UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA SEDE MEDELLÍN

FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA DE QUIMICA
LABORATORIO DE BIOQUIMICA

PRACTICA No 2. CUANTIFICACION DE PROTEINAS EN EL SUERO SANGUINEO

OBJETIVOS

 Separar las globulinas presentes en el suero sanguíneo humano mediante precipitación con solución
salina.
 Determinar la concentración de proteínas totales, de globulinas y de albúmina en el suero sanguíneo
mediante fotocolorimetría.

ASPECTOS TEÓRICOS

Las proteínas desempeñan una enorme variedad de funciones que van desde el transporte y el
almacenamiento de moléculas pequeñas hasta la organización estructural de las células y los tejidos,
pasando por la contracción muscular, la respuesta inmunitaria, la coagulación de la sangre y la catálisis
de cientos de reacciones metabólicas. Para cumplir esta diversidad de funciones cada célula en cada
organismo debe poseer una buena cantidad de proteínas.

CLASIFICACION DE PROTEINAS

Las proteínas suelen clasificarse de acuerdo a diferentes criterios, así:

a. PRESENCIA DE GRUPOS PROSTETICOS

Según este criterio, las proteínas pueden ser simples o conjugadas. Son simples cuando están
constituidas únicamente por cadenas de aminoácidos. Son conjugadas, cuando además de las cadenas
polipéptidos, tienen otros grupos enlazados covalentemente. Si el grupo prostético es un carbohidrato,
el conjunto se llamará muco o glucoproteína; si es un lípido, se llamará lipoproteína; si el grupo es un
ácido nucleico, la proteína será una nucleoproteína, y si es el grupo hemo, será una hemoproteína.

b. SOLUBILIDAD EN VARIOS SOLVENTES

Según este parámetro, las proteínas reciben algunos de los siguientes nombres:

 Albúminas, cuando son solubles en agua y en soluciones acuosas salinas diluidas.

 Globulinas, apenas solubles en agua, pero si en soluciones salinas diluidas. Se precipitan en
soluciones semisaturadas de sulfato de amonio.
 Prolaminas, solubles en etanol entre 70 y 80%; insolubles en agua y en etanol puro.
 Histonas, solubles en soluciones salinas.
 Glutelinas, insolubles en agua, etanol, y soluciones salinas, pero solubles en soluciones ácidas y
básicas diluidas.

c. FORMA ESTRUCTURAL NATIVA:

De acuerdo con este criterio, las proteínas se clasifican como fibrosas o como globulares.

 Proteínas fibrosas: Presentan una conformación alargada y filamentosa, con estructuras secundarias
(-hélice y -laminar plegada) bien definidas. Normalmente desempeñan funciones estructurales en las
células, y comprende las proteínas de la piel (-queratina, colágeno), del tejido conjuntivo (colágeno,
elastina), del hueso (colágeno), de los vasos sanguíneos (elastina), del músculo (actina y miosina), del
pelo (-queratina), de las uñas (-queratina), de la seda (fibroína), de la lana (-queratina), de las
plumas y las escamas (-queratina).
 Proteínas globulares: Tienen una conformación compacta y cuasi-esférica, debido a que sus
estructuras secundarias se pliegan formando otros arreglos superiores llamados estructuras terciarias y
cuaternarias. Sus funciones son dinámicas, y casi siempre se derivan de la capacidad de unión y acción
que tienen sobre otra sustancia. Son proteínas globulares las enzimas o catalizadores biológicos, las
inmunoglobulinas o anticuerpos, algunos tipos de hormonas o mensajeros biológicos, las proteínas de
transporte de sustancias como la hemoglobina, la mioglobina y la albúmina plasmática, y las
chaperoninas, que ayudan a las proteínas recién formadas a conseguir el plegamiento más adecuado.

PROTEINAS DEL SUERO SANGUÍNEO.

La sangre es el tejido líquido que circula dentro de los vasos sanguíneos, compuesto casi en la mitad de
su volumen por células como los glóbulos rojos o eritrocitos, glóbulos blancos o leucocitos, y plaquetas, y
por el plasma, que es la porción no celular y que es el líquido que mantiene a las células en suspensión.

Cuando la sangre se coagula, aparece un líquido remanente que se llama suero, y que se diferencia del
plasma porque ya no contiene los factores de coagulación como la proteína fibrinógeno.

Aunque el plasma sanguíneo contiene una compleja mezcla de sustancias solubilizadas, sus proteínas
representan el 75% de ellas, y una concentración que oscila entre 6 y 8 g por cada 100 mL de suero. Las
principales proteínas del suero sanguíneo son:
Albúmina: Con una concentración de 3 a 4.5 g por 100 mL de suero, y un peso molecular de 66.200
daltons, es el mayor contribuyente a la presión osmótica intravascular. Su función principal es la de
transportar ácidos grasos y medicamentos. Los ácidos grasos los llevan desde los adipocitos, donde se
generan por hidrólisis de los triacilglicéridos, hasta los tejidos que los requieren para su oxidación. Cada
molécula de albúmina puede unir hasta 10 unidades de ácidos grasos libres.

Globulinas: Es un conjunto heterogéneo de proteínas que alcanzan una concentración en la sangre entre
1.8 y 3.5 gr por 100 mL, y que a veces se designan como ,  y γ-globulinas. Entre las más importantes
están las siguientes:
 -globulinas, como gluco y lipoproteínas; estas últimas actúan como transportadores de diferentes
tipos de lípidos. La protrombina que participa en el proceso de coagulación, es una -globulina.
 -globulinas, que incluyen a la trensferrina, una proteína que transporta hierro.
 γ-globulinas, o simplemente inmunoglobulinas, que constituyen el arma eficaz del sistema
inmunitario humoral. Estas proteínas son sintetizadas en los linfocitos B, y se fijan con notable
especificidad a los sitios antigénicos en otras moléculas, con el fin de marcarlas, y luego neutralizarlas.

METODOS PARA AISLAR Y PURIFICAR PROTEINAS.

Con el fin de preparar extractos proteínicos a partir del complejo medio celular, se han desarrollado
técnicas que se fundamentan en las diferencias que presentan ellas en su tamaño, su carga, su masa, su
solubilidad y su afinidad por otras moléculas.

Electroforesis. Aprovecha el hecho de que la movilidad de una molécula en un campo eléctrico depende
de su carga y de las dimensiones moleculares. Como los macroiones (proteínas) difieren en ambos
aspectos, su comportamiento en una solución cargada proporciona un buen método para separarlos.

Centrifugación. Es una técnica que permite separa sustancias que tienen diferente masa o tamaño,
porque presentan diferente velocidad de sedimentación o precipitación cuando se someten a una fuerza
centrífuga.

Cromatografía. Se fundamenta en la absorción selectiva que presenta un medio o fase estacionaria

sobre las sustancias o solutos de una solución (fase móvil) que se desplaza a través del medio. La rapidez
con que pasa cada componente de la fase móvil es inversamente proporcional a la afinidad que tenga
con la fase estacionaria, y ello permite separar los componentes de la solución.

Diálisis y ultra filtración. Se usan membranas semipermeables para purificar y concentrar biopolímeros.
En la diálisis la membrana permite el paso de moléculas pequeñas, dejando a un lado a las
macromoléculas como las proteínas. La ultra filtración utiliza el mismo principio pero para hacer salir las
moléculas del solvente, y concentrar la solución del biopolímero.

Diferencias en solubilidad. La diferencia en solubilidad de las moléculas en varios solventes ha sido una
herramienta bien aprovechada para separarlas y cristalizarlas. En el caso de las proteínas, se han
generado grupos de clasificación teniendo en cuenta este parámetro.
En forma general se puede decir que la solubilidad de las macromoléculas cargadas varían con dos
factores: el pH del medio, y su concentración de sales.

 Efecto del pH sobre la solubilidad. Las proteínas tienden a ser solubles en medios con pHs superiores
o inferiores al punto isoeléctrico (p). Por debajo de p, las moléculas estarán cargadas positivamente;
por encima de p, las moléculas tendrán cargas negativas. En ambos casos las moléculas se repelen
entre si y permanecen en solución. En el p, las moléculas tienen una carga neta de cero, pero con
cargas positivas y negativas en sus superficies que posibilitan la atracción entre ellas. Las moléculas
tienden a aglutinarse y a precipitar.

 Efecto de la concentración salina sobre la solubilidad. Cuando una proteína se suspende en un

medio salino (NaCl, MgCl2, (NH4)2SO4), su solubilidad se ve afectada por la atmósfera que genera la sal
disuelta:

 Efecto Salting-In: La solubilidad de las proteínas aumenta, aun en el punto isoeléctrico, cuando la
concentración salina aumenta (hasta cierto punto). Ello se explica porque la mayor concentración de
iones salinos disminuye la atracción entre moléculas de carga opuesta o entre grupos positivos y
negativos de moléculas con carga neta igual a cero, debido al efecto de apantallamiento que
producen.

 Efecto Salting-Out: La solubilidad de las proteínas disminuye, cuando la concentración de las sales es
muy alta. El exceso de iones salinos desplaza a un gran número de moléculas de agua para su
hidratación, que estaban rodeando y solvatando a los macroiones proteínicos; en consecuencia éstos
se podrán acercar y precipitar.

Como las diversas proteínas responden distintamente a estos dos efectos, el manejo adecuado de ellos
permite elegir concentraciones salinas óptimas para purificar proteínas.

En esta práctica se pretende usar la técnica de la fotocolorimetría para cuantificar la concertación de

albúmina y globulinas en el suero sanguíneo. El empleo del reactivo del Biuret en soluciones con
concentraciones diferentes de proteínas, permitirá la medida de la absorbancia para cada concentración.
La determinación precisa de éstas se podrá deducir del dato de absorbancia tomado a una solución
patrón de proteína (con concentración conocida):

La ley de Beer establece que:

A   b  c

Para medidas de absorbancia en un mismo aparato y para una misma sustancia, se cumple que:
A
   b  cons tan te
c
Si se miden las absorbancias a una muestra patrón (pat) y a una muestra con concentración desconocida
(desc), se puede establecer la siguiente relación:

A desc A pat

C desc C pat

A desc
C desc  C pat  (1)
A pat

REACTIVOS Y MATERIALES.

Solución acuosa de NaCl al 0.9%, solución saturada de (NH4)2SO4 (750 g en 1 L de agua), solución patrón
de albúmina (0.45 g en 100 mL de solución salina), solución de Biuret, muestra de suero sanguíneo
humano, centrífuga, fotocolorímetro.
PROCEDIMIENTO.

1. SEPARACION DE LAS GLOBULINAS DEL SUERO.

1.1. En un tubo de centrifuga vierta 1 ml de suero sanguíneo y 4 ml de agua destilada.

1.2. Agregue lentamente con un gotero solución saturada de sulfato de amonio (NH4)2SO4 de
concentración 750 g/L y agite por inmersión hasta que se forme una solución lechosa que
corresponde a la mezcla de proteínas precipitadas (tenga en cuenta que se requiere
aproximadamente 5 ml de sulfato de amonio).

1.3. Deje reposar la solución de proteínas durante 10 minutos y luego centrifugue a 2500 rpm durante
15 minutos.

1.4. Deseche inmediatamente el líquido sobrenadante teniendo mucho cuidado de no perder el

precipitado. El precipitado obtenido se disuelve con la adición de solución de NaCl al 0.9% hasta
completar 5ml.

1.5. Rotule el tubo como “solución de globulinas”.

2. PREPARACION DE LA SOLUCION DE PROTEINAS TOTALES.

2.1. Tome 1 ml de suero sanguíneo y viértalo en una probeta de 25 ml.

2.2. Agregue solución salina (NaCl al 0.9%) hasta completar 20 ml.

2.3. Rotule la probeta como “solución de suero”.

3. MEDICION DE ABSORBANCIA DE LAS SOLUCIONES DE PROTEINA.

3.1. Tome 4 tubos de ensayo, rotúlelos como se indica en la siguiente tabla, y agrégueles lo que allí se
indica:

Solución Solución
Tubo Solución de Solución Solución
Rótulo de NaCl patrón de Abs
No. globulinas de suero de Biuret
0.9% Albúmina
1 Blanco 1.0 ml 4.0 ml
2 Patrón 1.0 ml 4.0 ml
3 Globulinas 1.0 ml 4.0 ml
 4 Prot.Total. 1.0 ml 4.0 ml

3.2. Agite suavemente cada tubo y déjelo reposar en oscuridad durante 20 minutos para que se dé la
coloración.

3.3. Seleccione en el fotocolorímetro la longitud de onda de 540 nm ( de mayor absorbancia) y llene la

celda con la solución blanco (tubo No 1) con la cual ajuste el equipo en absorbancia cero.

3.4. Mida las absorbancias para los tubos que contienen las muestras (tubos 2, 3 y 4), lavando la celda
entre cada medición con agua destilada.

3.5. Registre las absorbancias en la tabla en la columna (Abs).

4. PREPARACIÓN DE LA CURVA DE CALIBRACIÓN DE ALBÚMINA.

4.1. Marcar 7 tubos de ensayo como se indica en la tabla y se debe adicionar a cada uno de ellos las
soluciones indicadas:

Solución patrón Solución de

Tubo Solución NaCl 0.9% Concentración Absorbancia
Albúmina Biuret
Blanco 2.0 ml 4ml
1 0.3 ml 1.7 ml 4ml
2 0.5 ml 1.5 ml 4ml
3 0.7 ml 1.3 ml 4ml
4 1.0 ml 1.0 ml 4ml
5 1.2 ml 0.8 ml 4ml
6 1.5 ml 0.5 ml 4ml

4.2. Después de adicionar el reactivo de Biuret, mezcle por inmersión y deje en reposo y oscuridad
durante 20 minutos.

4.3. Seleccione en el fotocolorímetro la longitud de onda de máxima absorbancia (540 nm) y ajuste a
cero con el blanco.

4.4. Mida la absorbancia a las soluciones de los tubos 1 al 6. Anótelas cuidadosamente en la tabla.
RESULTADOS Y PREGUNTAS.

1. Consulte cual es la función del sulfato de amonio concentrado (750g/L) en el proceso de

cuantificación de globulinas (Salting out). Explique por qué esta solución solo precipita las globulinas.

2. Consulte la función del cloruro de sodio de bajas concentraciones (0.9 %) en el procedimiento de

separación de proteína total y globulinas (Salting in).

3. Calcular la concentración molar (M) de las soluciones de NaCl 750 g/L y Sulfato de amonio 750 g/L. A
partir de los valores de molaridad calcule la fuerza iónica (I) de cada una de las soluciones empleado
la siguiente fórmula:
𝑛
1
𝐼 = ∑ 𝐶𝑖 𝑍𝑖2
2
𝑖=1

Dónde Ci es la concentración molar de cada ión y Zi es su carga, desde i=1 hasta n iones.

4. Explique cómo afecta la fuerza iónica la solubilidad de las proteínas y porque preferiblemente se
emplea sulfato de amonio de alta concentración más que NaCl para precipitarlas.

5. Determine la concentración final de proteínas en %p/v de la solución patrón (Cpatrón.), teniendo en

cuenta la dilución hecha a un volumen final (V2) a 5 ml. Utilice la ecuación C1V1=C2V2.

6. Determine la concentración en %p/v de globulinas (Cglobul) y de proteínas totales (Cprot) en el suero,

empleando en cada caso la siguiente ecuación, teniendo en cuenta las absorbancias medidas (Adesc y
Apat) y la “C patrón” calculada en el punto anterior.

A desc
C desc  C pat 
A pat

7. Calcule las concentraciones originales ( C i ) de globulinas y proteínas totales en %(p/v) de la muestra

de suero sanguíneo empleando las siguientes ecuaciones.

𝐶𝑖 𝑔𝑙𝑜𝑏𝑢𝑙𝑖𝑛𝑎𝑠 = 𝐶𝑔𝑙𝑜𝑏𝑢𝑙𝑖𝑛𝑎𝑠 𝑥 5 𝑥 5
𝐶𝑖 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎𝑠 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠 = 𝐶𝑔𝑙𝑜𝑏𝑢𝑙𝑖𝑛𝑎𝑠 𝑥 20 𝑥 5
8. Determine la concentración (Ci) de albúmina en %p/v de la muestra de suero, como la diferencia
entre Ci para proteínas totales y Ci para globulinas.

𝐶𝑖 𝐴𝑙𝑏ú𝑚𝑖𝑛𝑎 = 𝐶𝑖 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎𝑠 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠 − 𝐶𝑖 𝑔𝑙𝑜𝑏𝑢𝑙𝑖𝑛𝑎𝑠

9. Registre en la siguiente tabla los datos de las concentraciones de proteína total, globulinas y albúmina
y realice con estos datos la conversión de %(p/v) a: g/dL, mg/ml, g/L y g/ml. Igualmente registre los
valores normales fisiológicos de estas proteínas en el suero sanguíneo.

Concentración proteínas del suero sanguíneo

Proteína total Globulinas Albúmina
Concentraciones obtenidas (%p/v)
g/dL
mg/ml
g/L
g/ml
Concentración fisiológica normal (%p/v)

10.Compare los porcentajes hallados para proteínas totales, albúmina y globulinas determinados con las
reportadas como normales para el suero. Si los datos que usted obtuvo no están dentro del rango
normal, de una explicación lógica de los resultados.

11.Determine la concentración de proteína de la solución patrón en cada uno de los tubos 1 al 6, de la

tabla del punto 4.1 aplicando la fórmula de dilución C1V1=C2V2. Para esto tenga en cuenta que la
concentración 1 (C1) es la concentración de la solución patrón que suministró el laboratorista y el
volumen 2 (V2) es el volumen total de cada tubo (6ml).

12.Determine las concentraciones de proteínas totales, globulinas y albúmina empleando la curva de

calibración y diga cual metodología es más acorde con los resultados, la medición por comparación
con la solución patrón o la curva de calibración. ¿en qué condiciones se podría emplear la medición
por comparación?

BIBLIOGRAFIA.

MARTIN, D. W. y otros. Bioquímica de Harper. Editorial El Manual Moderno. 1982

LENHINGER, A. L. Bioquímica. Editorial Omega, S. A. Barcelona. 1991

MATHEWS, C. K. y otros. Bioquímica. Addison Wesley. Madrid. 2002

Documento recopilado y organizado por Profesores y monitores de la Escuela de Química