/journal/molecules

Moléculas2022,27, 8941 2 de 14

por su variedad de productos agrícolas y madereros, lo que los convierte en grandes productores de
residuos agrícolas [5]. En México, la producción de tequila y mezcal genera más de 360,000 toneladas
métricas de bagazo de agave al año [6]. De lo contrario, cada año se generan 42 millones de toneladas de
rastrojo de maíz [7], lo que convierte a estos residuos en algunos de los más relevantes en el país, ya que
tienen un alto potencial para ser utilizados como materia prima en la síntesis de productos de valor
agregado. La madera es otra industria importante en México. Por ejemplo, la producción de madera de
teca constituye 29.000 ha de árboles plantados en todo el país (https://www.eleconomista.com.mx/
opinion/Plantaciones-forestales-comerciales-deteca-en-Mexico-II-20190110-0137.html(consultado el 20
de octubre de 2022)); así, los residuos que produce esta industria en México también son significativos.
Por su parte, Colombia es uno de los productores de café más importantes del mundo [8], donde los
posos de café usados constituyen el principal subproducto, con potencial para convertirse en etanol,
biodiesel y otros productos de biorrefinería de alto valor [9]. Finalmente, en las últimas décadas, la
producción de cebada se ha incrementado a aproximadamente 140 millones de toneladas por año
debido al auge de las cervecerías artesanales y su uso para el consumo animal y humano [10], haciendo
del desarrollo de procesos para la valorización de sus residuos una apuesta atractiva.

Los residuos de los cultivos agroindustriales mencionados anteriormente contienen diferentes

concentraciones de azúcares fermentables. Sin embargo, su uso como materia prima para producir
productos de valor agregado como el etanol representa una importante oportunidad económica y
ambiental para los países mencionados. Por tanto, el estudio de la fermentación etanológena de
hidrolizados obtenidos bajo diferentes condiciones de tratamiento y con diferentes concentraciones de
azúcares e inhibidores es relevante para el desarrollo y mejora de procesos productivos específicos para
cada residuo agrícola. Sin embargo, los microorganismos etanologénicos de tipo salvaje no son capaces
de fermentar eficientemente todos los azúcares contenidos en los lodos hidrolizados, lo que limita el uso
de residuos lignocelulósicos para la producción de etanol.11]. Por lo tanto, etanologénico
metabólicamente diseñadoEscherichia coliPreviamente se han desarrollado cepas que producen etanol a
partir de glucosa o xilosa. Estas cepas lograron rendimientos de hasta el 90% cuando se cultivaron en
medios minerales o en ciertos hidrolizados lignocelulósicos.7]. Además, a diferencia de otros
microorganismos etanologénicos comunes como la levadura,E. colipuede consumir diferentes hexosas y
pentosas como glucosa, manosa y galactosa, y xilosa y arabinosa. Sin embargo,E. coliconsume
preferencialmente glucosa sobre otros azúcares; por lo tanto, la fermentación de las pentosas, como la
xilosa, se vuelve ineficiente y, a menudo, no se completa [12]. La preferencia en el consumo de glucosa se
debe al sistema glucosa fosfotransferasa (PTS) dependiente de fosfoenolpiruvato.13]. Este sistema está
involucrado en la regulación de varios procesos celulares, como la represión de catabolitos de carbono, y
es parte de una red reguladora global que controla la capacidad de las células para encontrar,
seleccionar, transportar y metabolizar varios tipos de fuentes de carbono.14].

Por otro lado, el transporte y metabolismo de la xilosa enE. coliestán mediados por dos
unidades transcripcionales principales,xylFGHRyxylAB, cuya expresión está gobernada por
promotores activados por xilosa y reprimidos por glucosa [15]. Sin embargo, la proteína
reguladora del operón xilosaxylRtiene un promotor débil no regulado por azúcar [dieciséis].
Además, se ha demostrado que en presencia de xilosa,xylRforma un atenuador que activa la
transcripción de las unidades transcripcionales mencionadas anteriormente [17]. También se ha
informado que en cepas de tipo salvaje y etanológenas deE. coli, mutaciones de dos puntos en el
xylRliberan la represión catabólica de carbono de la glucosa y la arabinosa sobre la xilosa, ya que
proporcionan una mayor afinidad de unión al ADN de las regiones promotoras de los operones
catabólicos de xilosa.dieciséis].
En este trabajo, la ingeniería metabólicaE. coliLa cepa MS04 se utilizó para la fermentación
etanologénica de jarabes lignocelulósicos a partir de diferentes residuos agrícolas. También se
realizaron fermentaciones en hidrolizados simulados como controles. Se evaluó la co-fermentación
de hexosas y pentosas, glucosa y xilosa, así como la producción de etanol.E. coliMS04 y un mutante
de esta cepa. Este trabajo discute el consumo simultáneo de glucosa y xilosa porE. coliMS04 en
diferentes hidrolizados lignocelulósicos y medios minerales, además de analizar las posibles
causas de la falta de represión catabólica en la cepa.
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2. Resultados y Discusión
2.1. Consumo conjunto de glucosa y xilosa por E. coli MS04 en medios simulados e hidrolizados de
plantas que contienen alta concentración de glucosa
E. coliMS04 se utilizó para la producción de etanol en hidrolizados simulados en laboratorio
(LSH) con el llamado medio mineral AM1 (ver Sección3) suplementado con glucosa y xilosa
(Figura1a), así como hidrolizados lignocelulósicos (ALH) agroindustriales, como residuos de
madera de teca (Figura1b) y bagazo de agave (Figura1C). Dado que la sacarificación
enzimática se realizó después del pretratamiento y antes de la fermentación, la
concentración de glucosa de las lechadas fue mayor que la de xilosa. Los parámetros
cinéticos y estequiométricos se muestran en la Tabla1.

50 40
a
40
30
Glucosa (g/L)
Xilosa (g/L)

30

Acetato (g/L)
EtOH (g/L)
20
20
10
10

0 0
0 10 20 30 40 50
50 25
b
40 20
Glucosa (g/L)

Acetato (g/L)
Xilosa (g/L)

30 15 EtOH (g/L)

20 10

10 5

0 0
0 10 20 30 40
40 30
C
glucos e (g/L)

30
Xilosa (g/L)

20
Acetato (g/L)
EtOH (g/L)

20

10
10

0 0
0 10 20 30
Tiempo (h)

Figura 1.Consumo de glucosa y xilosa y producción de etanol porE. coliMS04 en LSH y ALH con jarabes
que contienen concentraciones de glucosa relativamente altas y cantidades más bajas de xilosa. (a)
medio mineral, (b) madera de teca, (C) bagazo de agave.
Moléculas2022,27, 8941 4 de 14

Tabla 1.Rendimientos de etanol y parámetros volumétricos para la fermentación de hidrolizados con concentraciones
de glucosa relativamente altas (los valores entre paréntesis indican el error estándar de los duplicados).

Parámetro LSH de control Madera de teca bagazo de agave

Xmáximo(gramoDCW/L) 1.69 DAKOTA DEL NORTE DAKOTA DEL NORTE

m (h−1) 0.16 DAKOTA DEL NORTE DAKOTA DEL NORTE

YEtOH(%) 88 92 (5) 81 (5)

qglc(gramopegamento/ 1.61 0,72 (0,00) 1,59 (0,02)
Lh) Qxilo(gramoxilo/Lh) 0,69 0,18 (0,02) 0,73 (0,01)
qEtOH(gramoEtOH/Lh) 0.92 0,42 (0,02) 0,96 (0,05)
Xmax: concentración de masa celular máxima, DCW: peso celular seco, ND: no determinado,µ:tasa de crecimiento específica, Y
EtOH: rendimiento de etanol a partir de azúcares consumidos; qglc: tasa de consumo volumétrico de glucosa, Qxilo: tasa de
consumo volumétrico de xilosa, QEtOH: productividad volumétrica de etanol.

Aunque tanto ALH como LSH tienen diferentes concentraciones de azúcar, es interesante
notar que ambos azúcares se consumieron simultáneamente. En todos los hidrolizados evaluados,
la mayoría de los azúcares se consumieron entre 5 y 20 h después del inicio de los experimentos
(Figura1antes de Cristo). Dependiendo del hidrolizado, la tasa de consumo volumétrico de glucosa
(Qglc) fue de 1,5 a 4 veces mayor que la tasa de consumo de xilosa (Qxilo). Además, la productividad
volumétrica del etanol (QEtOH) también muestra una amplia gama de valores (Tabla1). Por lo tanto,
las variaciones en el consumo volumétrico y las tasas de producción parecen estar determinadas
por la naturaleza del residuo y la concentración inicial de monosacáridos fermentables.

La fermentación del hidrolizado de madera de teca mostró las tasas de consumo volumétrico
de azúcar más bajas, ya que al final de las pruebas se mantuvo el 25 % y el 53 % de la glucosa
inicial y la xilosa, respectivamente (Figura1b). Estas bajas tasas de consumo de azúcar y
productividad de etanol se debieron a las cantidades relativamente altas de compuestos derivados
de fenoles como la vainillina, el ácido vanílico, el guayacol y el catecol.18] contenido en estos lodos
(12 g/L), que son tóxicos paraE. colien concentraciones superiores a 1 g/L [19]. Por otro lado, los
hidrolizados de bagazo de agave han sido previamente fermentados a etanol por levaduras,
logrando productividades entre 0.5 y 7.2 g.EtOH/Lh [20,21]; sin embargo, en dichos estudios, hubo
bajas tasas de consumo de pentosas. Se reportaron resultados similares para la fermentación de
hidrolizados de pino enmendados con extracto de levadura y fermentados con el etanologénicoE.
coli KO11, donde una Qpagde 0,73 g/Lh sin una depleción completa de xilosa [22]. Mientras tanto, el
uso de etanologénicoE. coliMS04 en hidrolizado de bagazo de agave ha mostrado rendimientos y
productividades de 81.6–85.3% y 0.68–1.2 gEtOH/Lh para tratamientos con líquidos iónicos y
organosolv, respectivamente [23]. Estos valores están de acuerdo con los obtenidos en el presente
trabajo (Tabla1). Además, en ambos estudios se observó un consumo simultáneo de glucosa y
xilosa, lo que a su vez mejoró la eficiencia del proceso de fermentación.

Como se muestra en la figura1, a pesar de las diferencias en las condiciones de tratamiento de la

biomasa y los contenidos variables de glucosa y xilosa en los hidrolizados, el consumo conjunto de
hexosas y pentosas fue notable en los tres experimentos. Además, en el caso de los hidrolizados de
madera de teca, la mayor cantidad de glucosa disponible en los tiempos iniciales de fermentación y el
contenido de cantidades inhibidoras de compuestos fenólicos no dificultaron seriamente el consumo de
azúcares.

2.2. Consumo conjunto de glucosa y xilosa por E. coli MS04 en hidrolizados de plantas y simulados que
contienen una alta concentración de xilosa
Jarabes de baja concentración de glucosa obtenidos de la hidrólisis termoquímica del rastrojo
de maíz (Figura2b), paja de cebada (Figura2c) y posos de café gastados (Figura2d) fueron utilizados
como medios para la producción de etanol conE. coliMS04. Es importante señalar que, salvo el
correspondiente a los posos de café, las lechadas utilizadas no fueron sacarificadas antes del
proceso de fermentación. Estos resultados muestran que el consumo simultáneo de ambos
monosacáridos también se observó cuando se utilizaron lodos lignocelulósicos con
concentraciones más altas de xilosa.
Moléculas2022,27, 8941 5 de 14

30 20 30 15
a b
25 25
Glucosa (g/L)
Xilosa (g/L)

15

Glucosa (g/L)
Acetato (g/L)
EtOH (g/L)
20 10

Xilosa (g/L)
20

Acetato (g/L)
EtOH (g/L)
15 10 15

10 10 5
5
5 5

0 0 0 0
0 5 10 15 20 25 0 20 40 60 80
Tiempo (h) Tiempo (h)
25 10 20 15
C d
20 8
15
Glucosa (g/L)

Glucosa (g/L)
Xilosa (g/L)
Xilosa (g/L)

10
Acetato (g/L)
EtOH (g/L)

15 6

Acetato (g/L)
EtOH (g/L)
10
10 4
5
5
5 2

0 0 0 0
0 5 10 15 20 25 0 10 20 30 40 50
Tiempo (h) Tiempo (h)

Figura 2.Consumo de glucosa y xilosa y producción de etanol porE. coliMS04 en LSH y ALH con mayor
proporción de xilosa. (a) medio mineral, (b) rastrojo de maíz, (C) paja de cebada, (d) posos de café
gastados.

Con respecto a los posos de café gastados (Figura2d), esta biomasa se ha utilizado como
materia prima para la producción de biodiesel debido a su composición química y perfil lipídico
deseable [24]; sin embargo, la proporción relativamente alta de carbohidratos que contiene este
residuo (aproximadamente 13% y 42% de celulosa y hemicelulosa, respectivamente) también lo
convierte en una fuente adecuada para la producción de bioetanol [9]. Por ejemplo, en estudios
previos, la producción de etanol a partir de hidrolizados de café molido usado se realizó utilizando
la levaduraS. cerevisiae como biocatalizador, logrando YEtOHy qEtOHhasta 91% y 1,0 g/Lh,
respectivamente [25], del consumo de glucosa. Esta tasa de productividad es en promedio 2,6
veces superior a la reportada en nuestro estudio (Cuadro2). Sin embargo, una ventaja de usarE. coli
MS04 como microorganismo productor de etanol es que permite el uso de hexosas y pentosas
como sustrato. Además, antes de la fermentación, una extracción de aceites y derivados fenólicos
de lignina de los hidrolizados de café molido podría ser una estrategia adecuada para mejorar la
productividad de etanol en cultivos conE. coli[26].

Tabla 2.Rendimientos de etanol y parámetros volumétricos para la fermentación de hidrolizados con concentraciones
de xilosa relativamente altas (los valores entre paréntesis indican la desviación estándar de los triplicados).

Parámetro LSH de control Restos de Maíz paja de cebada

Xmáximo(gramoDCW/L) 1.61 DAKOTA DEL NORTE DAKOTA DEL NORTE

m (h−1) 0.19 DAKOTA DEL NORTE DAKOTA DEL NORTE

YEtOH(%) 75 81 (1) 82 (4)

qglc(gramoglc/Lh) 0,61 0,31 (0,01) 0,35 (0,02)
Qxilo(gramoxilo/Lh) 1.29 0,52 (0,02) 0,77 (0,03)
qEtOH(gramoETOH/Lh) 0.72 0,25 (0,02) 0,36 (0,01)

Fermentación de hidrolizados de rastrojo de maíz (Figura2b) y paja de cebada (Figura2c) no

mostró un co-consumo claro de ambos monosacáridos debido a que su glucosa inicial
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Las concentraciones de cose estaban por debajo de 4 g/L. Este problema dificulta el análisis porque, como se
informó en estudios anteriores, en condiciones de oxígeno limitado, las concentraciones bajas de glucosa
desencadenan altos niveles transcripcionales deptsG, un gen que está directamente involucrado en la represión
catabólica, afectando a su vez la regulación metabólica celular [27]. Además, la tasa de captación de glucosa
está limitada por la concentración de glucosa.28], lo que explica la menor Qglcpara estos jarabes (Tabla2).
Mientras tanto, de manera similar a las tasas de consumo de azúcar, QEtOHparece verse afectado negativamente
por la concentración inicial de azúcar, siendo de 0,5 a 4 veces menor que otros informes para la producción de
etanol a partir de maíz y cebada [29,30]. Además, una YEtOHpor encima del 80% demuestra que la baja
concentración de glucosa afecta la cinética del proceso pero no los rendimientos.

Como era de esperar, las tasas de captación de xilosa fueron más altas que las tasas de glucosa en medios
con bajas concentraciones de glucosa (Tabla2) ya que el consumo de azúcar está menos regulado en estos casos
[29]. La única excepción a esto es el caso de los posos de café, donde Qglcfue mayor que Qxilo
(Mesa2). De estos resultados podemos inferir que la cinética del consumo de azúcar y la producción de
etanol no solo dependen de la proporción de azúcares, sino también de la composición del hidrolizado.
Esta afirmación se refuerza al comparar los resultados de los cultivos de control en medios minerales
(Tablas1y2), donde el crecimiento celular expresado como Xmáximoyµes similar, y QEtOHes sólo
ligeramente inferior para el medio con más xilosa, a pesar de las diferencias en las tasas de consumo de
azúcar.
Teniendo en cuenta los resultados discutidos anteriormente, este trabajo tiene como objetivo
obtener una mayor comprensión de las causas del consumo conjunto de xilosa y glucosa con el
etanologénico.E. coliMS04.

2.3. La Falta de Acetato en los Medios Minerales Afecta Negativamente al Consumo de Azúcar
Uno de los compuestos inhibidores más estudiados que contiene la ALH es el acetato,
que se libera durante la hidrólisis de la hemicelulosa en concentraciones entre 1,5 y 13 g/L.31
]. Sin embargo, algunos etanologénicosE. colilas cepas han mostrado tolerancia y crecimiento
mejorado bajo ciertas concentraciones de acetato; específicamente,E. coliLa cepa MS04 crece
a tasas más altas cuando hay al menos 2 g/L de acetato en el medio de cultivo y es capaz de
tolerar concentraciones de acetato de hasta 10 g/L.32]. Además,E. colipuede coconsumir
mezclas de glucosa, arabinosa y xilosa a un ritmo mayor en presencia de acetato que cuando
está ausente [33]. En consecuencia, estudiamos el co-consumo de estos tres monosacáridos
(a concentraciones iniciales de 25 g/L de cada azúcar) y la producción de etanol porE. coli
MS04 en medio mineral sin acetato (WOA) y con acetato (WA) a una concentración inicial de 2
g/L.
Las curvas en la Figura3b, c muestran el efecto positivo que tiene el acetato en las tasas de
consumo de azúcar, producción de etanol y en la concentración celular máxima (Tabla3). En medio
WA, la glucosa se consumió por completo después de 48 h, quedando cantidades menores de
xilosa y arabinosa después de este tiempo de fermentación transcurrido, pero estas pentosas se
consumieron por completo después de 72 h (Figura3b). Aunque la tasa de consumo de glucosa fue
un 50% más alta que la tasa de consumo de xilosa y arabinosa (Tabla3), es importante señalar que
hubo una absorción simultánea de los tres azúcares y que se observó un alto rendimiento de
etanol. Por el contrario, la fermentación en medio WOA mostró menor y más variable consumo de
azúcar (Figura3C). Por lo tanto, después de 48 h, el 6%, 39% y 22% de las concentraciones iniciales
de glucosa, xilosa y arabinosa permanecieron en los medios de cultivo, respectivamente. además q
EtOHy Xmáximo(Mesa3) también fueron un 94 % y un 72 % inferiores en comparación con el WA

medio. Acerca deµvalores, la tasa de crecimiento celular no parece verse afectada por la presencia
de acetato.
Los resultados descritos anteriormente demuestran que, en condiciones no aireadas,
concentraciones moderadas de acetato mejoran el consumo de azúcares y la producción de etanol
porE. coliMS04. Esto se debe en parte a la necesidad de la cepa de generar acetil CoA como pflBse
eliminó el gen [32].
Moléculas2022,27, 8941 7 de 14

10
a
Glu_Xyl_Ara_Acetato

Biomasa (gdcw/L)
1

Glu_Xyl_Ara
0.1

0.01
0 10 20 30 40 50
30 40
b
25
Arabinosa (g/L)

30
Glucosa (g/L)
Xilosa (g/L)

20

Acetato (g/L)
EtOH (g/L)
15 20

10
10
5

0 0
0 20 40 60 80
30 30
C
25
Glucosa (g/L)

Arabinosa (g/L)
Xilosa (g/L)

20 20 EtOH (g/L)
15

10 10

0 0
0 20 40 60 80
Tiempo (h)

Figura 3.Cinética del crecimiento celular (a); consumo de glucosa, xilosa y arabinosa (25 g/L cada uno en
el tiempo inicial), y producción de etanol porE. coliMS04 en medio mineral WA 2 g/L (b) y WOA (C).

Tabla 3.Rendimientos de etanol y parámetros volumétricos para la fermentación de mezclas de glucosa-

xiloserarabinosa de 25 g/l (cada una) porE. coliMS04 en medio mineral WA 2 g/L y WOA (los valores entre
paréntesis indican el error estándar de los duplicados).

Parámetro Washington Guau

m (h−1) 0,14 (0,00) 0,13 (0,00)
Xmáximo(gramoDCW/L) 1,12 (0,09) 0,65 (0,06)
YEtOH(%) 95 (5) 90 (2)
qglc(gramopegamento/ 0,51 (0,04) 0,33 (0,01)
Lh) Qxilo(gramoxilo/Lh) 0,32 (0,02) 0,16 (0,00)
Qara(gramoara/Lh) 0,35 (0,02) 0,25 (0,01)
qEtOH(gramoETOH/Lh) 0,66 (0,01) 0,34 (0,02)
Moléculas2022,27, 8941 8 de 14

En relación al consumo simultáneo de mezclas de azúcar, las curvas de la Figura3b, c

muestran que la falta de acetato no libera la represión catabólica. Además, la jerarquía establecida
para los azúcares consumidos preferentemente porE. colies claramente perceptible en la
fermentación WOA, donde la glucosa se consumió a la tasa más alta, seguida por arabinosa y
luego xilosa (Tabla3). Estos resultados concuerdan con el modelo de represión por catabolitos de
carbono enE. coli, que establece que se consume preferentemente glucosa, seguida de arabinosa y
finalmente xilosa. Esto se debe a que el operón de arabinosa regula el metabolismo de la xilosa, lo
que conduce a un consumo favorable de arabinosa sobre xilosa.34]. Este comportamiento sugiere
que el acetato contenido en los hidrolizados evaluados podría ser en parte responsable de la falta
de regulación de la absorción de azúcar. Aún así, otros mecanismos reguladores inducen este
fenómeno, haciendo que el consumo de azúcares porE. coliMS04 cepa un complejo sistema de
regulación metabólica.

2.4. El consumo de xilosa se rige por el activador XylR

EnE. coli, XylR es un activador transcripcional para la captación de xilosa. Por lo tanto, en
presencia de xilosa, promueve la transcripción delxylFGHyxylABoperones, que son necesarios para
el metabolismo de la xilosa.17]. A pesar dexylFGHfue eliminado deE. coligenoma de la cepa MS04,
estudios previos realizados por nuestro grupo han demostrado que la cepa parental MS04 también
internaliza xilosa a través del transportador de galactitol GatC mientras quexylAB los genes son
transcripcionalmente activos [35]. Por lo tanto, estudiamos la función dexylRen la coutilización de
azúcares porE. coliMS04, su posible relación con la falta de represión del catabolito de carbono y el
efecto combinado con acetato. Con este fin, elxylRel gen fue eliminado delE. coligenoma MS04 (E.
coliMS04∆xylR) y se realizaron fermentaciones con esta nueva cepa. En estas pruebas, mezclas de
glucosa-xilosa a concentraciones iniciales de 25 g/L para cada una fueron fermentadas en dos
medios diferentes, uno con 5 g/L de acetato y otro sin acetato. Cifra4muestra el rendimiento de
etanol y los parámetros cinéticos obtenidos para estas fermentaciones.

1.4
m (h-1)
1.2
0.98

YEtOH(gramoEtOH/gramoazúcares)
0.87

1.0
0.84

qglc(gramoglc/Lh) Q

0.8 xilo(gramoxilo/Lh)
0,45

0.6
0.40

qEtOH(gramoEtOH/izq)
0.4
0.22

0.18

0.2
0.07

0.03
0.03

0.0
ua gton

ua gton

ua gton

ua gton

ua gton
u

u
n

n
hi

hi

hi

hi

hi
as

as

as

as

as
W

W
G

Figura 4.Rendimiento de etanol y parámetros cinéticos para la fermentación de mezclas de glucosa-xilosa de 25 g/L
(cada una) porE. coliMS04∆xylRen medios minerales con acetato (WA, 5 g/L) y sin acetato (WOA) (las barras indican la
desviación estándar de los experimentos por triplicado).

Estos resultados muestran que el consumo de xilosa fue nulo en ambos cultivos, demostrando la
necesidad de XylR para el metabolismo de la xilosa enE. coli. A diferencia de MS04 (Tabla3), elµpara el
MS04 ∆xylRtensión (Figura4) fue tres veces menor cuando no había acetato en el medio de cultivo, lo que
demuestra la importancia del consumo de xilosa para el crecimiento celular incluso en medios que
contienen glucosa. Aunque YEtOHlos valores fueron similares, el consumo de glucosa y las tasas de
producción de etanol fueron aproximadamente 2,5 veces menores para las fermentaciones WOA.
Además, Qglcen presencia de acetato fue el doble de lo observado para
Moléculas2022,27, 8941 9 de 14

MS04 (Tabla3y figura4), lo que sugiere que, en ausencia de una ruta activa del metabolismo de la
xilosa, toda la energía catabólica se dirige hacia el consumo de glucosa.
Los resultados obtenidos paraE. coliMS04∆xylRdemuestran que, independientemente de los
azúcares consumidos,XylRjuega un papel esencial en el metabolismo de la xilosa, y también destaca la
importancia del acetato para el consumo de azúcar y las tasas de producción de etanol. Sin embargo,
estos resultados no explican la falta de represión de catabolitos de carbono enE. coliMS04. Por lo tanto,
se realizó una revisión exhaustiva de la secuencia del genoma de la cepa MS04, con el objetivo de
encontrar posibles deleciones, cambios o polimorfismos de un solo nucleótido (una variación en una sola
posición en una secuencia de ADN en el genoma) que pudieran ayudar a explicar la coutilización de
azúcares. Además, la secuencia dexylRfue analizado cuidadosamente, ya que se informó anteriormente
que los polimorfismos de un solo nucleótido en este gen anulan la preferencia por la glucosa sobre otros
monosacáridos.36]. Sin embargo, no se encontraron cambios en el MS04.xylRsecuencia. Por otro lado, los
resultados presentados en este trabajo muestran una clara co-fermentación de mezclas de azúcares bajo
diferente composición de medios e hidrolizados lignocelulósicos; por lo tanto, se necesitan estudios
adicionales para revelar las causas de la falta de represión de catabolitos de carbono enE. coliMS04.

3. Materiales y Métodos
3.1. Presiones
3.1.1.Escherichia coliMS04
Escherichia colicepa MS04 (MG1655:∆pflB,∆AdhE,∆frdA,∆xylFGH,gatC-S184L, ∆MidarpA,∆
registro 27.3 kb,∆ldha) [7] fue utilizado como biocatalizador para la producción de etanol en
medio mineral e hidrolizados lignocelulósicos.

3.1.2.Escherichia coliMS04∆xylR
Eliminación dexylRgen deE. coliMS04 se llevó a cabo usando la metodología de
transducción de fagos.Escherichia colila cepa MS04 es resistente a la kanamicina (Km) debido
a una mutación en la secuencia FRT. El casete resistente a Km colocado en el locusxylFGHfue
reemplazado por un casete resistente al cloranfenicol (Cm). Esto fue realizado por un evento
de transducción P1 como se informó anteriormente [37]. UnE. colicepa MG1655∆xylFGH::CmR
construido en nuestro laboratorio (datos no publicados) se utilizó como cepa donante. El
mutante MS04 ∆xylFGH::CmRfue seleccionado en placas LB suplementadas con Cm a 30µg/
mL, y se verificó la sensibilidad de la Km. El reemplazo de la resistencia del casete fue
confirmado por PCR. La cepa resultante se usó para un segundo proceso de transducción de
P1. Cepa JW3541-2 (BW25113 ∆xylR::KmR) de la colección Keio se utilizó como cepa donante [
38]. Además, el mutante MS04∆xylFGH::CmR∆xylR::KmRse seleccionó en placas LB y se
complementó con Cm y Km a 30µg/ml cada uno. Finalmente, la eliminación dexylREl gen en
el fondo MS04 fue confirmado por PCR.

3.2. Medios culturales

3.2.1. Hidrolizados simulados en laboratorio
Fermentaciones de control y estudio del efecto acetato con la cepa MS04, y cultivos con
MS04∆xylR, se realizaron en medio mineral AM1 [39]. La composición del medio AM1 fue de
2,63 g/L (NH4)2HPO4, 0,87 g/L NH4H2correos4, 1 mL/L MgSO47H2O (1 M), 1 mL/L de KCl (2 M), 1
mL/L de betaína HCl (1 M) y 1,5 mL/L de oligoelementos. El medio se complementó con 0,1 g/
L de citrato de sodio y se añadieron diferentes concentraciones de xilosa, glucosa y
arabinosa, y acetato de sodio según fuera necesario. La solución de oligoelementos contiene
por litro 1,6 g de FeCl3, 0,2 g CoCl2·6 horas2O, 0,1 g CuCl2, 0,2 g ZnCl2·4H2O, 0,2 g Na2Mugir4,
0,05 g H3BO3y 0,33 g MnCl2·4H2O. Cuando se requiera, 30µSe usaron g/L de Km o Cm para el
desarrollo del inóculo.
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3.2.2. Hidrolizados lignocelulósicos Hidrolizados

de madera de teca y bagazo de agave
Los hidrolizados de residuos de madera de teca y bagazo de agave se prepararon de acuerdo con
una metodología previamente reportada [40]. El procedimiento incluye una hidrólisis termoquímica
realizada en un reactor tipo parr de 5 L que contiene un sistema gas-líquido-sólido de 18% w/wpolvo de
biomasa, 7%w/wENTONCES2y agua. Las condiciones de reacción típicas se operaron a 140◦C y 450 rpm
durante 90 min. La sacarificación enzimática de lechadas obtenidas de pretratamientos termoquímicos
de madera de teca y bagazo de agave se realizó con un cóctel de celulasa comercial (43 FPU g−1, 100U
xilanasagramo−1) (NEO Biotech Co., Ltd., Xi'an, China) en un conjunto de seis minirreactores de 0,2 L
(volumen de trabajo) equipados con un mezclador de clavijas [6]. Se añadió suficiente citrato de sodio
para obtener una concentración final de 50 mM, mientras que el pH de la suspensión se ajustó a 4,8
añadiendo KOH 10 N y 15 FPU/g.glucanodel cóctel de celulasa se complementó para la sacarificación.

Hidrolizados de paja de cebada y rastrojo de maíz

Los hidrolizados de paja de cebada y rastrojo de maíz se obtuvieron mediante hidrólisis
termoquímica realizada con una carga de biomasa seca del 15%.w/w, 1%w/wH2ENTONCES4, y en 121◦C
durante 30 min (tiempo de mantenimiento). Los hidrolizados se usaron como medio de cultivo sin pasos
de pretratamiento adicionales.

Hidrolizados de posos de café usados

Los hidrolizados de posos de café usados se obtuvieron mediante un pretratamiento
termoquímico realizado con 15%w/wbiomasa seca, 1%w/wH2ENTONCES4, y en 121◦C durante 30
min (tiempo de mantenimiento). Después del pretratamiento, se realizó sacarificación enzimática
con complejo de celulasa comercial GC220 (Genencor International, Rochester, NY, EE. UU.) y β-
glucosidasa NS50010 (Novozymes, Copenhague, Dinamarca) a 15 FPU/gglucanoy 30 UCB/gbiomasa
seca, respectivamente. El proceso de sacarificación se realizó a 50◦C y pH 4,5 durante 48 h.

3.3. Fermentación en Hidrolizados Lignocelulósicos Simulados y Agroindustriales

Las fermentaciones tanto para hidrolizados simulados en laboratorio (LSH) como para
hidrolizados lignocelulósicos agroindustriales (ALH) se llevaron a cabo utilizando el método
etanologénicoE. coli cepa MS04 [32] o sus derivados. El preinóculo se preparó cultivando células a
partir de un criovial (1:1 de glicerol al 80 % y cepa a OD600~2,0 en medio mineral) en tubos de
ensayo que contengan 4 mL de medio mineral con 10 g/L de glucosa o xilosa. Posteriormente, las
células se incubaron durante 12 h a 37◦C y 300 rpm. El inóculo se preparó transfiriendo el
contenido de las probetas a fermentadores de 200 mL que contenían medio mineral AM1, 20 g/L
de glucosa o xilosa y 2 g/L de acetato. El inóculo se cultivó durante ~24 h a 37◦C, 150 rpm y pH 7
(controlado con KOH 2N), hasta OD600se alcanzó entre 1,5 y 2. Las células se recogieron por
centrifugación (4◦C, 10 minutos, 4300×gramo), resuspendido en medios minerales frescos y luego
utilizado para inocular los fermentadores con LSH o ALH en una OD inicial600~0.5.

Las fermentaciones se realizaron en el mismo sistema de biorreactor utilizado para la

sacarificación. Antes de la inoculación, el pH de los recipientes que contenían ALH se ajustó a 7 con
KOH 8 N y soluciones concentradas de betaína (como osmoprotector) a una concentración final de
1 mM. Luego se adicionó tampón fosfato, ácido cítrico y Km hasta concentraciones finales de 1
mM, 5 mM, 100 mg/L y 30µg/L, respectivamente. Los cultivos se incubaron a 37◦C, 150 rpm y pH 7
(controlado con KOH 2 N) hasta lograr el agotamiento o consumo completo del sustrato.

3.4. Determinaciones de Biomasa, Glucosa, Xilosa, Arabinosa, Acetato y Etanol

El crecimiento en LSH se determinó espectrofotométricamente utilizando una densidad
óptica de 600 nm (DU 70, Beckman Instruments, Inc. Fullerton, CA, EE. UU.). Los valores dados por
el espectrofotómetro se convirtieron a peso de celda seca (DCW) usando una calibración
Moléculas2022,27, 8941 11 de 14

curva, que indica que 1 densidad óptica a 600 nm = 0,37 gDCW/l Las muestras se centrifugaron y el
caldo de cultivo libre de células se congeló para su posterior análisis. Las concentraciones de xilosa,
arabinosa y acetato se midieron mediante cromatografía líquida de alta resolución (Waters U6K,
Millipore Co., Milford, MA, EE. UU.) usando una columna de exclusión de iones Aminex HPX-87H
(300 mm×7,8 mm; Laboratorios Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.) a los 45◦C, mientras usa 5.0 mM H2
ENTONCES4solución como fase móvil (0,5 ml/min), un detector de matriz de fotodiodos a 210 nm
(Modelo 996, Waters, Millipore Co) y un detector de índice de refracción (Modelo 2410, Waters,
Millipore Co., Milford, MA, EE. UU.). La concentración de glucosa en el medio de cultivo se midió con
un analizador bioquímico (YSI modelo 2700, YSI Inc., Yellow Springs, OH, EE. UU.). Finalmente,
como describen Fernández-Sandoval et al. [32], el etanol producido a partir de las fermentaciones
se cuantificó mediante cromatografía de gases (Agilent, 6850 series GC System, Wilmington, DE, EE.
UU.).

3.5. Cálculo de Parámetros Cinéticos y Estequiométricos

Los parámetros cinéticos y estequiométricos para las fermentaciones de etanol se calcularon de
acuerdo con las Ecuaciones (1)–(4) [19].

3.5.1. Tasa de crecimiento específica (µ)

En el caso de experimentos con hidrolizados, debido al color de los jarabes y/oa la

presencia de sólidos, no se midió la densidad óptica. Así, sólo elµpara los experimentos de
control se calculó durante el crecimiento celular exponencial utilizando la Ecuación (1):
()
enXX0
µ= (1)
t−t0

donde X (gDCW/L) es la concentración de biomasa al final del crecimiento celular exponencial, X0

(gramoDCW/L) es la concentración de biomasa inicial, t (h) es el tiempo transcurrido al final del
crecimiento celular exponencial y t0(h) es el tiempo inicial.

3.5.2. Rendimiento de etanol (YEtOH)

El rendimiento de etanol a partir de azúcares totales se calculó en base a un rendimiento teórico de 0,51 g.EtOH/
gramoazúcarde acuerdo con la Ecuación (2).

EtOHF−EtOH0×100% (St0
YEtOH= −St.f.)× (2)
0.51

donde EtOHF(gramoEtOH/L) es la concentración máxima de etanol, EtOH0(gramoEtOH/L) es la

concentración inicial de etanol, ST0(gramoazúcares/L) es la suma de la concentración inicial de azúcar
y Say St.f.(gramoazúcares/L) son la suma de la concentración de azúcar al inicio y al final de las
fermentaciones.

3.5.3. Tasa Volumétrica de Consumo de Azúcar (QS)

Las tasas de consumo volumétrico para azúcares individuales, es decir, glucosa (glc), arabinosa
(ara) o xilosa (xil), se determinaron mediante la Ecuación (3).

S0−SF
q S= (3)
tF−t0

donde S0(gramoazúcar/L) es la concentración inicial de azúcar (glc, ara o xyl), y SF(gramoazúcar/L) es

la concentración de azúcar (glc, ara o xyl) al final de la fermentación.

3.5.4. Productividad Volumétrica del Etanol (QEtOH)

La tasa de producción volumétrica de etanol se calculó usando la Ecuación (4).

EtOHF−EtOH 0
qEtOH= (4)
tEtOH−t0
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donde EtOHF(gramoEtOH/L) es la concentración máxima de etanol, EtOH0(gramoEtOH/L) es la

concentración inicial de etanol, tEtOHes el tiempo transcurrido (h) a la concentración máxima de
etanol y t0es el tiempo inicial (h).

4. Conclusiones
El etanologénicoEscherichia coliLa cepa MS04 fue capaz de producir eficientemente etanol a
partir de varios hidrolizados lignocelulósicos, que se obtuvieron de diferentes pretratamientos y
procesos de sacarificación. A pesar de las diferencias en las condiciones de tratamiento de la
biomasa y los contenidos variables de glucosa y xilosa, se mostró una clara cofermentación de
hexosas y pentosas en mezclas de azúcares bajo diferentes composiciones de medios e
hidrolizados lignocelulósicos, lo que indica una falta parcial de represión de catabolitos de carbono.
Incluso la presencia de compuestos fenólicos que inhibenE. coliel crecimiento y la fermentación no
obstaculizaron seriamente el consumo conjunto de azúcares y la conversión en etanol. Las tasas
volumétricas de consumo de azúcar y producción de etanol dependen de la proporción inicial de
glucosa y xilosa, concentraciones de inhibidores y un efecto positivo del acetato (generado en los
hidrolizados de la desacetilación de la hemicelulosa). Además, la supresión de la xylRgen
involucrado en el metabolismo de la xilosa confirma su papel esencial en el consumo de xilosa.
Estos resultados dan una primera idea del metabolismo de los monosacáridos enE. coliMS04 desde
una perspectiva fenomenológica, pero se necesitan estudios adicionales para revelar las causas de
la falta de represión de catabolitos de carbono enE. coliMS04.

Contribuciones de autor:Conceptualización: ES-I. y yo; metodología: ES-I., AV-T., CLM-A., BT-M. y

ERM-V.; validación:A.V.-L. y EV-L.; análisis formal: ES-I., AR-A. y yo; investigación: ES-I., AV-T. y yo;
recursos: MGH-L., EV-L. y yo; redacción—preparación del borrador original: ES-I. y yo; redacción—
revisión y edición: AV-T., EV-L. y yo; supervisión: AR-A.,A.V.-L., MGH-L. y yo; administración del
proyecto: EV-L. y yo; financiación adquisición: EV-L., MGH-L. y AM Todos los autores han leído y
aceptado la versión publicada del manuscrito.

Fondos: Esta investigación fue financiada por la Universidad Nacional Aut.onombre de MmiMéxico
(UNAM)—PAPIIT-DGAPA-UNAM Beca IV100119 e IG10122.

Declaración de la Junta de Revisión Institucional:No aplica.

Declaración de consentimiento informado:No aplica.

Declaración de disponibilidad de datos:Los datos presentados en este estudio están disponibles previa solicitud al
autor correspondiente.

Expresiones de gratitud:Agradecemos a Georgina Hernandez-Chávez, Patricia Bustos-Arcos,

Omar Arriaga-Pmirez, Arturo Ocadiz-ramirez y Servando Aguirre-Cruz por su apoyo técnico. Este
trabajo fue apoyado por la Universidad Nacional Aut.onombre de Mmixico (UNAM)—PAPIIT-
DGAPA-UNAM Beca IV100119 e IG10122. ES-I. becado por la DGAPA-UNAM.

Conflictos de interés:Los autores declaran no tener conflicto de intereses.

Disponibilidad de muestras:Las muestras de los compuestos están disponibles de los autores.

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