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IJMCM Artículo original

Primavera de 2013, volumen 2, n.º 6

Detección de actinomicetos productores de antibacterianos de

Sedimentos del Mar Caspio

Mojtaba Mohseni1 , Hamed Norouzi1 , Javad Hamedi2 , Abulghasem Roohi3

1. Departamento de Biología Molecular y Celular, Universidad de Mazandaran, Babolsar, Irán.

2. Departamento de Microbiología, Universidad de Teherán, Teherán, Irán.

3. Instituto de Investigaciones Ecológicas del Mar Caspio, Sari, Irán.

Presentado el 30 de abril de 2013; Aceptado el 7 de mayo de 2013

Los actinomicetos son interesantes como principal productor de metabolitos secundarios y antibióticos industriales de ambientes marinos. Se

aislaron un total de 44 cepas de actinomicetos de sedimentos del mar Caspio a una profundidad de 5 a 10 m. La detección preliminar se

realizó mediante el método de rayas cruzadas contra 2 bacterias patógenas grampositivas y 4 gramnegativas. Para extraer las sustancias

antibacterianas se utilizaron las cepas más potentes MN2, MN3, MN38, MN39, MN40, MN41 y MN44. Las actividades antibacterianas se

realizaron utilizando el método de difusión en disco de Kirby­Bauer. Se examinaron actinomicetos potentes para detectar actividades

exoenzimáticas hidrolíticas (amilasa y proteasa). Los 24 aislamientos fueron activos contra al menos uno de los organismos de prueba. La

cepa MN38 mostró actividad contra Staphylococcus aureus (20,0±0,5 mm), Bacillus subtilis (27,0±0,2 mm) y Escherichia coli (20,0±0,3 mm).

La cepa MN39 también fue activa contra E. coli (23,0 ± 0,4 mm), B. subtilis (23,0 ± 0,2 mm), Klebsiella pneumonia (24 ± 0,1 mm), mientras

que la cepa MN3 mostró actividad contra Pseudomonas aeruginosa .

(20,0 ± 0,2 mm). Los resultados de esta investigación revelaron que los actinomicetos marinos de los sedimentos del Mar Caspio eran una

potente fuente de nuevos antibióticos y compuestos bioactivos.

Palabras clave: actinomicetos marinos, actividad antimicrobiana, mar Caspio.

A Los ctinomicetos son saprofitos, de vida libre.

bacterias filamentosas y una fuente importante para la

producción de antibióticos (1). Se encuentran en

metabolitos secundarios, como antibióticos, agentes antitumorales,

agentes inmunosupresores,

cosméticos, vitaminas, nutricional materiales,

ambientes de suelo, agua dulce y agua marina herbicidas, pesticidas, agentes antiparasitarios y enzimas (1, 4,

(2). Los actinomicetos proporcionaron muchos compuestos 5). Se han informado alrededor de 23.000 metabolitos secundarios

bioactivos importantes de alto valor comercial y se analizaron en bioactivos producidos por microorganismos. Más de 10.000 de

busca de nuevas sustancias bioactivas (3). Estas bacterias son estos compuestos son producidos por actinomicetos, lo que

un grupo importante de microorganismos debido a su capacidad representa el 45% de todos los microbios bioactivos.

para producir una amplia gama de

Autor correspondiente: Departamento de Biología Molecular y Celular, Universidad de Mazandaran, Babolsar, Irán.
Correo electrónico: M.Mohseni@umz.ac.ir.
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Se descubre la detección de metabolitos de actinomicetos

productores de antibacterianos . Entre los actinomicetos, las Materiales y métodos

especies de Streptomyces producen alrededor de 7600 Recogida de muestras

compuestos (6). A medida que disminuía la frecuencia de nuevos Se recogieron muestras de los sedimentos del Mar

compuestos bioactivos obtenidos de actinomicetos terrestres, se Caspio a profundidades de 5 a 10 m mediante cuchara de veta

había hecho hincapié en que los actinomicetos de sedimentos Van (0,2 m2 ). Se ubicaron dos estaciones de muestreo a lo largo

marinos podrían ser del Mar Caspio con las siguientes

valioso para el aislamiento de nuevas cepas que latitudes 36°43'N y 36°44'N. La superficie de cada

potencialmente podría producir un amplio espectro de metabolitos La muestra al azar se recogió asépticamente y se procesó en 30

secundarios (7­9). Sin embargo, se ha resuelto si los actinomicetos minutos.

forman parte de la comunidad microbiana marina de muestras de Tratamiento de muestra

sedimentos originados en ambientes terrestres y simplemente Las muestras fueron sometidas a un método de

fueron llevados al mar en forma de esporas resistentes (10). pretratamiento físico para facilitar el aislamiento de actinomicetos.

Los tratamientos térmicos se realizaron manteniendo las muestras

de sedimento en un baño de agua (Memmert) a 50 °C durante 60

Se ha informado que la actino­marina minutos. Todas las muestras se diluyeron con solución salina

Los micetos no sólo tienen varias especies nuevas, sino también estéril al 0,9 % antes de la inoculación por triplicado en placas de

tienen muchas estructuras novedosas con potentes bioactividades aislamiento (11).

(11). Se descubrieron varios compuestos bioactivos novedosos a Aislamiento de actinomicetos Los

partir de actinomicetos acuáticos, por ejemplo, la rifamicina de actinomicetos se aislaron mediante el método de dilución

Micromonospora sp. (12); salinosporamida­A, un metabolito en serie a partir de sedimentos (17). La solución madre se

anticancerígeno de Salinispora sp. (13) preparó diluyendo 1 g de sedimento en 9 ml de agua salina estéril

y agitando bien usando un mezclador vórtex (IKA). De la solución

(Feling, 2003); marinomicinas de Marinophilus madre, se utilizó 1 ml para preparar el volumen final.

sp. (14); abisomicina­C de Verrucosispora sp. y marinopirroles

de Streptomyces sp. (12, 15). de 10­2 y 103 por método de dilución en serie. Las muestras se

La aparición de cepas patógenas resistentes a múltiples fármacos inocularon en Agar Almidón Caseína (SCA) (composición:

causó una morbilidad y mortalidad sustanciales, especialmente almidón soluble: 10 g, K2HPO4: 2 g, KNO3: 2 g, caseína: 0,3 g,

entre los ancianos y los pacientes inmunocomprometidos. Para MgSO4.7H2O: 0,05 g, CaCO3: 0,02 g, FeSO4.7H2O: 0,01 g,

superar esta situación, existe el interés de mejorar o descubrir agar: 15 g, agua de mar filtrada: 1000 ml y pH: 7,0±0,1), Levadura

nuevas clases.
antibióticos que tienen diferentes mecanismos de acción Extracto de Agar Extracto de Malta (ISP2) (Composición: extracto

en todo el mundo (16). de levadura: 4 g, extracto de malta: 10 g, dextrosa: 4 g, agar: 15

Según estadísticas incompletas, el número de nuevos g, agua de mar filtrada: 1000 ml y pH: 7,3) y Agar de Kuster

compuestos obtenidos a partir de actinomicetos marinos en el (composición: glicerol : 10 g, caseína: 0,3 g, KNO3: 2 g, K2HPO4:

siglo XXI es más del doble que en el siglo pasado. Este estudio 2 g, almidón soluble: 0,5 g, asparagina: 0,1 g, FeSO4.7H2O: 0,01

se centró en los actinomicetos de sedimentos marinos g, CaCO3: 0,02 g, MgSO4.7H2O: 0,05 g, agar : 15 g, agua de

recolectados en el Mar Caspio. Por primera vez se hizo un mar filtrada: 1000 ml y pH: 7,0±0,1). Cada medio se complementó

esfuerzo con 25 µg ml­1 de nistatina para minimizar la contaminación con

hecho para cribar diferentes sedimentos marinos que hongos y 10 µg ml­1 de ácido nalidíxico para minimizar el

son un gran ecosistema diverso y no analizado para el aislamiento crecimiento de contaminantes (11, 18). Las placas se incubaron

de potentes actinoproductores de antibióticos. durante 7 a 20 días a

micetos.

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Mohseni M et al.

28 ºC. Luego se subcultivaron en SCA inclinadas las colonias utilizando el método de difusión en disco de agar descrito

con textura dura o polvorienta, apariencia seca o plegada y por Kirby­Bauer con modificación (20).

filamentos ramificados con o sin micelio aéreo (19). Hasta La fase exponencial tardía de las bacterias de

su uso posterior, el prueba se preparó inoculando el 1% (v/v) de los cultivos en

Las inclinaciones se mantuvieron en una cámara fría a 4 °C (6). caldo Muller­Hinton fresco (Merck).

Detección preliminar de actividad antibacteriana mediante el e incubar en un agitador orbital a 37 °C y 100 rpm durante la

método de rayas cruzadas noche. Antes de utilizar los cultivos, se estandarizaron con
Las cepas aisladas MN1 a MN44 fueron una densidad celular final de aproximadamente 108 ufc ml­1.

inoculados en placas de agar nutritivo mediante una raya en Se preparó agar Muller­Hinton (Merck) y se inoculó a partir

el centro. Las placas se incubaron a 28 °C durante 3 días. de los cultivos estandarizados de los organismos de prueba

Seis bacterias, incluido Staphylococcus aureus y luego se esparcieron lo más uniformemente posible por
ATCC 25923, Bacillus subtilis PTCC 1156, todo el medio. Se impregnaron discos de papel estériles (6
Escherichia coli PTCC 1533, Pseudomonas mm de diámetro, Padtan, Irán) con 30 µl de los extractos y

aeruginosa PTCC 1074, Salmonella typhi PTCC 1609 y luego se dejaron secar. El disco impregnado se introdujo

Klebsiella pneumoniae se utilizaron como organismos de sobre la capa superior de la placa de agar sembrada y se

prueba. Se utilizó una colonia pura de bacterias de prueba. incubó a 37 °C durante 24 horas.
transferido a caldo nutritivo fresco e incubado

a 37 °C durante 24 horas hasta que la turbidez visible y la Las actividades antibacterianas de los extractos.

densidad sean iguales a las de 0,5 McFarland. Después de se compararon con el antibiótico conocido tetraciclina (30 µg/

ajustar la turbidez, se sumergió un hisopo de algodón estéril disco) como control positivo y acetato de etilo (30 µl/disco)

en la suspensión bacteriana y se extendió perpendicularmente como control negativo. La actividad antibacteriana se evaluó

al antagonista en el medio de agar. midiendo el diámetro de

Las placas se incubaron a 37°C durante 24 horas. zona de inhibición (mm) en la superficie de las placas y los

Las inhibiciones microbianas se observaron determinando el resultados se informaron como Media ± DE después de tres

diámetro de las zonas de inhibición. repeticiones (21). Los posibles aislados de actinomicetos se

Extracción de compuestos antimicrobianos. seleccionaron a partir del cribado primario y secundario y

Los actinomicetos antagonistas seleccionados fueron luego se caracterizaron mediante métodos morfológicos y

inoculado en 100 ml de caldo de aislamiento de actinomicetos fisiológicos para estudios posteriores.

(composición: glicerol: 5,0 g, propionato de sodio: 4,0 Ensayo exoenzimático

g, caseinato de sodio: 2,0 g, K2HPO4: 0,5 g, asparagina: Los posibles aislados de actinomicetos se analizaron

0,1 g, MgSO4·7H2O: 0,1 g, FeSO4·7H2O: 1,0 mg, en busca de actividades exoenzimáticas hidrolíticas, incluidas

agua: 1000 ml y pH: 8,0±0,1) y se incuba en amilasa y proteasa. Estas pruebas se realizaron en agar

Agitador orbital a 28 °C y 190 rpm durante 7 días. A extracto de malta con extracto de levadura (ISP2) que

extraer los compuestos antimicrobianos, los cultivos fueron contenía 1% de almidón soluble para actividad amilolítica y

Se filtró y luego se centrifugó (Sigma) a 6000 rpm, 10 1% de leche desnatada para actividad proteolítica. La

minutos (1). El sobrenadante fue transferido presencia de amilasa se visualizó mediante

asépticamente en un frasco con tapa de rosca y almacenado a 4 Halo decolorado alrededor del cultivo debido al almidón.

°C para realizar más ensayos. digestión. Se observó actividad proteolítica al aclarar la leche

Detección secundaria de actividad antibacteriana mediante alrededor de la colonia (6).

el método de difusión en disco.

Las actividades antimicrobianas de esos extractos. Resultados

fueron probados contra diferentes organismos de prueba por Las colonias de actinomicetos se aislaron fácilmente

Int J Mo1 Cell Med primavera de 2013; Volumen 2 N° 6 66

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Detección de actinomicetos productores de antibacterianos.

de sedimentos marinos en SCA e ISP 2, pero el fueron sometidos a un cribado secundario mediante métodos

El crecimiento en agar de Kuster fue muy pobre. La apariencia de difusión en disco (Fig. 2). Los resultados demostraron que

macroscópica de los aislados mostró colonias coriáceas y entre las bacterias analizadas, los extractos crudos exhibieron

polvorientas en Agar Almidón Caseína (SCA) (Fig. 1). Se la mayor actividad antibacteriana contra B. subtilis y S. aureus

aislaron un total de 44 actinomicetos de los sedimentos del Mar (Tabla 3). Los valores obtenidos para la actividad de las cepas

Caspio. MN38 y MN39 muestran una gran actividad contra todas las

Entre los actinomicetos aislados, 24 cepas mostraron actividad bacterias de prueba, mientras que el inhibidor del crecimiento

antibacteriana contra al menos una de las bacterias analizadas del extracto crudo de la cepa MN3 mostró una baja actividad

mediante un cribado preliminar. contra K. pneumonia (Tabla 3). Los resultados revelaron que
Los resultados se resumieron en la tabla 1. De todos los MN44, MN38 y MN39 fueron activos contra S. aureus; MN41,

24 aislados, siete mejores actinomicetos antagonistas MN38 contra E. coli; MN2, MN3 y MN44 contra P. aeruginosa;
Los aislados fueron seleccionados para estudios posteriores. El MN2, MN39, MN40 y MN44 contra K. pneumonia; MN38, MN39

los aislamientos potenciales son MN2, MN3, MN38, MN39, y MN44 contra B. subtilis; MN40 y MN44 contra S. typhi.

MN40, MN41 y MN44. lo morfologico Fisiológico y

Las características de los aislamientos seleccionados se muestran en

tabla 2. Las cepas fueron grampositivas, filamentosas con

cadena de esporas larga excepto la MN39 que produjo una Las características bioquímicas indican que todos

sola espora. Para actividades antibacterianas. Los aislados mostraron capacidad de hidrólisis de almidón y

ensayo, los extractos crudos de los aislados potenciales proteínas.

Fig 1. Aspecto morfológico de los aislados MN38 (A) y MN39 (B) en Agar Almidón Caseína.

Fig 2. Actividades antibacterianas del extracto crudo de los aislados MN38 (3) y MN44 (4) contra S. aureus (A) y B. subtilis (B) utilizando el método
de difusión en disco.

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Mohseni M et al.

Tabla 1. Detección preliminar de actinomicetos para detectar actividad antimicrobiana mediante el método de rayas cruzadas.

Bacterias de prueba

Aisla E. coli B. subtilis K. neumonía S. aureus S. typhi P. aeruginos

MN1 ­ + ­ + ­ +
MN2 + + + + + +
MN3 + + + + + +
MN6 ­ + ­ + ­ +
MN8 + ­ ­ + ­ +
MN13 ­ + ­ + ­ +
MN16 ­ + ­ + ­ +
MN17 + + ­ + ­ ­

MN18 ­ + ­ + ­ +
MN19 ­ + ­ + ­ +
MN21 ­ + ­ + ­ +
MN23 ­ + ­ + ­ +
MN27 ­ + ­ + ­ +
MN30 + + ­ ­ ­ +
MN31 ­ + ­ + ­ +
MN32 ­ + ­ + ­ ­

MN33 + + ­ + ­ +
MN35 ­ + ­ + ­ +
MN36 ­ + ­ + ­ +
MN38 + + + + + +
MN39 + + + + + +
MN40 + + + + + +
MN41 + + + + + +
MN44 + + + + + +

Tabla 2. Características morfológicas y fisiológicas de aislados de actinomicetos potentes.

Aisla
características
MN2 MN3 MN38 MN39 MN40 MN41 MN44

micelio aéreo Verde Gris Gris Blanco Gris Blanco Blanco

Amarillo­ Amarillo­ Amarillo­ Amarillo­

Amarillo­ Amarillo­ Amarillo­
Color inverso marrón­ marrón­ marrón­ marrón­
marrón marrón marrón
naranja verde verde rojo

Hifas portadoras Verticilado Simple Simple Simple Simple Verticilado Simple

de esporas (VM) (R) (F) (REAL ACADEMIA DE BELLAS ARTES) (R) (BIV) (R)

hidrólisis del almidón + + + + + + +

hidrólisis de caseína + + + + + + +

(MV):Monoverticillus, (R): Recto ­ Rectus, (F): Flexibilis, (RA): Retinaculum­Apertum, (BIV): Biverticillus­: Negativo; +: Positivo.

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Detección de actinomicetos productores de antibacterianos.

Tabla 3. Actividad antibacteriana de los posibles aislados de actinomicetos utilizando el método de difusión en disco de Kirby­Bauer.

Zona de inhibición del crecimiento (mm)

Cepa de prueba
MN2 MN3 MN38 MN39 MN40 MN44 MN41 Tet.

E. coli 13,0±1,4 17,0±0,7 11,0±1,4 23,5±0,7 14,0±1,4 13,0±1,1 20,7±1,5 18,6±1,1

P. aeruginosa 18,0±0,7 20,0±0,7 15,5±0,7 11,0±1,4 12,5±0,7 18,0±0,5 10,0±1,5 NE

S. aureus 10,5±0,7 13,0±1,4 20,0±0,4 20,5±0,7 12,5±0,7 20,3±1,5 12,0±0,4 24,0±1,0

B. subtilis 12,0±0,5 11 0±0,6 27,0 ±0,7 23,0±1,4 13,0±0,7 22,0±1,7 13,0±1,4 23,6±0,6

S. typhi 14,0±1,4 14,0±1,4 16,0±1,4 16,0±1,4 18,0±1,4 20,0±1,4 11,0±1,7 19,3±0,6

K. neumonía 17,0±0,4 7,0±1,4 15,0±1,4 24,0±1,4 17,0±1,4 18,0±1,4 10,0±1,4 14,3±0,6

Tet.: Tetraciclina (30 µg/disco) NE: Sin efecto

Discusión El método fue realizado previamente por Sambamurthy y

Actualmente, la incidencia de organismos Ellaiah (1974) que utilizaron anfotericina B como agente

multirresistentes está aumentando y comprometiendo el antifúngico (23). La producción de antibióticos.

tratamiento de un número creciente de enfermedades La sustancia depende del agua de mar (24). También en este

infecciosas. Como resultado, existe una necesidad urgente de estudio se prepararon agar SCA, ISP 2 y Kuster utilizando

desarrollar nuevos fármacos que sean eficaces contra los agua de mar estéril. Okazaki y Okami (1972) observaron que

patógenos actuales resistentes a los antibióticos. Se ha las especies de Streptomyces mostraban una actividad

demostrado que los actinomicetos son una fuente potencial de antagonista eficaz (25). Holt y col. (1994) identificaron los

compuestos bioactivos y la fuente más rica de metabolitos actinomicetos aislados basándose en la morfología de la

secundarios (22). El aislamiento de compuestos antibacterianos colonia y la tinción de Gram (26). Hemos identificado los

del agua dulce. actinomicetos por la presencia de colonias en polvo en la

El entorno es de interés para aislar nuevos bioactivos. superficie de la placa de agar. Los actinomicetos son

actinomicetos. Los actinomicetos forman el 10% del total de grampositivos y de naturaleza filamentosa. Kokare et al. (2004)

bacterias que colonizan los agregados marinos. Marina han señalado la naturaleza filamentosa de los actinomicetos

El hábitat ha demostrado ser un recurso excepcional y grampositivos (27). Durante la selección de los nuevos

fascinante para innovar con microorganismos productores de metabolitos secundarios, a menudo se encontraron

bioactivos nuevos y potentes. Sólo se dispone de muy pocos actinomicetos aislados que mostraban más actividad contra

informes sobre la aparición y distribución de actinomicetos las bacterias grampositivas que contra las gramnegativas. Esto

antagonistas en el medio marino. Investigaciones recientes fue similar a los hallazgos

indican el tremendo potencial de los actinomicetos marinos,

particularmente las especies de Streptomyces , como un de otro estudio (27). Se ha descubierto que los actinomicetos

recurso útil y de estuario, que en gran medida permanecieron ignorados,

fuente sostenible de nuevos bioactivos naturales muestran actividades antibacterianas prometedoras (28, 29).

productos (1). El presente estudio tuvo como objetivo aislar En el presente estudio, se aislaron 44 actinomicetos de

actinomicetos del ambiente marino y detectar su producción sedimentos y 24 mostraron un amplio rango de zona de

de metabolitos secundarios. inhibición en el cribado primario. Se produjo un mayor

El medio se complementó con nistatina para eliminar la rendimiento de extracto bruto con disolventes de acetato de

contaminación fúngica. Lo mismo etilo. La razón del aumento del rendimiento.

69 Int J Mol Cell Med primavera de 2013; Volumen 2 N° 6

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Mohseni M et al.

se debió a la falta de agua y a la completa miscibilidad 9. Maskey RP, Grun­Wollny I, Laatsch H. Aislamiento, estructura

en disolventes orgánicos (acetato de etilo) del dilucidación y actividad biológica de 8­O­metilaverufina y

sobrenadante de crecimiento. Por lo tanto, los resultados 1,8­O­dimetilaverantina como nuevos agentes antifúngicos de

de esta investigación revelaron que los actinomicetos Penicillium chrysogenum. J Antibiot 2003;56:459­63.

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71 Int J Mol Cell Med primavera de 2013; Volumen 2 N° 6